Тестирование эффективности фармакологических агентов в модели перикарда целевой доставки в Свиней

We have developed a swine model for the target delivery of pharmacological agents within the pericardial space/fluid. Using this approach, the relative benefits of administered agents on induced atrial fibrillation, relative refractory periods and/or ischemic protection can be investigated.

На сегодняшний день многие фармакологические агенты, используемые для лечения или профилактики аритмий в тех случаях, на открытом сердце создают нежелательные системные побочные эффекты. Например, антиаритмические препараты вводят внутривенно может производить капли в системном давлении в уже нездорового сердца пациента. При проведении процедуры открытого сердца, хирурги часто либо создать небольшой порт или образовывать перикарда колыбель, чтобы создать подходящие поля для работы. Это дает доступ к возможности для целевой доставки фармакологической (антиаритмические или ишемического прекондиционирования агентов) непосредственно в ткани миокарда без нежелательных побочных эффектов.

Мы разработали свиней модель для тестирования фармакологических агентов для целевой доставки в перикардиальной жидкости. В то время как полностью под наркозом, каждое животное инструментальными с помощью катетера Свана-Ганца, а также левого и правого катетеров давления желудочек и времени размещения провода были помещены в правом предсердии придаток и праважелудочек. Медиальная стернотомия Затем был проведен и был создан перикарда колыбели доступа; погружение шагание свинца был помещен в ушке левого предсердия и биполярный шагание свинца был помещен в левый желудочек. Используя программатор и сердечную систему отображения, рефрактерный период атриовентрикулярного узла (AVN), определяли предсердий и желудочков. Кроме того, фибрилляция предсердий (ФП) индукция была произведена с использованием стимулятора и время травы в ФП наблюдалось. Эти измерения проводились до лечения, а также 30 и 60 мин после обработки перикарда. Дополнительные моменты времени были добавлены для отдельных исследований. Сердце затем cardiopleged и реанимирован в рабочем режиме четыре камеры. Измерения давления и функции регистрировали в течение 1 ч после реанимации. Эта модель стратегии лечения позволили нам наблюдать эффекты фармакологических агентов, которые могут уменьшить частоту сердечных аритмий и / или ишемического повреждения, во время и афтер операции на открытом сердце.

В настоящее время в процедурах на открытом сердце, врачи используют антиаритмические и другие средства лечения системно. Тем не менее, это может быть проблематично для многих пациентов, особенно тех, кто уже клинически скомпрометированы. Например, внутривенное лечение может привести к системным перепадами артериального давления или дисфункции почек; Кроме того, они могут создавать анестезии вопросы управления и / или другие долгосрочные побочные эффекты.

Здесь мы создали модель для тестирования эффективности введения фармакологических агентов в перикардиальной пространство. Например, такой подход может быть использован для тестирования антиаритмические препараты, изучение соединений, которые могли бы увеличить сердечную функцию и / или содействие восстановлению миокарда после хирургических вмешательств. Там были наблюдаемые преимущества для целевой доставки лечения в перикардиальной пространство по сравнению с внутривенного введения: например, наша лаборатория показали , что локализованный поставка antiarритмические препараты, такие как метопролол, защищает от частоты аритмий при сведении к минимуму снижение артериального давления ^1. Эта целевая стратегия доставки также обеспечивает возможность введения более высоких координационных концентрации при минимизации системных уровней. Например, высокие уровни внутривенно доставленных концентрации жирных кислот может привести к гемолизу, но экссудативный доставка сводит к минимуму эту проблему ^2.

Это исследование парадигма состоит из трех основных целей , чтобы определить эффективность перикарда доставлены соединений: 1) в месте определения тугоплавких периодов предсердия узла желудочков, предсердий и желудочков, до начала лечения и 30 и 60 мин после обработки; 2) относительное на месте бремени АФ до лечения и 30 и 60 мин после обработки (дополнительные моменты времени часто добавлялись) 3) функциональный анализ сердца после того, как оно было реанимировать ³ вклЛУДИНГ гемодинамический мониторинг, частота сердечных сокращений, сердечный метаболизм (лактата и глюкозы), отбираемых из коронарного синуса, фракция выброса (EF%) и толщину стенки желудочков (см) контролировали каждые 10 мин после реанимации Эта модель стратегии лечения позволило нам наблюдать эффекты фармакологические средства, которые могут снизить частоту сердечных аритмий и / или ишемического повреждения, во время и после операции на открытом сердце или трансплантации.

