豚に心膜ターゲット・デリバリー・モデルでの薬剤の有効性をテストします

We have developed a swine model for the target delivery of pharmacological agents within the pericardial space/fluid. Using this approach, the relative benefits of administered agents on induced atrial fibrillation, relative refractory periods and/or ischemic protection can be investigated.

今日まで、多くの薬理学的薬剤は、望ましくない全身性の副作用を作成し、オープン心臓の場合に不整脈を治療または予防するために使用されます。例えば、静脈内に投与抗不整脈薬は、すでに損なわ心臓病患者における全身の圧力の低下を生成することができます。オープンハートの手順を実行している間、外科医は、多くの場合、どちらかの小さなポートを作成したり、操作するのに適したフィールドを作成するには、心膜クレードルを形成することになります。望ましくない副作用なしに心筋組織への直接の標的薬理学的デリバリー（抗不整脈や虚血プレコンディショニング剤）のためにこのアクセ​​ス利回りの機会。

私たちは、心嚢液内の標的送達のための薬理学的薬剤をテストするための豚のモデルを開発しました。完全に麻酔をかけている間、各動物は、左と右心室圧カテーテルと同様にスワンガンツカテーテルが装備され、ペーシングリードは、右心耳と右に配置しました心室。内側胸骨切開は、その後行われたと心膜アクセスクレードルが作成されました。プランジ​​ペーシングリードは、左心耳内に配置し、双極ペーシングリードは、左心室の中に入れました。プログラマと心臓マッピングシステム、房室結節（AVN）の不応期を利用して、心房と心室を決定しました。また、心房細動（AF）の誘導が観察されたAFで草刺激と時間を利用して製造しました。これらの測定は治療前と同様に、心膜処理後30分および60分に行きました。追加の時間点は、選択された研究のために添加しました。次に心臓をcardioplegedと4室の作業モードで生き返らせました。圧力測定値と機能は、蘇生後1時間記録しました。この処理モデルは中に、私たちは心不整脈および/または虚血性損傷の発生率を減少させることができる薬理学的薬剤の効果を観察することができ戦略とAFター開心術。

現在、オープンハートの手順で、臨床医は全身抗不整脈および他の治療薬を利用します。しかし、これは多くの患者、すでに臨床的に危険にさらされている特に人のために問題となる可能性があります。例えば、静脈内治療は、血圧または腎機能障害における全身低下をもたらすことができます。さらに、彼らは麻酔管理の問題および/または他の長期的な副作用を作成することができます。

ここでは、心膜腔への薬剤の投与の有効性を試験するためのモデルを作成しました。例えば、この方法は、心臓機能の増大および/または外科手術後の心筋の回復を促進する可能性の化合物を研究し、抗不整脈薬を試験するために利用することができます。静脈内投与対心膜腔への治療のターゲット配信に利益が観察されている： 例えば 、私たちの研究室ではウパスの木の局所的送達を実証しました血圧¹の減少を最小限に抑えながら、例えばメトプロロールのようなリズミカルな薬剤は、不整脈の発生に対して保護的です。この標的送達戦略はまた、全身レベルを最小限に抑えながら、高い局所濃度を投与するための機会を提供します。例えば、脂肪酸の静脈内送達濃度の高いレベルは、溶血を生じ得るが、心膜送達はこの懸念^2を最小^にします 。

この研究のパラダイムは、心膜配信化合物の有効性を決定するために3つの主要な目的で構成されています：1） その場での心房心室ノードの不応期の決意、心房と心室に 、治療と30と60分後の処理の前に; 2）相対その場で治療し、30および60分後処理前のAF負担（追加の時点は、多くの場合、追加された）は、心臓の3）機能分析は³株式会社を生き返らされた後、血行動態モニタリング、心拍数をluding、冠状静脈洞、駆出率（EFの％）と、心室壁の厚さ（cm）からサンプリング心臓代謝（乳酸およびグルコース）は、この治療戦略のモデルは、私たちはの効果を観察することができ、すべての10分後に蘇生を監視し心臓切開手術または移植中および後に、心臓不整脈および/または虚血性損傷の発生率を減少させることができる薬理学的薬剤。

