歯肉の炎症性三次元人体同等

プロトコルの目的は、炎症性歯肉モデル体外を構築することです。この組織モデルは共同ひと細胞、HaCaT ケラチノ サイト、歯肉線維芽細胞および三次元条件下での THP 1 マクロファージの 3 種類を栽培します。このモデルは、歯肉炎や歯周炎などの歯周病を調査に適用することができます。

(歯肉炎・歯周炎などの歯周病は、成人の歯の喪失の主要な原因です。歯肉の炎症は、歯周疾病の根本的な生理病理学です。歯周疾患の実験モデルを現在は動物の様々 なタイプに設けられています。ただし、モデル動物の生理病理学、細胞および分子メカニズムを分析し、歯周疾患の新薬を評価しにくく、人間のそれとは異なる。ここでは、ヒトの炎症性組織培養歯肉 (日本支社は 1996) 相当を再構築するための詳細なプロトコルを提案する.2 種類のひと歯肉線維芽細胞 (HGF) と三次元条件下でヒトの皮膚表皮角化細胞 (HaCaT) などを含む人間の細胞を用いた人体組織等価な歯肉 (GTE) を構築します。GTE に穴をパンチする組織パンチャーを使用して傷のモデルを作成します。次に、人間の THP 1 球がコラーゲン ・ ゲル混合は、GTE の穴に挿入されます。10 ng/mL ホルボール 12-ミリスタート 13-アセタート (PMA) 72 時間の adimistration、thp-1 細胞では GTE (日本支社は 1996) でフォーム炎症巣にマクロファージ分化 (日本支社は 1996 もすることができます stumilated 2 μ g/ml のリポ多糖 (LPS) の炎症を開始する 48 時間).日本支社は 1996 は、ひと細胞を用いた三次元アーキテクチャ炎症歯肉の最初の in vitroモデルです。日本支社は 1996 は、歯周疾病の主要な病理学的変化 (免疫細胞 activition、fibryoblasts、上皮細胞、単球やマクロファージの細胞相互作用) を反映します。GTE、負傷者 GTE、日本支社は 1996 は、歯周疾病の創傷治癒過程を研究する汎用性の高いツール、組織再生、炎症、細胞間相互作用や画面潜在的な医薬品として使用できます。

歯周病は、成人の歯の喪失の主要な原因です。歯肉炎と歯周炎は、最も一般的な歯周疾患です。両方は歯肉でバイオ フィルムを介した急性または慢性炎症性変化を提示します。歯肉炎は、歯周炎は、通常慢性炎症として提示に対し、急性炎症によって特徴付けられます。組織学的レベルでは、微生物の構成要素は、マクロファージ、リンパ球、形質細胞、肥満細胞の^1,2などの免疫細胞の活性化をトリガーします。(歯肉上皮細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞、骨芽細胞を含む) ローカルの細胞と対話するこれらの免疫細胞、特にマクロファージ炎症歯周組織^3,4病変の結果します。ラットなどの動物の様々 な種類の歯周疾患の実験モデルを確立されているハムスター、ウサギ、フェレット、イヌ、霊長類。ただし、モデル動物の生理病理学、細胞および分子メカニズムを分析し、歯周疾患⁵の新しい薬を評価しにくく、人間のそれとは異なる。歯周病細菌や単分子膜ひと口腔上皮細胞の共同栽培は、歯周感染症⁶のメカニズムを調査する使用されています。口腔細胞の単層培養がそのまま組織の三次元 (3 D) 細胞アーキテクチャを欠いているにもかかわらず、したがって、培養状況を模倣することはできません。

ここでは、体外で歯周疾患を表す 3 D 炎症人体組織等価な歯肉 (日本支社は 1996) が確立されます。歯周疾患のこの 3 D モデルは、単層細胞培養および動物モデル間の中間位置を占めています。HaCaT ケラチノ サイト、歯肉線維芽細胞、THP 1 マクロファージなどの細胞の 3 種類はコラーゲンのゲルの共同栽培、日本支社は 1996 を構築する炎症性のイニシエーターによって刺激されます。日本支社は 1996 は密接に、細胞分化、細胞間の相互作用、および歯肉組織におけるマクロファージ活性化の生体内での条件をシミュレートします。このモデルは、薬物スクリーニングと歯周疾病の新しい薬理学的アプローチをテストのためだけでなく、創傷治癒、炎症、組織再生で細胞および分子メカニズムを分析するため多くのアプリケーションを持っています。