Этот протокол был утвержден в университете Миннесоты Институциональные уходу и использованию животных комитета.

Рисунок 1. Схема обучения Paradigm Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

1. Хирургическая Подготовка Свиней

1. Администрирование 5-7mg / кг tiletamine / zilazipam в свиней (70-80 кг) с помощью внутримышечной инъекции. Поместите вену катетер уха и управлять 5-7 мг / кг Methohexital с помощью внутривенного доступа. Интубировать животное с интубационной трубкой и проветрить.
2. Deliver изофлуран> 1,2% САХ в смеси домашнего воздуха и кислорода для поддержания хирургической плоскости анестезии. Убедитесь, что животное находится в глубокой плоскости ANESThesia до каких-либо манипуляций, проверяя отсутствие челюсти тона и держать выше минимальной альвеолярной концентрации анестезии для свиней. Начальная анестетик проверка глубины проводится путем обеспечения отсутствия челюстной тона и изофлуран уровни контролируются непрерывно в течение всей процедуры (> 1,5 MAC), чтобы обеспечить глубокую плоскость анестезии.
3. Тщательно доступ к правой наружной яремной и сонной артерии с прижиганием и тупой диссекции. Поместите катетер 8.5F Swan-Ganz во внешнем яремной и раздувать баллон до 1,5 куб. Затем пройти через правое предсердие, в желудочек и через легочную клапана вниз легочной артерии, пока клин давления не ощущается.
4. Дефлятируем воздушный шар и оставить катетер в этом положении. Записать давление в правом предсердии и давление в легочной артерии с помощью баллона. Кроме того, запись клин давления или давления в легких (или если легкие считаются нормальными, то и записать оставилиспытание под давлением).
   Примечание: Этот катетер также позволяет оценки сердечного выброса.
5. Поместите дополнительный 5.0f катетер давлением в баллоне в наружной яремной и в правый желудочек, чтобы непрерывно записывать давления.
6. Поместите катетер давления 5.0f шар в сонной артерии, пролапса через аортальный клапан и поддерживать в левом желудочке. Сбрасывают все катетеры давления с 20 ед / мл физиологического раствора heparanized, подключенного к датчику давления, и записывать все данные под давлением из левого желудочка, правого желудочка (и оценивается сердечный выброс), давление в легочной артерии и давление в правом предсердии.
7. Для периферийного мониторинга, доступ к ветви бедренной артерии путем размещения катетера 18F в режиме реального времени кровяного давления или мониторинга газового состава крови. Запись частоты сердечных сокращений и температуры во время процедуры.
8. Осторожно открыть левую наружную яремную с прижиганием и тупой диссекции. Поместите два гемостаза интродьюсеров 11.0F в juguлар и безопасным с 0 шелковыми швами. Поместите перенацеливаемых катетеры в поручителей.
9. Под контролем методом флюороскопии, место активной фиксации приводит в правом предсердии придаток и вершины правого желудочка.
   Примечание: Фиксация свинец является имплантируется провод, который соединяет сердце имплантированным кардиостимулятором.
10. Connectanalyzer кабели к выводам и тестирование с использованием захвата программиста. Установите параметры в 8В, 0,25 мсек, и установите частоту стимуляции как минимум 10 ударов в минуту выше собственной скорости в то время. Запишите относительный импеданс для каждого провода.
11. Делают медиальной хирургический разрез от мечевидного отростка до около вставки кивательной мышц. Используйте грудины пилу, чтобы удалить переднюю выступ от грудины (килевой кости), чтобы позволить частичное медиальной рассечение грудины. Использование сдвига прорезать остальных частей грудины структуры кости. Рассеките грудины-перикардиальной связки и убрать sternuм.
12. Используйте тупым, чтобы отделить перикарда из плевральной накладок. Сделать медиальной сагиттальный разрез (3-5 см) в перикард и создать перикарда колыбель с четырьмя квадратный узел наложения швов на каждом углу (правый, левый, верхний и нижний участки).
13. Поместите временный биполярный ведущую роль в верхушечной области левого желудочка и место однополярный ныряния временной электрокардиостимуляции свинца в ушке левого предсердия.
14. Эвтаназия осуществляется путем удаления сердца под глубоким наркозом.