このプロトコルは、ミネソタ州制度動物実験委員会の大学によって承認されました。

研究パラダイムの図1.図は、 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

豚の1外科の準備

1. 筋肉内注射を介して豚（70〜80キロ）にチレタミン/ zilazipamの5-7mg / kgで投与します。耳静脈カテーテルを配置し、静脈内アクセスを経由して5-7ミリグラム/キログラムメトヘキシタールを管理します。気管内チューブを動物に挿管し、換気してください。
2. 麻酔の外科的平面を維持するために、家の空気と酸素の混合物で> 1.2％イソフルランMACを提供します。動物がANESTの深い面内にあることを確認しますhesia顎音の不在を確認し、豚の最小肺胞内濃度の上に麻酔を維持することによって、任意の操作の前に。初期の麻酔深度チェックが顎トーンとイソフルランのレベルが存在しないことを保証することにより行われているが、麻酔の深い面を確保するための手順（> 1.5 MAC）を通して連続的に監視されています。
3. 焼灼し、鈍的切開と右外頸静脈および頸動脈を慎重にアクセスします。外頸静で8.5Fスワンガンツカテーテルを置き、1.5 ccのバルーンを膨らませます。ウェッジ圧力が感じられるまで続いて右心房を通って、心室に肺動脈ダウン肺動脈弁を横断。
4. バルーンを収縮し、この位置にカテーテルを残します。バルーンを用いて右心房圧および肺動脈圧を記録します。さらに、肺内のウェッジ圧力または圧力を記録（または肺が正常とみなされる場合には、また左記録トライアル圧）。
   注：このカテーテルはまた、心拍出量の推定を可能にします。
5. 継続的に圧力を記録するために、外部頸静脈に、右心室に追加5.0Fバルーン圧力カテーテルを配置します。
6. 大動脈弁を通して5.0Fバルーン圧力頸動脈内カテーテル、脱出を置き、左心室に維持します。圧力変換器に接続された20単位/ ml heparanized食塩水ですべての圧力カテーテルをフラッシュし、そして左心室からすべての圧力データを記録し、右心室、肺動脈圧および右心房圧（および心拍出量を推定しました）。
7. 周辺監視は、リアルタイム血圧または血液ガス監視のため18Fカテーテルを配置することにより、大腿動脈の枝にアクセスします。手順中のレコードの心拍数と温度。
8. 焼灼し、鈍的切開で左外頚に慎重にアクセスします。 juguで2 11.0F止血導入器を配置LARと0絹縫合糸で固定します。イントロデューサで操縦可能なカテーテルを配置します。
9. 透視下では、プレースアクティブ固定は右心耳と右心室の頂点につながります。
   注：固定リードが植え込まれたペースメーカーに心を接続する外科的に移植ワイヤです。
10. プログラマを利用キャプチャするためのリードとテストにConnectanalyzerケーブル。 8V、0.25ミリ秒の持続時間にパラメータを設定し、そのときの固有速度よりも10拍以上の最低ペーシングレートを設定します。各リードの相対インピーダンスを記録します。
11. 胸鎖乳突筋筋の挿入近くに剣状突起から内側外科的切開を行います。胸骨の部分内側切開を有効にするには、胸骨（キールの骨）から前方突起を除去するために、胸骨のこぎりを使用します。胸骨骨構造の残りの部分を切断せん断を使用してください。胸骨心膜靭帯を解剖し、sternuを撤回メートル。
12. 胸膜ライニングから心膜を分離するために鈍的切開を使用してください。心膜に内側矢状切開（3-5センチ）を作成し、各コーナーに4本結びの縫合糸と心膜クレードルを作成（左、右、上位および下位のサイト）。
13. 左心室の先端領域に一時的な双極リードを置き、左心耳にユニポーラプランジ一時的ペーシングリードを配置します。
14. 安楽死は、除去することによって、深い麻酔下で心臓を達成されています。

電気生理学的モニタリングのための2.準備

1. 心臓マッピングシステム。
   1. ブレイクアウトボックスで適切な設定にワニ口クリップと心耳に心室心外膜双極ペーシングリード及び心外膜リード線を接続し、心臓マッピングシステムのAF研究を選択します。システムにEKGと接地パッドを接続します。
2. オシロスコープと草刺激。
   1. 接続します電気的検証のためのオシロスコープに接続されている草の刺激にブレイクアウトボックス内のバイポーラ左心室ペーシングリードとユニポーラ心房リード。
3. プログラムされた電気生理学的刺激。
   1. ペースメーカーの上にペースメーカー場所にプログラマテレメトリヘッドを右心房リードと右心室リード線を固定します。ペーシング電極刺激（PES）の研究を選択し、8Vにパラメータを設定します。すべての患者パラメータを削除します。 400ミリ秒（または300ミリ秒）で8パルスに設定さペーシング継続時間を設定します。

その場の研究3.