このプロトコルは、対応するひと歯肉組織、歯肉創傷モデル、および歯肉炎モデルを作成する設計されています。ひと皮膚表皮角化細胞 (HaCaT) 親切教授ノルベルト ・ e. Fusenig ドイツ Krebsforschungszentrum (ハイデルベルク、ドイツ)⁷から提供されていました。ひと歯肉線維芽細胞 (HGFs) は、以前に公開されたプロトコル⁸によると歯肉組織から分離された.あらかじめ、インフォームド コンセントを得たし、研究が、日本歯科大学生命歯学部東京での倫理委員会で設定されたガイドラインに従って承認された (承認番号: NDU T2012 35)。細胞文化フードでプロトコルの手順 1-3 を実行必要があります。

1. 歯肉 (GTE) (図 1 a) の 3 D 人体組織等価の準備

1. ミックス タイプ - A コラーゲンゲル 10% 濃縮 MEM-α と 10% の再構築バッファー (2.2 g NaHCO₃と 4.47 g HEPES 100 mL 0.05 N 水酸化ナトリウム) ピペッティングで 15 mL の生殖不能の管に。氷上を使用するまで混合コラーゲン溶液を維持します。
2. 24 ウェル プレートに 24 の文化挿入 (細孔サイズ 3.0 μ m) を配置します。
3. 0.25% トリプシン-EDTA 溶液を使用して文化面から得られたを削除します。10 mL の培地 A に細胞を中断 (MEM-α + 20 %fbs + 1 %glutamax)。Bürker トゥルク細胞カウンターによってセルをカウントします。
   1. セル (1-5 x10⁵セル/mL)、必要な数量を抽出し、190 x g で 4 分間遠心します。
   2. コラーゲン混合溶液中の細胞を中断します。次のステップまで氷の混合物をしてください。
4. 任意の気泡を生じることがなく文化挿入セル コラーゲン混合物 (0.5 – 2.5 x 10⁵細胞/ウェル) の 0.5 mL を追加します。ジェルの中に混合物を凝固する 37 ° C で 5% CO₂加湿雰囲気で 10-30 分のための混合物を孵化させなさい。
   注: は、コラーゲン ・ ゲルの不均一の形成を避けるために文化挿入部にコラーゲン混合物を追加します。
5. まあ、挿入に 0.5 mL に培養液 1 mL を追加します。24 時間の培養プレートを孵化させなさいまたは 37 ° C で 5% CO₂加湿雰囲気の中で一晩
6. 0.25% トリプシン-EDTA 溶液を使用して文化面から細胞を削除します。10 ml の培地 B の細胞を中断 (DMEM + 10 %fbs + 1 %glutamax) とセルをカウントします。抽出細胞 (1-5 10⁵セル/mL x) 190 × g. で 4 分間遠心分離、ピペットの必要量を中断中 B の細胞
7. 誤嚥により HGF コラーゲン混合物を含む文化挿入からメディアを削除します。HGF コラーゲン混合物の上に HaCaT 細胞懸濁液 (0.5 – 2.5 x 10⁵細胞/ウェル) の 0.5 mL を加えます。24 時間または一晩文化を孵化させなさい。
   注: この時点で文化の媒体も間べきである媒体、文化挿入中は中 b. をする必要があります。
8. KSR 媒体 (共培養中) 培養液に置き換える (MEM-α + 15% ノックアウト血清交換 + 1 %glutamax) + 5 %fbs。まあ、文化挿入に 0.5 mL 文化に培養液 1 mL を追加します。24-48 h の文化を孵化させなさい。
9. 培養液に置き換えて KSR ミディアム + 1 %fbs。よく文化に 1 mL と文化挿入に 0.5 mL を追加します。24 時間または一晩文化を孵化させなさい。
10. 0.7-1 文化に培養液をよく置き換えます mL KSR 媒体。(文化の表面は、空気にさらされる必要があります) 文化挿入から媒体を完全に取り外します。1-2 週間の文化を孵化させなさい。週二回も文化内のメディアを変更します。
    注: (ケラチノ サイトの最上位のレイヤーで構成される) 文化表面上中レベル上昇てはいけないです。常に乾いた状態に保つ培養面。

2. 負傷者 GTE (図 1 b) の準備

1. 1-3 mm 径組織パンチャーを準備します。それを 20 分 121 ° C のオートクレーブで殺菌します。
2. 300 μ m、深さについて GTE に垂直に組織のパンチャーをプッシュし、傷をシミュレートするために組織で穴を開けます。
3. この手順では、創傷治癒と組織再生を調査するため負傷 GTE を使用します。また、GTE 10% 中性緩衝ホルマリンを使用した組織学的解析の実行を修正します。