2. Подготовка к электрофизиологических мониторингу

1. Система Сердечный Mapping.
   1. Выберите исследование AF в сердечной системы картирования Подключите желудочковой эпикардиальные биполярных стимуляции ведет и эпикарда приводит в ушке предсердия с зажимами к соответствующим настройкам в окне прорыве. Подключите ЭКГ и заземления колодки к системе.
2. Осциллограф и трава Стимулятор.
   1. Подключитебиполярное левого желудочка шагание свинца и однополярной предсердная свинца в коробке отвода к стимулятором Grass, который подключен к осциллографу для электрической проверки.
3. Запрограммированный Электрофизиологическая стимуляции.
   1. Найдите в правом предсердии приводит и правый желудочек приводит в кардиостимулятора Поместите голову программиста телеметрическую над кардиостимулятором. Выберите шагание электрода стимуляции (ПЭУ) исследования и установить параметры для 8V; удалить все параметры пациента. Установите длительность стимуляции установить до 8 импульсов в 400 мс (или 300 мс).

3. В исследовании Ситу

1. Огнеупорный Период: Исследование Paradigm.
   1. Определить предсердный эффективный рефрактерный период (AERP), мерцательная желудочков узел рефрактерного периода (AVNERP) и желудочковая эффективный рефрактерный период (VERP) на исходном уровне, а также на 30 и 60 мин после доставки перикарда соединение / медикаментозного лечения / управления; дополнительные моменты времени могут быть добавлены как DESIRED.
2. Огнеупорный Период: Настройки программатора.
   1. Выброс индуцируют параметр исследования ПЭС до 8 шагов (400 мс или 300 мс), за которыми следует не менее 300 мс стимуляции. Уменьшите шагание до желудочков / предсердии (соответственно) не контракт. Это отмечено от зондирования Шагание ведет; Таким образом, определения относительного рефрактерного периода.

Рисунок 2. EnSiteSystem: AERP, AVNERP и определение VERP Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

3. Определение относительной АФ ношению параметров.
   1. Sustain сердце животного в АФ через 1 мин, позволяют ему оставаться в АФ до 10 мин.: Т.е. до шокируя предсердия с прямыми лопатками на 5 джоулей прекратить AF. ЭльМКМТ AF индукции до 10 раз в каждый момент времени. Обратите внимание, что в данном исследовании. AF определяется как неустойчивый ритм с отсутствием зубца Р.
4. AF Burden: Трава Стимулятор и настройки осциллографа.
   1. Оптимизация параметров для стимулятора Grass поставить 4 Гц с длительностью импульса 2 сек до ушка левого предсердия (LAA) через врезание стимуляцией свинца; проверить это с помощью стандартного осциллографа. Deliver одиночный импульс к LAA, чтобы вызвать AF.

4. Сердце Эксплантация и реанимация (Пересадка модель)

