Трехмерные воспалительных тканей человека эквиваленты десны

Цель Протокола заключается в создании модели воспалительных человеческой десны в пробирке. Эта модель ткани совместно культивируют три типа клеток человека, HaCaT кератиноцитов, десневые фибробластов и THP-1 макрофагов, трехмерные условиях. Эта модель может применяться для расследования периодонтальных заболеваний, таких как гингивит и пародонтит.

Болезни пародонта (таких как гингивит и пародонтит) являются ведущими причинами потери зубов у взрослых. Воспаление десен является основополагающим физиопатологические заболеваний пародонта. Текущие экспериментальные модели заболеваний пародонта были установлены в различных видов животных. Однако физиопатологические животных моделей отличается от людей, что делает его трудным для молекулярных и клеточных механизмов анализа и оценки новых лекарств для заболеваний пародонта. Здесь мы представляем подробный протокол для реконструкции воспалительных тканей человека эквиваленты десны (iGTE) в пробирке. Мы сначала построить эквиваленты человеческих тканей десны (ГТД), используя два типа клеток человека, включая десневой фибробластов (HGF) и эпидермальных кератиноцитов человеческой кожи (HaCaT), трехмерные условиях. Мы создаем модель раны с помощью ткани дырокол пробивать отверстие в GTE. Далее, человека THP-1 моноцитов, смешанного с коллагеном гель вводят в отверстие в GTE. По adimistration 10 нг/мл phorbol 12-миристат 13-ацетата (PMA) за 72 ч, THP-1 клетки дифференцированной в макрофагов в форме воспалительных очагов в GTE (iGTE) (IGTE также может быть stumilated с 2 мкг/мл липополисахаридов (LPS) для 48 h инициировать воспаление ). IGTE-первый в vitro модель воспалительных десны с использованием клеток человека с трехмерной архитектурой. IGTE отражает основные патологические изменения (immunocytes деятельность, внутриклеточных взаимодействий между fibryoblasts, эпителиальные клетки, моноциты и макрофаги) в заболеваний пародонта. GTE, раненых GTE и iGTE могут использоваться в качестве универсальных инструментов для изучения заживление ран, регенерации тканей, воспаление, ячейке взаимодействия и экран потенциальных лекарственных средств для заболеваний пародонта.

Болезни пародонта являются основной причиной потери зубов у взрослых. Гингивит и пародонтит являются наиболее распространенных заболеваний пародонта. Оба представляют биопленки опосредованной острые или хронические воспалительные изменения в десны. Гингивит характеризуется острого воспаления, тогда как периодонтит обычно представляет как хроническое воспаление. На уровне гистологические бактериальных компоненты запуска активации иммунных клеток, таких как макрофагов, лимфоцитов, плазматические клетки и тучные клетки^1,2. Эти клетки иммунной системы, особенно макрофаги, взаимодействуют с местными клеток (включая десневой эпителиальных клеток, фибробластов, эндотелиальных клеток и остеобласты) результате воспалительных поражений тканей пародонта^3,4. Были созданы экспериментальные модели заболеваний пародонта в различных видов животных, таких как крысы, хомячки, кролики, хорьки, клыки и приматов. Однако физиопатологические животных моделей отличается от людей, что делает его трудным для молекулярных и клеточных механизмов анализа и оценки новых лекарств заболеваний пародонта⁵. Совместное выращивание периодонтальной бактерий и монослоя человека устной эпителиальных клеток был использован для изучения механизма пародонта инфекции⁶. Тем не менее однослойная культур устные клеток не хватает трехмерной (3D) сотовой архитектуры неповрежденной ткани; Таким образом они не могут имитировать ситуации в пробирке .