3. 炎症性 GTE (日本支社は 1996) (図 1 b) の準備

1. 以前レポート⁹によると thp-1 細胞を養います。
2. ミックス タイプ - A コラーゲンゲル 10% 濃縮 RPMI 1640 年 10% 再構成バッファー (2.2 g NaHCO₃と 4.47 g HEPES 100 mL 0.05 N 水酸化ナトリウム) と 10 ng/mL PMA。使用するまで氷の上混合コラーゲン溶液を維持します。
3. カウント 1-2 x 10 の⁶ THP 1 セルと 190 x g に 4 分間遠心をコラーゲン混合溶液 1 mL のセル中断します。次のステップまで氷の混合物をしてください。
4. GTE の負傷者の領域に 10-30 μ L THP 1 コラーゲン混合物を追加します。0.7-1 に培養液を交換 mL KSR 培 PMA の 10 ng/mL。
5. 72 h の 37 ° C で 5% CO₂加湿雰囲気の中で混合物を孵化させなさい。
6. 歯肉炎や歯周病を調査するためにモデルを使用 (たとえば、日本支社は 1996 サイトカインのリリース¹⁰にその効果を見るために潜在的な抗炎症薬を追加します)。また、72 h PMA 処理を省略すると LPS の 2 μ G/ml、文化を追加し、48 h^11,12の 37 ° C で 5% CO₂加湿雰囲気で組織を孵化させなさい。

4. 固定および GTE の日本支社は 1996 全体マウント免疫染色文化

1. 文化の固定。
   1. 24 ウェル プレートから培養培地を削除します。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で 2 回組織を洗浄します。
   2. 文化にも挿入して 1 mL の 10% ホルマリン中性緩衝液の 1 mL を追加します。4 ° C で冷蔵庫で一晩 24 ウェル プレートを残します。
   3. 次の日 10% 中性緩衝ホルマリンを削除します。
   4. 全体のマウント是非、固定後 PBS に組織を 3-4 回の洗浄します。
   5. ヘマトキシリンとエオシン (H & E) 染色や正規免疫染色、脱水、パラフィン包埋、切片と進みます。
      注: 全体のマウントの是非、この手順を省略できます。
2. 全体のマウント免疫染色
   注: このプロトコルは、13 の参照の 1 つから変更されました。
   1. 3 組織を洗う x PBS 0.5-1% トリトン、10-30 分たびに。
   2. ブロック バッファー内で 30 分間 2 回組織を孵化させなさい (PBS 1% トリトン + 10 %bsa)、室温で。
   3. 5-10 分毎回ブロック バッファーで組織 2 × を洗ってください。
   4. 挿入に必要な希釈/濃度に一次抗体溶液 50 μ L を追加します。薄いプラスチックしがみつくフィルムを使用して、組織を乾燥を避けるために挿入をラップします。
   5. 4 ° C で 1 ~ 2 日間組織を孵化させなさい
   6. 組織 3 回洗浄、PBS で 30 分間 1% トリトン + 10 %bsa。洗浄 3 回再び、PBS で 5 分 1% トリトン。
   7. 二次抗体の 50 μ L を加えてブロック バッファー (PBS 1% トリトン + 10 %bsa) と各挿入するヘキスト 33342 ソリューション (NucBlue ライブ細胞染色) の 5 μ L。薄いプラスチックしがみつくフィルムを使用して、組織を乾燥を避けるために挿入をラップします。
   8. 4 ° C で 1 ~ 2 日間インキュベートします。湿らせたペーパー タオルで 24 ウェル プレートをラップし、インキュベーションを通して使用されるプラスチック パックに入れます。
   9. PBS 1% トリトンの 10 分の 3 回、組織を洗浄します。
   10. 鋭い針を使用して、組織を取得する文化挿入の膜をカットします。スライドに膜を配置します。
       注: 組織は、膜にする必要があります。
   11. 蛍光マウント中の 2-3 滴を追加します。解析までカバーガラスと暗闇の中で 4 ° C でストアを持つ組織をカバーしてください。
   12. 共焦点レーザ走査型顕微鏡 (LSM) と組織を表示します。

細胞には、位相差顕微鏡による観察 (図 2 a) の下で典型的な表皮細胞の形態が表示されます。スキャナー電子顕微鏡 (SEM) 像は、HaCaT 細胞表面が多く微絨毛で覆われていたことを示した。HaCaT 細胞間の細胞間の接続は、膜プロセス (図 2 b) によって仲介されました。細胞は、歯肉上皮マーカー K8/18¹⁴HaCaT 細胞が歯肉再建 (図 2) に適していることを示す表現。