1. Аорте Cannula.
   1. Осторожно рассекают перикард ткани вокруг восходящей аорты и удалить pericardium.Suture две точки (2-3 см друг от друга) от 2,0 Ethibond швом в восходящей части аорты, и администрировать 30000 единиц гепарин внутривенно.
   2. Поместите корня аорты канюлю между точками шовных и зафиксировать аорту. С помощью системы доставки под давлением, удалить тон стилет-коническая и поместите зажим на канюля не позволяя потоку.
2. Кардиоплегии Приготовление.
   1. Администрируйте холодный раствор кардиоплегии Сент-Томас в восходящую аорту под давлением 150 мм / Hg через мешок под давлением. Безопасный оросительный катетер, который прикреплен к кардиоплегии под давлением с 3-ходовым запорным краном на дистальном конце. Закрепите запорный кран корня аорты канюлю, отпустить устойчивый прилив кардиоплегии через катетер и зафиксировать корня аорты канюлю.
3. Кросс-Clamp.
   1. Зажмите нижнюю полую вену с atraumaticclamp 1-2 см как раз превосходит диафрагмы. Зажим восходящей аорты с атравматической под углом лагерь 1-2 см на восходящей аорты превосходит корня аорты канюлю.
4. Кросс-Clamp / кардиоплегии.
   1. Снимите зажим от корня аорты канюли и промойте кардиоплегии при 150 мм рт.ст. / в сторону аортального клапана, закрывая аортального клапана и perfusИНГ коронарные артерии.
   2. Зажим верхней полой вены и сделайте небольшой надрез в легочной артерии, чтобы не более чем герметизировать сердце. После того, как сердце останавливается (асистолией), акциз и удалить сердце из груди и поместить в ванну с холодным буфером Кребса-(~ 3-8 ° C).
5. Реанимация.
   1. Иглу большие сосуды и подготовить сердце с использованием методологии Visible сердца (3). После того, как перфузию сердца достигает 37 ± 5 ° C, восстановление родного синусового ритма, поставляя 34 Дж толчки в желудочки через эпикардиальные электродов патч.

5. In Vitro Study Paradigm

1. Постоянно следить за сердечной функции за 60 мин после реанимации. Непрерывный мониторинг эхокардиографию в 2D-режиме с целью короткой оси: взгляд ЛЖ чуть ниже митрального клапана.
2. Рассчитать толщину и выброс стенки желудочков фракций, каждые 10 мин после реанимации (см ниже).Возьмите образцы из коронарного синуса (1 см) при температуре от -5 мин и каждые 5 мин в течение периода оценки.
3. Мониторинг.
   1. Монитор гемодинамику для левого и правого желудочков, в том числе давления, потоков и изменение объема.
4. Эхокардиография: Выброс фракции.
   1. Поместите трансторакальную эхо-зонд непосредственно на сердце, захватив в середине-папиллярный вид короткой оси. Вычислить фракцию выброса (ФВ%) в рабочем режиме 4-камеры через каждые 10 мин с помощью уравнения: LV End КДО - LV End систолический объем X 100 Объем / LV Конец диастолическое
5. Эхокардиография: левого желудочка Толщина стенки.
   1. Измерение толщины стенки желудочка (см) из окна короткой оси середине папиллярных с интервалом в 10 мин в течение часа пост реанимацию. Измерьте четыре угла левого желудочка с помощью экрана суппорты и взять среднее.
6. Инфаркт Метаболизм.
   1. Поместите steeraBLE катетер в коронарный синус (КС). Образец 1 куб.см от сотовой станции за 5 минут до реанимации и через каждые 5 мин после реанимации в течение 1 часа. Проверьте образцы для лактата и уровни глюкозы; другие газы крови также могут быть оценены.

Эти результаты характерны для данных, которые могут быть собраны с использованием этой целевой модели доставки фармакологических агентов в свиней. Эти данные продемонстрировали заметный рост этих желудочков эффективных огнеупорных периодов (VERP) после инфузии ДГА на месте. Кроме того, данные устанавливает увеличение давления в левом желудочке ДГК по сравнению с контролем в пробирке. Давление LV в ДГА обработанных сердца были значительно выше по сравнению с контролем в нескольких временных точках. Эти данные подтверждает фармакологический окно для тестирования стратегий лечения на месте и в лабораторных условиях .

