Equivalentes de tridimensional tecido humano inflamatória da gengiva

O objetivo do protocolo é construir um modelo de gengiva humana inflamatória em vitro. Este modelo de tecido co cultiva três tipos de células humanas, HaCaT queratinócitos, fibroblastos gengivais e macrófagos THP-1, sob condições tridimensionais. Este modelo pode ser aplicado para investigar doenças periodontais, como gengivite e periodontite.

Doenças periodontais (tais como gengivite e periodontite) são as principais causas de perda dentária em adultos. Inflamação na gengiva é fundamental fisiopatologia das doenças periodontais. Atuais modelos experimentais de doenças periodontais foram estabelecidos em vários tipos de animais. No entanto, a fisiopatologia de modelos animais é diferente dos seres humanos, dificultando a mecanismos celulares e moleculares de analisar e avaliar novos medicamentos para doenças periodontais. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para reconstruir equivalentes de tecido humano inflamatória da gengiva (iGTE) em vitro. Primeiro construímos equivalentes de tecido humano da gengiva (GTE), utilizando dois tipos de células humanas, incluindo fibroblastos gengivais humanos (HGF) e pele humana queratinócitos epidérmicos (HaCaT), sob condições tridimensionais. Criamos um modelo de ferida usando um furador de tecido para fazer um buraco na GTE. Em seguida, humanos monócitos THP-1 misturados com gel de colágeno são injetados no furo do GTE. Por adimistration de 10 ng/mL phorbol myristate 12 13-acetato (PMA) para 72 h, THP-1 células diferenciadas em macrófagos aos focos inflamatórios da forma no GTE (iGTE) (IGTE também pode ser stumilated com 2 µ g/mL de lipopolissacarídeos (LPS) para 48 h iniciar a inflamação ). IGTE é o primeiro em vitro modelo da gengiva inflamatória usando células humanas com uma arquitetura tridimensional. IGTE reflete grandes mudanças patológicas (immunocytes activition, interações intracelulares, entre fibryoblasts, células epiteliais, monócitos e macrófagos) em doenças periodontais. GTE, GTE ferido e iGTE podem ser usados como ferramentas versáteis para estudar a cicatrização de feridas, regeneração tecidual, inflamação, interação célula-célula e tela potenciais medicamentos para as doenças periodontais.

As doenças periodontais são a principal causa de perda dentária em adultos. Gengivite e periodontite é as doenças periodontais mais comuns. Ambos apresentam alterações inflamatórias mediada por biofilme agudas ou crônicas na gengiva. A gengivite é caracterizada por inflamação aguda, Considerando que a periodontite apresenta-se geralmente como uma inflamação crônica. A nível histológico, componentes bacterianas desencadear a ativação de células do sistema imunológico, tais como macrófagos, linfócitos, plasmócitos e mastócitos^1,2. Estas células imunes, especialmente os macrófagos, interagirem com as células locais (incluindo células epiteliais gengivais, fibroblastos, células endoteliais e osteoblastos) resultando em lesões inflamatórias no tecido periodontal^3,4. Modelos experimentais de doenças periodontais foram estabelecidos em vários tipos de animais, como ratos, hamsters, coelhos, furões, caninos e primatas. No entanto, a fisiopatologia de modelos animais é diferente dos seres humanos, dificultando a mecanismos celulares e moleculares de analisar e avaliar novos medicamentos de doenças periodontais⁵. Co de cultivo de bactérias periodontais e células epiteliais oral humanas monocamada serviu para investigar o mecanismo das infecções periodontais⁶. No entanto, culturas de monocamadas de células orais faltam a arquitetura de celulares tridimensional (3D) do tecido intacto; Portanto, eles não podem imitar a situação em vitro .