Здесь 3D воспалительных тканей человека эквиваленты десны (iGTE) созданы для представления заболеваний пародонта в пробирке. Эта 3D модель заболеваний пародонта занимает промежуточное положение между монослоя клеточных культур и животных моделей. Три типа клеток человека, включая HaCaT кератиноцитов, десневые фибробластов и THP-1 макрофаги, совместно культивируемых на гель коллагена и стимулируется воспалительных инициаторов построить iGTE. IGTE тесно имитирует условия в vivo дифференцировки клеток, клеток взаимодействия и активация макрофагов в десны. Эта модель имеет множество возможных применений для наркотиков скрининг и тестирование новых фармакологических подходов в заболеваниях пародонта, а также для анализа молекулярных и клеточных механизмов в заживление ран, воспаления и регенерации тканей.

Этот протокол предназначен для создания человека десневой ткани эквиваленты, гингивального заживления и гингивит моделей. Кожа человека эпидермальных кератиноцитов (HaCaT) были любезно предоставил от профессор Норберт Fusenig E. Deutsches Krebsforschungszentrum (Хайдельберг, Германия)⁷. Десневой фибробластов (HGFs) были изолированы от десневой ткани согласно ранее опубликованные протоколы⁸. Информированное согласие было получено заранее, и исследования был утвержден в соответствии с руководящими принципами, установленными Комитетом по вопросам этики, Nippon стоматологический университет Школа жизни стоматологии в Токио (номер авторизации: НДУ-T2012-35). Протокол шаги 1-3 должны выполняться в капот культуры клеток.

1. Подготовка эквиваленты 3D человеческих тканей десны (ГТЭ) (рис. 1A)

1. Mix коллаген типа-А гель с 10% сосредоточены MEM-альфа и 10% восстановления буфера (2,2 g NaHCO₃ и 4.47 g HEPES в 100 мл 0,05 N NaOH) в 15 мл стерильной пробирке, закупорить. Держите смешанных коллагена раствор на льду до тех пор, пока используется.
2. Место вставки 24-ну культуры (поры размер 3,0 мкм) в 24-ну плиту.
3. Удаление HGFs из культуры поверхности с помощью 0,25% раствор трипсина ЭДТА. Приостановить клетки в 10 мл питательной среды A (MEM-Альфа + 20% FBS + 1% GlutaMAX). Подсчет ячеек с счетчик клеток Bürker-Тюрк.
   1. Извлечь желаемое количество клеток (1-5 x10⁵ клеток/мл), а затем центрифуги для 4 мин на 190 x g.
   2. Приостановите клетки в смешанной коллагена раствор. Оставьте смесь на льду до следующего шага.
4. Добавьте 0,5 мл смеси клетки коллаген (0,5 – 2,5 x 10⁵ клеток/а) в культуре вставляют без каких-либо пузырей. Инкубируйте смесь для 10 – 30 мин в атмосфере увлажненный с 5% CO₂ при 37 ° C для коагуляции смесь в гель.
   Примечание: Добавьте смесь коллагена в центр культуры Вставка, чтобы избежать неравные формирования коллагена геля.
5. Добавьте 1 мл питательной среды в колодец и 0,5 мл в insert. Инкубировать культуры пластина для 24 час или ночь в атмосфере увлажненный с 5% CO₂ при 37 ° C.
6. Удалите HaCaT клетки с поверхности культуры, 0,25% раствором трипсина ЭДТА. Приостановить клетки в 10 мл среды B (DMEM + 10% FBS + 1% GlutaMAX) и подсчитать количество ячеек. Экстракт необходимое количество клеток (1 – 5 x 10⁵ клеток/мл) с пипеткой, центрифуги для 4 мин на 190 x g. приостановить клетки в средних б.
7. Удалите носитель из культуры вставок, которые содержат HGF-коллаген смесь, стремлением. Добавьте 0,5 мл суспензии клеток HaCaT (0,5 – 2,5 x 10⁵ клеток/хорошо) на вершине HGF-коллаген смесь. Инкубируйте культур для 24 h или на ночь.
   Примечание: В этот момент времени, среднего в культуре также должно быть среднего A, в то время как среднего в культуре вставки должен быть средний б.
8. Замените KSR среднего (сопредседатель культуры среднего) питательной среды (MEM-альфа + 15% нокаутом сыворотки замена + 1% GlutaMAX) + 5% FBS. Добавьте 1 мл питательной среды в культуру, хорошо и 0,5 мл в культуре вставки. Инкубируйте культур за 24-48 ч.
9. Заменить питательной среды KSR средний + 1% FBS. Добавьте 1 мл в культуру хорошо и 0,5 мл в культуре вставки. Инкубируйте культур для 24 h или на ночь.
10. Заменить питательной среды в культуре с 0,7-1 мл KSR среднего. Полностью удалите носитель из вставки культура (культура поверхности должны подвергаться воздействию воздуха). Инкубируйте культур для 1 – 2 недели. Изменение среднего в культуре также два раза в неделю.
    Примечание: Не позволяйте среднего уровня подняться выше поверхности культуры (верхний слой состоит из кератиноцитов). Всегда держите культуры поверхность сухой.