Рисунок 3. Изменение в желудочке эффективный рефрактерный период (VERP). Желудочке эффективный рефрактерный период (VERP) определяли за 5 мин до перикарда доставки управления AGлор (физиологический раствор) или докозагексаеновой кислоты (ДГК), или ДНА инфузии, в дополнение к 30 и 60 мин после перикардиальной доставки либо лечения или контроля. VERP группы ДГА отклонялись в сторону увеличения по сравнению с контрольной группой . Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4. Давление левого желудочка в 4- х камерная рабочей модели Максимальное давление (мм ртутного столба) определяли каждые 5 мин в течение 60 мин после того, как сердце реанимировали , используя видимые методики сердца. ДГВ и ДГВ инфузии (лечение в течение более 10 мин) обработанные сердца отклонялись, чтобы вызвать первоначальное высокое давление, чем контроль для большинства периода тестирования. Ун-парные Т-тест был завершен FOг каждой временной точке. (*, P = 0,065, +, P = 0,056, †, P = 0,059 ‡ .P = 0,058) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Желудочке эффективный рефрактерный период (VERP) определяли за 5 мин до перикардиальной доставки агента контроля (физиологический раствор) или докозагексаеновой кислоты (DHA), или ДНА инфузии (в течение 10 мин), в дополнение к 30 и 60 мин после перикардиальной доставки либо лечение или контроль. VERP группы DHA отклонялись в сторону увеличения по сравнению с контрольной группой.

Максимальное давление (мм ртутного столба) определяли через каждые 5 мин в течение 60 мин после того, как сердце реанимировали, используя видимые методики сердца. ДГВ и ДГВ инфузионные лечение сердца отклонялись, чтобы вызвать первоначальное высокое давление, чем контроль для большинства периода тестирования. Маркированного парные Т-тест был завершен в течение каждой временной точке. (*, P = 0,065, +, P = 00,056, †, P = 0,059 ‡ .P = 0,058)

Здесь мы продемонстрировали уникальный подход к проверке потенциальной эффективности целевых соединений доставленных в перикардиальной пространство. Это исследование парадигма может быть использована для проверки текущего рынка выпустили фармацевтические продукты или экспериментальные соединения, обеспечивая тем самым прямое применение поступательные в различных клинических условиях. В рамках этой стратегии лечения существуют две основные клинические приложения для доставки лекарственных средств к перикарда пространстве: 1) на открытом сердце или минимально инвазивных хирургических процедур сердца; и 2) трансплантация сердца и сохранение органа. Кроме того, это исследование парадигма имеет несколько параметров , которые могут быть проанализированы , чтобы лучше понять прогностическую эффективность самих фармацевтических агентов в этих описанных стратегий лечения на месте параметры включают в себя:. 1) относительные тугоплавкие периоды AVN, предсердия и / или желудочков ; 2) определение относительной восприимчивости АФ / бремени; и 3) hemodynam. IC и частота сердечных сокращений ответы In Vitro параметры включают в себя: 1) относительные фракции выброса; 2) толщина стенки ЛЖ ответы; 3) метаболические изменения сердца; и 4) гемодинамика и изменения частоты сердечных сокращений. Исторические данные мы приводим здесь демонстрируют выбор этих описанных параметров. Наиболее заметные поступательные аспекты этих исследований для открытого или минимально инвазивных процедур сердца, а также закупок органа перед трансплантацией.

Более конкретно, сформированная перикарда колыбель помещается во время операции на открытом сердце, либо минимально инвазивной или после полного стернотомией, обеспечивает важную возможность управлять локализованными соединений: то есть, при более высоких концентрациях, чем можно вводить внутривенно и / или без системной стороне последствия. Для получения еще менее инвазивных кардиологических процедур (например, subxyphoid доступа), маленький надрез в перикард , который также может быть использован в качестве канала для доставки целевого лекарственного средства. Myocardial раздражительность / обида значительно возрастает в то время как сердце манипулируют во время различных сердечных процедур. Лечение аритмий и / или функционального дефицита напрямую может быть полезным и легким способом для улучшения результатов лечения пациентов.