Aqui, equivalentes 3D tecido humano inflamatória da gengiva (iGTE) são criados para representar doenças periodontais em vitro. Este modelo 3D das doenças periodontais ocupa uma posição intermediária entre as culturas de células monocamadas e modelos animais. Três tipos de células humanas, incluindo HaCaT queratinócitos, fibroblastos gengivais e THP-1 macrófagos, são co cultivados em gel de colágeno e estimulados pela inflamatórios iniciadores para construir iGTE. IGTE intimamente simula as condições na vivo de diferenciação celular, interação célula-célula e ativação de macrófagos na gengiva. Este modelo tem muitas aplicações possíveis drogas triagem e testando novas abordagens farmacológicas em doenças periodontais, bem como para analisar os mecanismos celulares e moleculares na cicatrização de feridas, inflamação e regeneração de tecidos.

Este protocolo é projetado para criar modelos de gengivite, modelos de ferimento gengival e equivalentes de tecido gengival humano. Pele humana queratinócitos epidérmicos (HaCaT) foram gentilmente cedidos do Professor Norbert E. Fusenig do Deutsches Krebsforschungszentrum (Heidelberg, Alemanha)⁷. Fibroblastos gengivais humanos (HGFs) foram isolados a partir de tecidos gengivais, de acordo com os protocolos anteriormente publicados⁸. Foi obtido consentimento previamente, e o estudo foi aprovado de acordo com as orientações definidas pelo Comitê de ética, a Nippon Dental Universidade escola de vida Odontologia em Tóquio (número de autorização: NDU-T2012-35). Protocolo etapas 1-3 devem ser executadas em uma capa de cultura de células.

1. preparação do tecido humano 3D equivalentes da gengiva (GTE) (figura 1A)

1. Mix-colágeno tipo-A gel com 10% concentrados MEM-alfa e buffer de reconstrução de 10% (2,2 g de NaHCO₃ e 4,47 g HEPES em 100 mL 0,05 N NaOH) em um tubo estéril 15 mL por pipetagem. Conservar a solução mista de colágeno no gelo até usado.
2. Coloca uma placa de 24 inserções 24-poço de cultura (poros tamanho 3,0 µm).
3. Remova HGFs da cultura superfície usando a solução de EDTA-tripsina 0,25%. Suspender as células em 10 mL de meio de cultura A (alfa-MEM + 20% FBS + 1% GlutaMAX). Conte as células por um contador de célula Bürker-Türk.
   1. Extrair a quantidade desejada de células (1-5 x10⁵ células/mL) e, em seguida, centrifugar durante 4 min a 190 x g.
   2. Suspenda as células na solução mista de colágeno. Manter a mistura no gelo até o próximo passo.
4. Adicione 0,5 mL da mistura de célula-colágeno (0.5-2.5 x 10⁵ células/poço) para inserir a cultura sem produzir quaisquer bolhas. Incube a mistura por 10 a 30 min em um ambiente umidificado com 5% CO₂ a 37 ° C para coagular a mistura em um gel.
   Nota: Adicione a mistura de colágeno no centro da inserção da cultura, para evitar formação desigual de gel de colágeno.
5. Adicione 1 mL do meio de cultura para o bem e 0,5 mL para a inserção. Incubar a placa de cultura para 24h ou durante a noite em um ambiente umidificado com 5% CO₂ a 37 ° C.
6. Remova HaCaT células da superfície da cultura usando a solução de EDTA-tripsina 0,25%. Suspender as células em 10 mL do meio B (DMEM + 10% FBS + 1% GlutaMAX) e contar as células. Extrair a quantidade necessária de células (1 – 5 x 10⁵ células/mL) com uma pipeta, centrífuga para 4 min em x 190 g. suspender as células em média B.
7. Remova o meio das inserções de cultura, que contêm a mistura de HGF-colágeno, por aspiração. Adicione 0,5 mL de suspensão de células HaCaT (0.5-2.5 x 10⁵ células/poço) no topo da mistura de HGF-colágeno. Incube as culturas por 24 horas ou durante a noite.
   Nota: Neste ponto do tempo, o meio na cultura bem deve ser A média, enquanto a média na inserção da cultura deve ser médio B.
8. Substituir o meio de cultura com meio KSR (meio de cultura co) (MEM-alfa + 15% de substituição de soro nocaute + 1% GlutaMAX) + 5% FBS. Adicione 1 mL do meio de cultura para a cultura bem e 0,5 mL para a inserção da cultura. Incube as culturas por 24 – 48 h.
9. Substituir o meio de cultura com KSR médio + 1% FBS. Adicione 1 mL na cultura bem e 0,5 mL para a inserção de cultura. Incube as culturas por 24 horas ou durante a noite.
10. Substituir o meio de cultura na cultura bem com 0,7 a 1 mL de meio de KSR. Remova completamente o meio de inserção da cultura (a superfície de cultura deve ser exposta ao ar). Incube as culturas por 1 – 2 semanas. Mude o meio na cultura bem duas vezes por semana.
    Nota: Não deixe que a ascensão de nível média acima da superfície da cultura (a camada superior composta por queratinócitos). Mantenha sempre a superfície de cultura seca.