1. 耐火期間：研究パラダイム。
   1. ベースライン時に心房有効不応期（AERP）、心房心室ノード応期（AVNERP）および心室有効不応期（VERP）を決定し、化合物/薬剤/制御処理の30および60分後心膜配信で。付加的な時点は、DESのように添加してもよいですIRED。
2. 耐火期間：プログラマーセッティング。
   1. 300ミリ秒ペーシングの最小に続いて8歩（400ミリ秒または300ミリ秒）にPES研究パラメータを誘導バースト。心室/心房までペーシングを減らして（それぞれ）に収縮することができません。これは、ペーシングリードのセンシングから注目されます。このように相対不応期を決定します。

図2. EnSiteSystem：AERP、AVNERPとVERPの決意が、 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

3. パラメータ：相対AF負担の決意。
   1. 1分後、それは最大10分間AFしたまま放置し、AFでの動物の心を維持する： すなわち 、AFを終了する5ジュールでの直接のパドルで心房ショックを与える前に。エル各時点での10回までicit AF誘導。本研究では、注意してください。 AFは、P波が存在しないと不安定なリズムとして定義されます。
4. AF負担：草刺激とオシロスコープの設定。
   1. プランジ​​ペーシングリード線を経由して左心耳（LAA）に2秒のパルス持続時間で4ヘルツを配信するために草の刺激のためのパラメータを最適化します。標準的なオシロスコープによってこれを確認。 AFを誘導するために、LAAに単一パルスを提供します。

4.ハート植と蘇生（移植モデル）

1. 大動脈ルートカニューレ。
   1. 慎重に上行大動脈の周りの心膜組織を解剖し、上行大動脈で2.0 Ethibond縫合糸のpericardium.Suture 2点（2〜3センチメートル離れて）を削除し、静脈内にヘパリンの30,000台を管理します。
   2. 縫合点間の大動脈ルートカニューレを配置し、大動脈を確保。加圧された送達系で、Tを取り除きます彼は、ベベルスタイレットと流れを可能にしませカニューレ上のクランプを配置します。
2. 心の準備。
   1. 加圧されたバッグを経由して150ミリメートル/ HGの圧力下行大動脈に冷たいセントトーマス心臓麻痺液を管理します。遠位端の3ウェイストップコックで加圧し心に取り付けられている灌漑カテーテルを固定します。 、大動脈ルートカニューレにストップコックを固定カテーテルを通して心臓麻痺の着実なフラッシュを解放し、大動脈ルートカニューレに固定します。
3. クロスクランプ。
   1. ダイアフラムにだけ優れたatraumaticclamp 1〜2センチメートルと下大静脈をクランプします。大動脈ルートカニューレに優れた上行大動脈に非外傷性の角度を付けキャンプ1〜2センチメートルと上行大動脈をクランプします。
4. クロスクランプ/心臓麻痺。
   1. 大動脈弁とperfusを閉じ、大動脈ルートカニューレからクランプを外し、150ミリメートル/大動脈弁に向かってHgで心臓麻痺をフラッシュ冠状動脈をる。
   2. 以上の心を加圧しないように、上大静脈をクランプし、肺動脈内の小さな切開を行います。心が冷たいクレブス - ヘンゼライト緩衝液の浴中（不全収縮）、消費税を停止し、胸や場所から心臓を削除されたら（〜3-8°C）。
5. 蘇生。
   1. 大血管にカニューレを挿入し、可視ハートの方法論を利用して心の準備（3）。灌流心臓は37±5℃に達すると、心外膜パッチ電極を介して心室に34 Jショックを提供することにより、ネイティブの洞調律を回復。

インビトロ研究パラダイム5.

1. 連続して60分後に蘇生のための心機能を監視します。ちょうど僧帽弁下のLVビュー：連続短軸ビューと2Dモードでの心エコー検査を監視します。
2. 心室壁の厚さと排出画分毎、10分後の蘇生を算出する（下記参照）。評価期間中に-5分および5分毎に冠状静脈洞（1 CC）からのサンプルを取ります。
3. モニタリング。
   1. 圧力、フローおよび体積変化を含む左心室と右心室の両方のための血行動態を監視します。
4. 心エコー検査：駆出率。
   1. 半ば乳頭短軸ビューをキャプチャし、心臓に直接経胸壁エコープローブを配置します。式を用いて、4室の作業モードで10分ごとに駆出率（EF％）を算出します。LV拡張末期容積 - LVエンド収縮期容積X 100 / LV拡張末期容積
5. 心エコー検査：左心室壁の厚さ。
   1. 時間後の蘇生のための10分間隔で半ば乳頭短軸窓から心室壁の厚さ（cm）を測定します。画面キャリパーを使用して、左心室の四隅を測定し、平均値を取ります。
6. 心筋代謝。
   1. steeraを配置冠状静脈洞（CS）でBLEカテーテル。蘇生の前にCS 5分からのサンプル1 ccで、1時間ごとに5分後に蘇生。乳酸およびグルコースレベルのためのサンプルをテストします。他の血液ガスも評価することができます。