Подобные приложения могут быть легко выполнены в ходе процедур восстановления органов, например, предобусловливание сердце до закупок. Крайне важно, что миокард оптимально выдерживается в течение сложной процедуры, которая включает в себя дефибрилляции сердца обратно в нормальный синусовый ритм после трансплантации. Другими словами, есть повышенный риск предсердных и желудочковых тахикардии и / или фибрилляции сердца во время закупок и после трансплантации. Кроме того, важно, чтобы сохранить другие органы донора в процессе закупок, где периферическом введении лекарства могут поставить под угрозу эти органы. Например, вводят внутривенно метопролола может привести к острой почечной dysfunctiкогда дается для лечения аритмий во время хирургических процедур / Закупки ^1. В настоящее время, сердце должно быть пересажены получателю в течение примерно 4-6 ч. Это ограничение времени остается одним из факторов, ограничивающих в выполнении сердечных трансплантаций сегодня. Таким образом, использование экспериментальной парадигмы мы описываем здесь может стать важным средством для оценки соединений, которые могут быть полезными в продлении приемлемого диапазона ишемического времени после восстановления органов.

Ранее собранные данные из нашей лаборатории, использующей эту парадигму исследования показали, что это может быть весьма полезным для получения нескольких параметров, которые могут быть проанализированы, чтобы предсказать эффективность фармацевтических агентов себя в рамках описанной стратегии лечения. Более конкретно, изучение эффективных огнеупорных периодов следующие перикарда доставлены DHA, ДГА вливания, метопролол и другие препараты на месте было важно , чтобы понять их отношение Аntiarrhythmic потенциал для этого метода целевой доставки. Пролонгирования эффективного рефрактерного периода и / или снижения скорости проводимости в пределах AVN часто может прекратить определенные виды аритмий ^4. Здесь мы продемонстрировали заметный рост этих эффективного рефрактерного периода после инфузии DHA, а также после доставки метопролола по сравнению с контролем (ранее опубликованной ^1. Кроме того, он представляет интерес для определения относительной нагрузки AF из - за его отношения к вероятность аритмической потенцирования у данного пациента, здесь мы также отметили изменения в этом ответе следующие фармакологического прекондиционирования.

Исследование клинически значимых клинических параметров после реанимации переобусловленного сердца также дает поступательные идеи относительно потенциальных преимуществ этой фармакологической администрации на реципиента трансплантата. На сегодняшний день с помощью этой общей цели поставки / preconditioning исследовательский подход, наша лаборатория исследовала различные клинически вводимых агентов, а также новые фармакологические соединения, которые могут минимизировать аритмий или ишемического повреждения сердца (метопролол, амиодарон, лидокаин, дельта опиоидов, омега-3 жирных кислот, ursodyoxycholic кислоты, lipovenous , докозагексаеновой кислоты и / или их комбинации). Следует также отметить , что эти агенты также могут быть введены в виде пост-кондиционирующих агентов в аспекте в пробирке протоколов , описанных в пределах. Наблюдая за гемодинамику в пробирке, представительные данные для давления низкого напряжения заметно выше , в сердцах , которые были обработаны с DHA или инфузии DHA по сравнению с контролем транспортного средства. Кроме того, наша лаборатория наблюдаемые изменения фракции выброса и толщины стенки ЛЖ в обработанных сердцах по сравнению с контрольной группой. Клинические параметров / факторы, которые могут быть изучены очень важны, так чтобы оценить эффективную функцию и наблюдать начало отека. Furtее образцы из коронарного синуса также могут быть получены для анализа различных метаболических факторов: например, лактат и уровни глюкозы. Эти параметры являются обязательными для оценки относительного сердечного метаболизма и / или общую функцию сердца. Например, повышенные уровни лактата часто свидетельствует о ацидоза, в свою очередь, приводит к плохой сердечной функции.

Данные, которые мы получили от таких исследований продемонстрировали жизнеспособную экспериментальную модель (с известными ограничениями из-за острого характера исследования) для определения целесообразности использования либо клинически доступных препаратов или экспериментальных агентов для перикарда стратегии целевой доставки. Мы считаем, что следственный подход, который мы описываем здесь хорошо воспроизводим и обеспечивает новые идеи относительно цели и системных преимуществ доставки различных фармакологических агентов внутри перикарда пространства. Результаты можно получить в таких разработанных протоколов может иметь важTant трансляционные последствия как для сердечно-сосудистой хирургии и трансплантации сердца.

The authors have nothing to disclose

We would like to give a big thanks to the Visible Heart Laboratory staff and students that have helped with this project: Nate Menninga, Lars Mattison and Megan Schmidt.