2. preparação do GTE ferido (figura 1B)

1. Prepare um perfurador de tecido 1 a 3 mm de diâmetro. Esterilize-a com uma autoclave a 121 ° C por 20 min.
2. Empurre o perfurador de tecido perpendicularmente GTE sobre 300 µm profundo e um buraco no tecido para simular um ferimento.
3. Neste passo, use o GTE ferido para investigar a regeneração de tecido e cura ferida. Alternativamente, conserte a GTE usando solução de tampão neutro de formalina 10% para realizar a análise histológica.

3. preparação do GTE inflamatória (iGTE) (figura 1B)

1. Cultive células THP-1 de acordo com o relatório anterior⁹.
2. Mix-colágeno tipo-A gel com 10% concentrados RPMI 1640, buffer de reconstrução de 10% (2,2 g de NaHCO₃ e 4,47 g HEPES em 100 mL 0,05 N NaOH) e 10 ng/mL PMA. Manter a solução de colágeno misto no gelo até o uso.
3. Contagem de 1 – 2 x 10⁶ THP-1 células e centrifugar durante 4 minutos a 190 x g. suspender as células em 1 mL da solução mista de colágeno. Manter a mistura no gelo até o próximo passo.
4. Adicione a mistura de THP-1-colágeno do 10 a 30 µ l para a área de feridos do GTE. Substituir o meio de cultura para 0,7-1 mL de meio de KSR contendo 10 ng/mL de PMA.
5. Incube a mistura em um ambiente umidificado com 5% CO₂ a 37 ° C por 72 h.
6. Usar o modelo para investigar a gengivite ou doença periodontal (por exemplo, adicionar o potencial medicamento anti-inflamatório para iGTE para ver seus efeitos sobre a liberação de citocinas¹⁰). Alternativamente, omitir PMA-tratamento de 72 h, adicionar 2 µ g/mL de LPS na cultura e incubar o tecido em um ambiente umidificado com 5% CO₂ a 37 ° C por 48 h^11,12.