2. Подготовка раненых GTE (рис. 1B)

1. Подготовьте панчер ткани диаметром 1-3 мм. Стерилизуйте его с автоклаве при температуре 121 ° C 20 мин.
2. Вставьте ткани панчер перпендикулярно в GTE о 300 мкм глубокой и пробить дыру в ткани, чтобы имитировать рану.
3. На этом шаге используйте раненых GTE для расследования рану заживления и регенерации тканей. Кроме того исправьте ГТД с использованием 10% формалине нейтрального буферного раствора для выполнения гистологический анализ.

3. Подготовка воспалительных GTE (iGTE) (рис. 1B)

1. Культивируйте клетки THP-1 по данным предыдущего доклада⁹.
2. Mix коллаген типа-А гель с 10% сосредоточены RPMI 1640, 10% восстановления буфера (2,2 g NaHCO₃ и 4.47 g HEPES в 100 мл 0,05 N NaOH) и 10 нг/мл PMA. Держите смешанных коллагена раствор на льду до использования.
3. Фото 1 – 2 х 10⁶ THP-1 клетки и центрифуги для 4 мин на 190 x g. приостановить клеток в 1 мл раствора смешанного коллагена. Оставьте смесь на льду до следующего шага.
4. Добавьте 10 – 30 мкл THP-1-коллаген смесь в область раненых ГТД. Заменить питательной среды на 0,7-1 мл KSR носитель, содержащий 10 нг/мл PMA.
5. Инкубируйте смесь в атмосфере увлажненный с 5% CO₂ при 37 ° C за 72 ч.
6. Использовать модель для изучения гингивита и периодонтита (например, добавить потенциальных противовоспалительные медицины в iGTE, чтобы увидеть его влияние на cytokine выпуске¹⁰). Можно также опустить 72 h PMA-лечение, добавить 2 мкг/мл LPS в культуру и инкубировать ткани в атмосфере увлажненный с 5% CO₂ при 37 ° C для 48 h^11,12.