図 3 aは、GTE の成功例を示し、図 3 bは、GTE の失敗した例を示しています。(図 3 b) の不成功の試みは、文化挿入部に追加されていないコラーゲン ゲル混合物によって引き起こされます。図 3は示した GTE の創傷モデルが組織パンチャーと組織の穴を打つことによって行うことができます。H & E 染色 (図 3 D), SEM 像 (図 3E) 栽培の 19 日、HaCaT 細胞フォーム上皮とコラーゲン ・ ゲル包埋・ HGF 細胞フォーム粘膜の約 10-20 層で分かった。再建された GTE の粘膜における HGF 細胞は線維芽細胞 (図 3 f) の特徴的な形態を展示し、膠原線維 (図 3) の明確に定義された配列に囲まれていた。免疫蛍光染色 GTE (図 4 aおよび4 b) の粘膜におけるビメンチンとテ-7 (両方とも真皮線維芽細胞マーカー¹⁵) が表されることを示した。K19、歯周炎¹⁶、接合およびポケット上皮特異的マーカーは弱く GTE (図 4) の上皮で表現し、日本支社は 1996 (図 4) の上皮で強く表現されます。データは、HaCaT 細胞粘膜の炎症性刺激の後は特に歯周炎におけるキーの上皮細胞で分化ができることを提案しました。

歯肉炎や歯周炎などの炎症性歯肉疾患になり線維化と組織の壊死^17,18組織学的にリンパ球およびマクロファージの存在によって特徴付けられます。このプロトコルで thp-1 細胞は日本支社は 1996 の炎症細胞として使用されました。図 5、PMA 刺激なしで示すように、thp-1 細胞は単球の形態、媒体 (図 5 a) でそれらのほとんどを提示しました。対照的に、PMA の 10 ng/mL 72 時間にさらされた後 thp-1 細胞の 50% 以上は、マクロファージのような細胞へと分化し、文化面 (図 5 b) に付着しました。HGF と HaCaT 細胞⁸と同様に、thp-1 細胞共培養培地 (KSR 中) でコラーゲン ・ ゲル内成長し、PMA 治療 (図 5) 後マクロファージのような細胞に分化します。免疫染色を示した CD68 を付着 thp-1 細胞に表現 (マクロファージ¹⁹のマーカー) (図 5)、CD14 (大食細胞の別のマーカー) (図 6)。日本支社は 1996 を形成、THP 1 球がコラーゲン ・ ゲル内に埋め込まれた、傷 (図 5E) をシミュレートする穴に注入します。PMA 後 72 時間 (10 ng/mL)-刺激、thp-1 細胞分化マクロファージ (図 5 階) 傷をシミュレートし、CD68 を表明した穴の中 (図 5)、負傷者 GTE のフォーム炎症巣が示します。

全体のマウント免疫組織化学 (図 6) を示した CD14 をシミュレートするだけでなく傷穴で thp-1 細胞に表現 (大食細胞の別のマーカー) の穴の縁に線維芽細胞と同様、ビメンチンはまた表明したが。Vimentin は、アクティブなマクロファージ²⁰で表されます。データは、THP 1 マクロファージが機能しているを確認します。