これらの結果は、ブタにおける薬剤のこの目標配信モデルを利用して収集することができるデータの特徴です。このデータは、 その場での DHAの注入後、これらの心室の有効不応期（VERP）の顕著な増加を示しました。また、データは、 インビトロでの対照と比較して、DHAの左心室圧の上昇を確立します。 DHA処置した心臓におけるLV圧は、いくつかの時点で対照と比較して有意に高かったです。このデータは、in situおよびin vitroで治療戦略をテストするための薬理学的なウィンドウを検証します。

心室有効不応期（VERP）図3.変更。心室有効不応期（VERP）は、制御AGの心膜送達される前に5分を決定しました耳鼻咽喉科の治療または制御のいずれかの30と60分後に心膜の配信に加えて、（生理食塩水）またはドコサヘキサエン酸（DHA）、またはDHAの注入、。 DHAグループのVERPは、対照と比較して増加に向けて推移しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

心臓が見える心臓方法論を使用して生き返らせた後、図 4-商工会議ワーキングモデル最大圧力（mmHgで） で左心室の 4 圧力は、60分間、5分ごとに測定しました。 DHAとDHAの注入（10分間にわたって処理した）で処理した心臓は、試験期間の大半をコントロールよりも初期のより高い圧力を誘発するために推移しました。未対応のあるt検定をfoが完了しました各時点rを。 （*、P = 0.065、+、P = 0.056、†、P = 0.059‡.P = 0.058） 。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

心室有効不応期（VERP）は、いずれかの30と60分後に心膜配信に加えて、（10分以上）制御​​剤（生理食塩水）またはドコサヘキサエン酸（DHA）、またはDHA注入の心膜送達される前に5分を決定しました治療または制御。 DHAグループのVERPは、対照と比較して増加に向けて推移しました。

心臓が見える心臓方法論を用いて生き返らせた後、最大圧力（mmHgで）は、60分間5分毎に測定しました。 DHAとDHA点滴処置心臓は、試験期間の大半のためのコントロールよりも初期のより高い圧力を誘発するために推移しました。未対応のあるt検定は、各時点で完了しました。 （*、P = 0.065、+、P = 00.056、†、P = 0.059‡.P = 0.058）

ここでは、心膜空間にターゲット配信化合物の潜在的有効性をテストするためのユニークなアプローチを実証しました。パラダイムは、現在の市場をテストするために利用することができる。この研究では、このように様々な臨床設定に直接翻訳アプリケーションを提供し、医薬品または実験化合物をリリースしました。この治療戦略の中で心膜腔に医薬品を供給するための2つの主要な臨床応用があります：1）オープン心臓や低侵襲性の心臓の外科的処置は、および2）心臓移植や臓器保存。また、本研究のパラダイムは、より良いこれらの記載の治療戦略の中の薬剤そのものの予測有効性を理解するために分析することができ、複数のパラメータがあり、その場でのパラメータが含まれる：1）AVN、心房および/ ​​または心室の相対不応期; 2）相対AF感受性/負担の決意。および3）hemodynam。ICと心拍数応答のin vitroのパラメータが含まれます：1）相対駆出率を、 2）LV壁厚応答。 3）心臓代謝の変化;そして4）血行動態と心拍数の変化。私たちがここで紹介する過去のデータは、これらの記述されたパラメータの選択を示しています。これらの研究の最も注目すべき翻訳の側面が開放または低侵襲性心臓手順だけでなく、移植前の臓器調達のためのものです。

静脈内および/または全身サイドずに投与することができるよりも高い濃度で、すなわち：具体的には、心臓切開手術中に低侵襲性または全胸骨切開、次のいずれかに配置形成された心膜クレードルは、ローカライズされた化合物を投与するための重要な機会を提供します効果。低侵襲心臓処置（ 例えば 、subxyphoidアクセス）のために、小さな切開はまた、標的薬物送達のための導管として使用することができる心膜内に形成されています。 MYOC心臓は、様々な心臓処置中に操作されながらardial過敏性/侮辱を大幅に向上されています。不整脈および/または機能障害のために治療することは、直接患者の転帰を改善するために有益で簡単な手段であってもよいです。