4. Фиксация и весь Маунт иммуноокрашивания GTE и iGTE культур

1. Фиксация культур.
   1. Удалите средство культуры с 24-ну пластины. Вымойте тканей 2 раза с-фосфатный буфер (PBS).
   2. Хорошо добавьте 1 мл нейтрального буферного раствора формалина 10% для вставки и 1 мл в культуре. Оставьте 24-ну пластины в холодильнике при температуре 4 ° C на ночь.
   3. Удалите следующий день нейтрального буферного раствора формалина 10%.
   4. Для всей горе иммуноокрашивания мыть ткани 3 - 4 раза с PBS после фиксации.
   5. Гематоксилином и эозином (H & E) и регулярные иммуноокрашивания приступайте к дегидратации, внедрение парафин и секционирование.
      Примечание: Для вся гора иммуноокрашивания, этот шаг может быть опущен.
2. Вся гора иммуноокрашивания
   Примечание: Этот протокол был изменен от того, в справочнике 13.
   1. Вымойте тканей 3 x в PBS 0,5 – 1% Тритон, 10 – 30 минут каждый раз.
   2. Инкубировать тканей дважды на 30 мин в блокирующем буфере (PBS 1% тритон + 10% BSA), при комнатной температуре.
   3. Вымойте тканей 2 × в блокирующем буфере, 5-10 минут каждый раз.
   4. Добавьте 50 мкл раствора первичного антитела в требуемой концентрации разбавления/вставки. Используйте тонкий пластиковый цепляться пленки обернуть вставки, чтобы избежать высыхания ткани.
   5. Инкубировать ткани для 1-2 дней при 4 ° C.
   6. Вымойте тканей 3 раза, за 30 мин в PBS 1% тритон + 10% BSA. Мойте снова 3 раза, за 5 мин в PBS 1% тритон.
   7. Добавьте 50 мкл вторичного антитела в блокирующем буфере (PBS 1% тритон + 10% BSA) и 5 мкл раствора Hoechst 33342 (клетки живут NucBlue пятно) для каждой вставки. Используйте тонкий пластиковый цепляться пленки обернуть вставки, чтобы избежать высыхания ткани.
   8. Инкубировать в течение 1-2 дней при 4 ° C. Оберните 24-ну пластины влажной салфеткой, а затем положить его в пластиковый пакет, чтобы использоваться на протяжении всего инкубационного.
   9. Вымойте тканей 3 раза, для 10 минут в PBS 1% тритон
   10. Используйте острые иглы вырезать мембраны культуры вставка для получения ткани. Место мембраны на слайд.
       Примечание: Ткани должна быть на мембране.
   11. Добавьте 2-3 капли флуоресценции горе среды. Покрытие ткани с покровным стеклом и хранить при 4 ° C в темноте до анализа.
   12. Просмотр тканей с Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (МИС).

HaCaT ячеек типичные кератиноцитов морфология при фазово контрастной микроскопические наблюдения (рис. 2A). Сканер электрона микроскопических изображений (SEM) показал, что HaCaT клеток поверхности были охвачены многие микроворсинки. Межклеточные соединения между HaCaT клетки были опосредовано мембранных процессов (рис. 2B). HaCaT клетки выразил десневой эпителия маркер K8/18¹⁴, указав, что клетки HaCaT подходят для реконструкции десны (рис. 2 c).

На рисунке 3A показывает успешный пример ГТД, и рисунок 3B показывает пример неудачного ГТД. Неудачной суда (рис. 3B) вызвано смесь гель коллагена, не добавляются в центре культуры вставки. Рисунок 3 c показал, что раны модель GTE может быть произведена пробивая отверстия в ткани с ткани панчер. H & E окрашивание (рис. 3D) и SEM изображения (Рисунок 3E) показали, что на 19 дней культивирования, примерно 10 – 20 слоев HaCaT клетки эпителия формы, и коллаген гель встроенный HGF клетки формы lamina propria. В lamina propria реконструированный GTE клетки HGF выставлены характерные морфология фибробластов (Рисунок 3F) и были окружены четко массивы волокон коллагена (Рисунок 3 g). Пятнать иммунофлюоресценции показал, что виментин и TE-7 (оба из них являются фибробластов дермы маркеры¹⁵) выражаются в lamina propria ГТД (Рисунок 4A и 4B). K19, конкретные маркер для соединительной и карманные эпителия в пародонтит¹⁶, слабо выражена в эпителии ГТД (рис. 4 c) и решительно выражается в эпителии iGTE (рис. 4 d). Данные предложили, что HaCaT клетки могут дифференцироваться в ключевых эпителиальных клеток в пародонтит, особенно после воспалительных стимуляции lamina propria.