図 1: 実験的デザインします。歯肉 (GTE) (A) の 3 D 人体組織等価性と炎症性 GTE (日本支社は 1996) (B)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2: HaCaT ケラチノ サイトのキャラクタリゼーション。(A) 培養細胞の位相差顕微鏡像。スケールバー = 50 μ m (B) SEM 画像 HaCaT 細胞の。(C) 免疫組織化学的歯肉上皮細胞マーカー K8/18 HaCaT 細胞の染色します。グリーン、K8/18。青、DAPI。スケール バー = 10 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3: 歯肉 (GTE) の 3 D 人体組織等価のキャラクタリゼーション。(A) 文化の成功した GTE の例です。組織は文化挿入の最中です。失敗した GTE の (B) の例: GTE の一部を組織から分離し、壁 (赤矢印) に偏っています。(C) 負傷者 GTE: 黄色の矢印は、ティッシュ パンチでパンチ穴を示します。(D) H & E 染色 GTE (14 日空気露出) 19 日のために栽培されます。スケールバー = 50 μ m (E) SEM 画像 19 日のために栽培される GTE の垂直セクションの。(F) 位相 GTE の粘膜を形成するコラーゲン ・ ゲルの細胞の HGF の顕微鏡像。スケール バー 25 μ m (G) SEM 画像の GTE の粘膜における HGF セルを囲む大規模なコラーゲン線維を =。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 4: TE 7 および GTE の K19, ビメンチンの発現します。蛍光抗体染色 GTE 粘膜マーカー ビメンチン (AとB) とテ-7 (B)、GTE、表皮マーカー K19 GTE (C) と (D) 日本支社は 1996 のため。赤、ビメンチン、K19。緑、テ-7。青、DAPI。E、表皮;LP は、粘膜です。スケールバー = 50 μ m (A、 C 、 D) 20 μ (B)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 5: thp-1 細胞のキャラクタリゼーション。(A) 未分化 THP 1 細胞文化。スケール バー 15 μ m. (B) 区別 THP 1 マクロファージを =。スケール バー = 15 μ m. (C) thp-1 細胞が KSR 中コラーゲン ・ ゲルに埋め込まれ、24 時間スケールの PMA で扱われるバー = 50 μ m。 (D) 免疫組織化学染色 THP 1 マクロファージ マクロファージ マーカー CD68 の。赤、CD68。青、DAPI。スケール バー = PMA 治療の初めに重要の負傷した穴に 5 μ m. (E) THP 1 コラーゲン混合。スケール バー = 25 μ m. (F) thp-1 細胞分化マクロファージ (赤矢印) 72 h で PMA の治療後。スケール バー 25 μ m. (G) THP 1 細胞発現マクロファージ マーカー CD68 を =。黄色の破線が H & e. スケール バーで負傷した穴の範囲を示す = 100 μ m. レッド、CD68。青、ヘキスト 33342。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 6: 日本支社は 1996 のキャラクタリゼーション。日本支社は 1996 の CD14 (緑) とビメンチン (赤) の全体のマウント免疫組織染色を行った。Z シリーズ (C) でとらえた日本支社は 1996 (合計 416 μ m。パネル 1 は LSM がスキャンされると、最初のセクション、パネル 25 は最後。間隔はセクション間約 16.64 μ m) です。代表的なセクション (A) (Z シリーズ画像の 17 号)、オルソと z (B) の 3 D 画像、3 D の穴に、日本支社は 1996 の傷をシミュレートする CD14 およびビメンチン陽性 THP 1 マクロファージ分布を発表しました。日本支社は 1996 の LSM のスキャン位置が (D) に示されていると (A) の左上隅。スケールバー = 50 μ m. 黄色点線が日本支社は 1996 で負傷した穴の位置を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

このプロトコルは、歯肉組織等価および皮下脂肪組織相当前レポート^8,21,22で説明を作成する方法に基づいています。これは、シンプルで簡単な方法は、いくつかの手順特別な注意が必要です。たとえば、コラーゲン混合物は、ソリューションのゲル形成を避けるために使用するまで氷で冷やす必要があります。コラーゲン混合物を文化挿入に追加すると、ソリューションは、偏りのあるゲル ( 3 b を図のように) を避けるために挿入部に注入されたを確認します。スキルを取るも GTE で穴をあけます。組織のパンチャーは時々 組織があまりにも濡れている場合組織を選ぶことはできません。組織生検システムや鉗子の有用である;ただし、負傷した位置の寸法も変更されます。また、鋭い針で穴をあけることがなく THP 1 細胞コラーゲン混合物を注入する注射器を使用することが可能だ (ゲルに針が詰まらせるれませんを確認してください)。

このメソッドの制限は、日本支社は 1996 を欠いている血管、神経細胞および他の免疫細胞と炎症が原因ではないために、完全に歯肉炎と歯周炎の複雑な生物学的現象を表すことができますだが、ホスト バイオ フィルムの相互作用。しかし、それだけ体外歯肉炎組織モデルですひと細胞によって作られた部分的炎症歯肉の病理を示す。モデルは、実際歯肉炎と歯周疾患に類似している 1 によって変更できます) GTE をホスト バイオ フィルムの相互作用を作成するバイオ フィルム共同育成または LPS (の外膜で化合物を用いた日本支社は 1996 で炎症反応を刺激グラム陰性菌と強い炎症イニシエーター プロトコルの提案として)、2) 錯形成歯肉歯抜去歯のコラーゲン HGF ソリューションをシードと硬組織と 3 の歯肉の炎症の影響を観察すること) を使用してGTE と日本支社は 1996 の表皮を形成するひと歯肉上皮細胞。

紹介した方法、GTE と日本支社は 1996 文化使用できます創傷治癒、組織再生、炎症、細胞間の相互作用を研究する汎用性の高いツールとして、画面の医薬品候補を歯肉炎と歯周疾患のため。

著者は利益相反を宣言しません。

この作品は、科学研究 (26861689, 17 K 11813) の科学振興費日本社会によって一部に支えられました。著者は、校正のナサニエル ・ グリーン氏に感謝したいと思います。