同様のアプリケーションを簡単に先立っ調達に心を慣らし、例えば、臓器の回復のための手順の間に実行することができます。心筋が最適移植後正常洞調律に戻す心臓除細動が含まれる複雑な手順のために調整されることが重要です。換言すれば、心臓調達中および移植後の心房および心室頻脈および/または細動のリスクが増加しています。また、末梢投与された薬物は、これらの臓器を損なう可能性が調達プロセス、中にドナーの他の器官を維持することが重要です。例えば、静脈内に投与メトプロロールは、急性腎もたらし得るdysfuncti外科的処置中に不整脈を治療するために与えられたときに/ ^1を調達。現在、心臓は約4-6時間以内にレシピエントに移植する必要があります。この時間制約は、今日、心臓移植を行う際の制限要因の一つとして残っています。このように、我々はここで説明する実験的なパラダイムを採用すること、臓器の回復後の虚血時間の許容範囲を延長において有益であり得る化合物を評価するための重要な手段である可能性があります。

この研究のパラダイムを利用する我々の研究室からの以前に収集されたデータは、それが記載されている治療戦略の中の薬剤自体の有効性を予測するために分析することができる複数のパラメータを得るために非常に有用であり得ることを実証しました。具体的には、心膜配信DHA、DHA注入後の効果的な不応期を勉強し、 その場でメトプロロールおよび他の薬剤は、そのαを理解することがとても重要でしたこの目標の送達方法にntiarrhythmicの可能性。効果的な不応期を延長および/ ​​またはAVN内のコンダクタンス速度を低減することがしばしば不整脈⁴の特定の種類を終了することができます。ここでは、同様に制御（以前に公開され^、1に比べて、メトプロロールを提供した後、DHAの注入後、これらの有効不応期の顕著な増加を示した。また、それが原因との関係の相対的なAFの負担を決定するために重要です所与の患者における不整脈増強のための確率は、ここで我々はまた、薬理学的プレコンディショニング後にこの応答の変化を指摘しました。

プレコンディショニングの心臓の蘇生後の臨床的に関連する臨床パラメーターの調査はまた、移植レシピエントに、この薬理学的管理の潜在的な利点についての翻訳洞察力を提供します。今日まで、この全体目標配信/ preconditを使用して、研究アプローチをioning、私たちの研究室では、臨床的に投与された薬剤の様々なだけでなく、心臓（メトプロロール、アミオダロン、リドカイン、​​デルタオピオイド、オメガ3脂肪酸、ursodyoxycholic酸、lipovenousに不整脈や虚血性損傷を最小限に抑えることができる、新規な薬理学的化合物を調査しています、ドコサヘキサエン酸および/またはこれらの組合せ）。また、これらの薬剤はまた内に記述プロトコルインビトロ態様でポストコンディショニング剤として投与することができることに留意すべきです。 in vitroでの血行動態を観察し、LV圧のための代表的なデータは、車両のコントロールと比較してDHAまたはDHAの点滴で治療されている心の中で顕著に高くなっています。また、私たちの研究室では、対照と比較して処置した心臓における駆出率と左心室壁の厚さの変化を観測しています。研究することができる臨床パラメータ/係数は、非常に効果的機能を評価し、浮腫の発症を観察することが重要です。 Furt例えば 、乳酸およびグルコースレベル：彼女は、冠状静脈洞からのサンプルはまた、様々な代謝要因の分析のために得ることができます。これらのパラメータは、相対的な心臓代謝および/または全体的な心機能を評価することが不可欠です。例えば、増加した乳酸レベルが悪く、心機能をもたらす順番に、しばしばアシドーシスの指標です。

我々はそのような研究から得られているデータは、心膜、ターゲットデリバリー戦略のために臨床的に利用可能な薬物または実験薬剤のいずれかを利用しての実用性を決定するために（ための研究の急性性質の指摘制限あり）実行可能な実験モデルを実証しました。我々はここで説明する調査手法は高い再現性で、ターゲットと心膜空間内の様々な薬理学的薬剤の送達の全身メリットに比べて新たな洞察を提供することを検討してください。結果の1はimporを持つことができ、そのような設計されたプロトコルで取得することができます心臓手術や心臓移植の両方のためのタント翻訳含意。

The authors have nothing to disclose

We would like to give a big thanks to the Visible Heart Laboratory staff and students that have helped with this project: Nate Menninga, Lars Mattison and Megan Schmidt.