Воспалительные заболевания десен, таких как гингивит и пародонтит, гистологически характеризуется наличием лимфоцитов и макрофагов и привести к^17,некроза тканей и фиброз¹⁸. В этом протоколе клетки THP-1 использовались как воспалительные клетки для iGTE. Как показано на рисунке 5, без PMA-стимуляции, THP-1 клетки представил monocytic морфологии и большинство из них плыли в среде (Рисунок 5A). Напротив после подвергается PMA 10 нг/мл за 72 ч, более чем 50% клеток THP-1 дифференцированные в клетки макрофагального как и соблюдаться на поверхность культуры (Рисунок 5B). Подобно HaCaT и HGF клетки⁸, THP-1 клетки выросли внутри гель коллагена в совместное питательной среды (KSR средний) и дифференцированные в клетки макрофагального как после PMA-лечения (рис. 5 c). Иммуноокрашивания показал, что придерживался THP-1 клеток выражена CD68 (маркер макрофаги¹⁹) (рис. 5 d) и CD14 (другой маркер макрофагов) (рис. 6). Сформировать iGTE, моноциты THP-1 были внедрены в гель коллагена и вводится в отверстие, имитируя раны (Рисунок 5E). В 72 ч после PMA (10 нг/мл)-стимуляции, THP-1 клетки, дифференцированные в макрофагов (Рисунок 5F) внутри отверстие имитации рану и выразил CD68 (рис. 5 g), указывающий, они способны формы воспалительных очагов в раненых GTE.

Вся гора иммуногистохимия (рис. 6) показали, что клетки THP-1 в отверстие, имитируя рану не только выразили CD14 (другой маркер макрофагов), но также выразил виментин, а также фибробластов в края отверстия. Виментин выражается²⁰активных макрофагов. Данные подтвердили, что THP-1 макрофагов функциональных.