4. fixação e toda montagem imunocoloração de GTE e iGTE culturas

1. Fixação das culturas.
   1. Remova a placa de 24, o meio de cultura. Lave os tecidos 2 vezes com solução salina tamponada fosfato (PBS).
   2. Adicione 1 mL de solução-tampão neutro de formalina 10% para a inserção e 1 mL da cultura bem. Deixe a placa de 24 em um refrigerador a 4 ° C durante a noite.
   3. Remova a solução-tampão neutro de formalina 10% no dia seguinte.
   4. Para toda montagem imunocoloração, lave os tecidos 3 - 4 vezes com PBS após a fixação.
   5. Por hematoxilina e eosina (H & E) coloração e imunocoloração regular, prosseguir com a desidratação, incorporação de parafina e de corte.
      Nota: Para toda montagem imunocoloração, esta etapa pode ser omitida.
2. Toda montagem de imunocoloração
   Nota: Este protocolo foi modificado na referência 13.
   1. Lavar os tecidos 3 x em PBS 0,5 – 1% Triton, 10 – 30 min cada tempo.
   2. Incubar os tecidos duas vezes por 30 min em tampão de bloqueio (PBS 1% Triton + 10% BSA), à temperatura ambiente.
   3. Lave os tecidos 2 × em tampão de bloqueio, 5 – 10 min cada tempo.
   4. Adicione 50 µ l de solução de anticorpo primário na concentração/diluição necessária para as inserções. Use um filme de plástico plástico fino para encapsular as inserções para evitar a secagem do tecido.
   5. Incubar o tecido durante 1 a 2 dias a 4 ° C.
   6. Lavar os tecidos 3 vezes, por 30 min em PBS 1% Triton + 10% de BSA. Lave novamente 3 vezes, por 5 min em PBS 1% Triton.
   7. Adicionar 50 µ l de anticorpo secundário em tampão de bloqueio (PBS 1% Triton + 10% BSA) e 5 µ l de solução de Hoechst 33342 (mancha de NucBlue ao vivo celular) para cada inserção. Use um filme de plástico plástico fino para encapsular as inserções para evitar a secagem do tecido.
   8. Incubar durante 1 a 2 dias a 4 ° C. Embrulhe a placa de 24 em uma toalha de papel molhada e depois colocá-lo em um bloco de plástico a ser usado ao longo de incubação.
   9. Lavar os tecidos 3 vezes, por 10 min em Tritão de 1% de PBS
   10. Use uma agulha afiada para cortar a membrana da inserção da cultura para obter o tecido. Lugar da membrana para um slide.
       Nota: O tecido deve ser na membrana.
   11. Adicione 2 a 3 gotas de meio de montagem de fluorescência. Cubra o tecido com uma tampa de vidro e a loja a 4 ° C, no escuro até análise.
   12. Ver os tecidos com um laser confocal, microscopia (LSM).

As células HaCaT exibidas morfologia típica queratinócito sob observação microscópica de contraste de fase (Figura 2A). Scanner elétron microscópico (SEM) imagens mostrou que as superfícies de célula HaCaT estavam cobertas por muitos microvilli. Conexões intercelulares entre células de HaCaT foram mediadas por processos de membrana (Figura 2B). HaCaT células expressaram epitélio gengival marcador K8/18¹⁴, indicando que as células HaCaT são adequadas para reconstrução de gengiva (Figura 2).

A figura 3A mostra um exemplo bem sucedido da GTE, e Figura 3B mostra um exemplo de falhado do GTE. O julgamento sem sucesso (Figura 3B) é causado pela mistura de gel de colágeno não sendo adicionada no centro da inserção da cultura. Figura 3 mostrou que um modelo de ferida de GTE pode ser feito por perfurar um buraco no tecido com um perfurador de tecido. H & E mancha (Figura 3D) e SEM imagens (Figura 3E) demonstraram que em 19 dias de cultivo, cerca de 10 – 20 de camadas de epitélio de forma HaCaT células e colágeno incorporado no gel de HGF células forma propria do lamina. Na propria do lamina da GTE reconstruído, células HGF exibiram morfologia característica de fibroblastos (Figura 3F), em foram cercadas por matrizes bem-definido de fibras colágenas (Figura 3). Mancha da imunofluorescência mostrou que a vimentina e TE-7 (ambos são fibroblastos dérmicos marcadores¹⁵) são expressos na propria do lamina do GTE (Figura 4A e 4B). K19, um marcador específico para o epitélio juncional e bolso em periodontite¹⁶, é fracamente expressa no epitélio da GTE (Figura 4) e é fortemente expressa no epitélio da iGTE (Figura 4). Os dados sugerem que HaCaT células podem diferenciar em células epiteliais chaves na periodontite, especialmente após estimulação inflamatória da propria do lamina.

Doenças inflamatórias gengivais, como gengivite e periodontite, caracterizam-se histologicamente pela presença de linfócitos e macrófagos e resultam em fibrose e tecido necrose^17,18. Neste protocolo, THP-1 células foram usadas como as células inflamatórias para iGTE. Como mostrado na Figura 5, sem estimulação-PMA, células THP-1 apresentaram uma morfologia monocítica e a maioria delas flutuou no meio (Figura 5A). Em contraste, após serem expostos a PMA 10 ng/mL para 72 h, mais de 50% do THP-1 células diferenciadas em células semelhantes a macrófagos e aderida na superfície da cultura (Figura 5B). Semelhante ao de células HaCaT e HGF⁸, THP-1 células cresceram bem dentro do gel de colágeno em meio de cultura co (médio KSR) e diferenciadas em células macrófagos após PMA-tratamento (Figura 5). Immunostaining mostrou que as células aderidas de THP-1 expressaram CD68 (um marcador de macrófagos¹⁹) (Figura 5) e CD14 (outro marcador de macrófagos) (Figura 6). Para formar iGTE, monócitos THP-1 foram incorporados o gel de colágeno e injetados o buraco simulando uma ferida (Figura 5E). A 72 h após a PMA (10 ng/mL)-estimulação, THP-1 células diferenciadas em macrófagos (Figura 5F) dentro do buraco, simulando uma ferida e expressa CD68 (Figura 5), indicando que eles são capazes de focos inflamatórios de forma na GTE ferido.

Toda montagem imuno-histoquímica (Figura 6) mostrou que células de THP-1 no buraco simulando uma ferida não só expressaram CD14 (outro marcador de macrófagos), mas também expressaram vimentina, bem como os fibroblastos na borda do buraco. Vimentina é expressa por macrófagos ativo²⁰. Os dados confirmaram que o THP-1 macrófagos são funcionais.