Рисунок 1: экспериментальный дизайн. Экспериментальная установка эквивалентов 3D человеческих тканей десны (ГТЭ) (A) и воспалительные GTE (iGTE) (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: характеристика HaCaT кератиноцитов. (A) фазово контрастной микроскопических изображений HaCaT клеток в культуре. Шкалы бар = 50 µm. (B) SEM изображение HaCaT клеток. (C) иммуногистохимическое окрашивание HaCaT клеток для десен эпителиальных клеток маркер K8/18. Грин, К8/18. Синий, DAPI. Шкалы бар = 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: характеристика эквиваленты 3D человеческих тканей десны (ГТЭ). (A) пример успешного GTE в культуре. Ткани в середине Вставка культуры. (B) пример неудачного GTE: частью GTE отделяется от ткани и смещены в сторону стены (красная стрелка). (C) раненых GTE: желтая стрелка указывает отверстие ударил панчер ткани. (D) H & E пятнать ГТД, культивируемых на 19 дней (14 дней воздуха воздействия). Шкалы бар = 50 µm. (E) SEM изображение вертикальной секции ГТД, культивируемых на 19 дней. (F) фазово контрастной микроскопических изображений HGF клеток в гель коллагена, который сформировал lamina propria ГТД. Шкалы бар = 25 µm. (G) SEM изображение массивные коллагеновых волокон вокруг HGF ячеек в lamina propria ГТД. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4: выражение виментин, TE-7 и K19 в GTE. Иммунофлюоресценции пятнать ГТД для lamina propria маркеры виментин (A и B) и (B) Тэ-7 в ГТД и маркер K19 эпидермиса в GTE (C) и iGTE (D). Красный, виментин и K19. Грин, TE-7. Синий, DAPI. E, эпидермис; LP, lamina propria. Шкалы бар = 50 мкм (A, C и D), 20 мкм (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5: характеристика клеток THP-1. (A) недифференцированные THP-1 клеток в культуре. Шкалы бар = 15 мкм. (B) продифференцировано THP-1 макрофагов. Шкалы бар = 15 мкм. (C) THP-1 клетки были внедрены в гель коллагена в среде KSR и лечение с PMA 24 h. масштаба бар = 50 µm. (D) иммуногистохимическое окрашивание THP-1 макрофагов для маркера CD68 макрофагов. Красный, CD68. Синий, DAPI. Шкалы бар = 5 мкм. (E) THP-1-коллаген смесь в раненых отверстие HGE в начале лечения PMA. Шкалы бар = 25 µm. (F) THP-1 клетки дифференцированной в макрофагов (красные стрелки) в 72 ч после лечения PMA. Шкалы бар = 25 µm. (G) THP-1 клетки выраженной макрофагов маркер CD68. Желтая пунктирная линия показывает области раненых отверстие в баре H & E. Шкала = 100 µm. красный, CD68. Синий, hoechst 33342. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 6: характеристика iGTE. Вся гора иммуногистохимия CD14 (зеленый) и виментин (красный) была исполнена на iGTE. Z-серии изображений (C) захватил через iGTE (416 мкм в общей сложности. Группа 1 — это первый раздел LSM проверен, и группа 25 является последним. Интервал составляет около 16.64 мкм между разделами). Представитель Секции (A) (№ 17 Z-серии изображений), ортофото и 3D изображение Z-стека (B) представил 3D распределение CD14 и виментин позитивных THP-1 макрофагов в отверстие, имитируя рану в iGTE. Сканирования положение LSM в iGTE указывается в (D) и левого верхнего угла в (A). Шкалы бар = 50 µm. желтые пунктирные линии указывают области раненых отверстие в iGTE. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Этот протокол основан на методы создания эквиваленты десневой ткани и подкожно-жировой эквиваленты, описанные в предыдущих докладах^8,21,22. Хотя это простой и легкий метод, некоторые шаги требуют особого внимания. К примеру коллаген смесь должны храниться на льду до использования, чтобы избежать образования геля в решении. При добавлении коллаген смесь в культуре вставляют, убедитесь, что решение было впрыснуто в центре вставки, чтобы избежать образования предвзято гель (как в рисунок 3B). Пробивая отверстия в GTE также принимает мастерства. Дырокол ткани иногда не может забрать ткани при слишком мокрой ткани. Система биопсия тканей или пару щипцы бы полезным; Однако будут намного изменены размеры раненых место. Это также можно использовать шприц с острыми иглы для вставки ячейки коллаген смесь THP-1 без пробивать отверстие (убедитесь, что гель не засорять иглы).

Ограничение этого метода является то, что не в состоянии представлять сложных биологических явлений гингивита и периодонтита, прекрасно, потому что iGTE не хватает кровеносных сосудов, нейрональные клетки и другие иммунные клетки, и воспаление не вызваны хоста биопленки взаимодействий. Однако это только в vitro гингивит ткани модель сделанные клетки человека, частично представляет патологии воспалительных десны. Модель может быть изменена более похож на реальный гингивита и периодонтита 1) совместное выращивание GTE с биопленки для создания хост биопленки взаимодействия или стимулирующие воспалительные реакции в iGTE с помощью ПЛАСТИНОК (соединений в наружной мембраны Грамотрицательные бактерии и сильных воспалительных инициатор как мы предложили в протоколе), 2) заполнения коллаген HGF решения на зубов форму десны зуб комплексов и наблюдая, как воспаление десны влияет твердых тканей и 3) с помощью человеческой десны эпителиальных клеток сформировать эпидермис GTE и iGTE.

Методы, представленные здесь ГТД и iGTE культур может использоваться как универсальные инструменты для изучения заживление ран, регенерации тканей, воспаление, ячейке взаимодействия и экран потенциальных лекарственных препаратов для гингивита и периодонтита.

Авторы заявляют никакого конфликта интересов.

Эта работа была поддержана в части японского общества для поощрения науки (JSP) субсидий для научных исследований (26861689 и 17 K 11813). Авторы хотели бы поблагодарить г-н Натаниел Грин для корректуры.