Figura 1: desenhos experimentais. A instalação experimental de equivalentes de tecido humano 3D da gengiva (GTE) (A) e GTE inflamatória (iGTE) (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: caracterização de queratinócitos HaCaT. (A) imagem microscópica de contraste de fase de HaCaT células em cultura. Barra de escala = 50 µm. (B) SEM imagem de células HaCaT. Imuno-histoquímica (C) coloração de células HaCaT para marcador de células epiteliais gengivais K8/18. Verde, K8/18. Azul, DAPI. Barra de escala = 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: caracterização de equivalentes de tecido humano 3D da gengiva (GTE). (A) exemplo de uma bem sucedida GTE em cultura. O tecido está no meio de inserção da cultura. (B) exemplo de uma falha GTE: parte da GTE é separado do tecido e inclinado para a parede (seta vermelha). (C) GTE feridos: seta amarela indica um buraco pelo perfurador de tecido. (D) H & E mancha de GTE cultivada por 19 dias (14 dias de exposição de ar). Barra de escala = 50 µm. (E) SEM a imagem de uma seção vertical de GTE cultivada por 19 dias. (F) imagem microscópica do HGF células em gel de colágeno que formou a propria do lamina do GTE de contraste de fase. Barra de escala = 25 µm. (G) SEM imagem de fibras de colágeno maciça em torno de células HGF a propria do lamina do GTE. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: expressão de vimentina, TE-7 e K19 no GTE. Mancha da imunofluorescência de GTE para propria do lamina marcadores vimentina (A e B) e (B) TE-7 no GTE e marcador de epiderme K19 no GTE (C) e iGTE (D). Vermelho, vimentina e K19. Verde, TE-7. Azul, DAPI. E, a epiderme; LP, propria do lamina. Barra de escala = 50 µm (A, C e D), 20 µm (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: caracterização de células THP-1. (A) indiferenciadas THP-1 em cultura de células. Barra de escala = 15 µm. (B) diferenciadas THP-1 macrófagos. Barra de escala = 15 µm. (C) THP-1 células foram incorporadas no gel de colágeno em meio da KSR e tratadas com PMA por 24 h. escala barra = 50 µm. (D) coloração imuno-histoquímica de macrófagos THP-1 para o marcador para macrófagos CD68. Vermelho, CD68. Azul, DAPI. Barra de escala = mistura 5 µm. (E) THP-1-colágeno no orifício ferido do HGE no início do tratamento de PMA. Barra de escala = 25 µm. (F) THP-1 células diferenciadas em macrófagos (setas vermelhas) a 72 h após o tratamento de PMA. Barra de escala = 25 µm. (G) THP-1 células expressa marcador para macrófagos CD68. Linha tracejada amarela indica que a área do buraco ferido na barra H & E. escala = 100 µm. vermelho, CD68. Azul, hoechst 33342. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: caracterização de iGTE. Toda montagem imuno-histoquímica para CD14 (verde) e vimentina (vermelha) foi realizada na iGTE. Imagens de Z-series (C) capturadas através de iGTE (416 µm no total. Painel 1 é a primeira seção que LSM digitalizado, e painel 25 é a última. O intervalo é de aproximadamente 16.64 µm entre seções). Seção representativa (A) (n º 17 das imagens Z-series), orthophoto e imagem 3D do Z-pilha (B) apresentou a distribuição 3D de vimentina e CD14 --positivo THP-1 macrófagos no buraco simulando uma ferida no iGTE. A posição de varredura do LSM em iGTE é indicada em (D) e o canto superior esquerdo em (A). Barra de escala = 50 µm. amarelo linhas pontilhadas indicam a área do buraco ferido em iGTE. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Este protocolo é baseado em métodos de criação de equivalentes de tecido gengival e equivalentes de tecido adiposo subcutâneos descritos por anteriores relatórios^8,21,22. Embora este seja um método simples e fácil, algumas etapas requerem atenção especial. Por exemplo, a mistura de colágeno deve ser mantida no gelo até o uso para evitar a formação de gel na solução. Ao adicionar a mistura de colágeno para a inserção de cultura, certifique-se que a solução foi injetada no centro da pastilha para evitar a formação de um gel tendencioso (como na Figura 3B). Perfurar um buraco no GTE também requer habilidade. O perfurador de tecido às vezes não pode escolher o tecido se o tecido está muito molhado. Um sistema de biópsia de tecido ou um par de pinças seria útil; no entanto, as dimensões do local ferido serão muito alteradas. Também é possível usar uma seringa com agulha afiada para injetar a mistura de célula-colágeno THP-1 sem perfurar um furo (certifique-se que o gel não entupir a agulha).

A limitação desse método é que ele é incapaz de representar perfeitamente os fenômenos biológicos complexos de gengivite e periodontite, porque iGTE não possui vasos sanguíneos, células neuronais e outras células do sistema imunológico, e a inflamação não é causada pelo interações hospedeiro-biofilme. No entanto, é o única em vitro gengivite tecido modelo feito por células humanas que parcialmente apresenta a patologia da gengiva inflamatória. O modelo pode ser modificado para ser mais parecido com o verdadeiro gengivite e doença periodontal por 1) co cultivando GTE com biofilme para criar interações hospedeiro-biofilme ou estimular respostas inflamatórias em iGTE usando LPS (os compostos na membrana exterior de Bactérias Gram-negativas e um iniciador inflamatório forte como sugerimos no protocolo), 2) semeando a solução de colágeno-HGF em dentes extraídos para formar complexos de gengiva-dente e observando como inflamação na gengiva influencia tecido duro e 3) usando células epiteliais gengivais humanas para formar a epiderme da GTE e iGTE.

Com os métodos apresentados aqui, GTE e iGTE culturas podem ser usadas como ferramentas versáteis para estudar a cicatrização de feridas, regeneração tecidual, inflamação, interação célula-célula e para potenciais medicamentos tela para gengivite e doença periodontal.

Os autores declaram não haverá conflito de interesses.

Este trabalho foi financiado em parte pela sociedade do Japão para o promoção da ciência (JSPS) subsídio para a investigação científica (26861689 e 17 K 11813). Os autores gostaria de agradecer o Sr. Nathaniel Green para revisão.