Testando a eficácia de agentes farmacológicos em um Delivery Model Pericárdica alvo na Suína

We have developed a swine model for the target delivery of pharmacological agents within the pericardial space/fluid. Using this approach, the relative benefits of administered agents on induced atrial fibrillation, relative refractory periods and/or ischemic protection can be investigated.

Até à data, muitos agentes farmacológicos usados ​​para tratar ou prevenir arritmias em casos de coração aberto criam efeitos secundários sistémicos indesejados. Por exemplo, antiarrítmicos administrados por via intravenosa pode produzir gotas na pressão sistémica no paciente cardíaco já comprometido. Durante a execução de procedimentos de coração aberto, cirurgiões, muitas vezes, quer criar um pequeno porto ou formar uma base de pericárdio para criar domínios adequados para a operação. Obt-se de oportunidades de acesso para entrega alvo farmacológico (agentes anti-arrítmicos ou de pré-condicionamento isquémico) directamente para o tecido do miocárdio sem efeitos secundários indesejados.

Nós desenvolvemos um modelo suíno para testar agentes farmacológicos para a entrega alvo dentro do fluido pericárdico. Enquanto totalmente anestesiado, cada animal foi instrumentado com um cateter de Swan-Ganz, bem como cateteres pressão do ventrículo esquerdo e direito, e leads de estimulação foram colocados no apêndice atrial direito e do direitoventrículo. A esternotomia medial foi então realizada e um berço de acesso pericárdio foi criado; uma vantagem de imersão de estimulação foi colocado na aurícula esquerda e um eletrodo de estimulação bipolar foi colocado no ventrículo esquerdo. Utilizando um programador e um sistema de mapeamento cardíaco, o período refratário do nódulo atrioventricular (AVN), foi determinada átrios e ventrículos. Além disso, a fibrilação atrial (FA) indução foi produzida utilizando um estimulador Grass e tempo em FA foi observado. Estas medidas foram realizadas antes do tratamento, bem como 30 min e 60 min após o tratamento pericárdico. pontos de tempo foram adicionados para estudos selecionados. O coração foi então cardiopleged e reanimado em um modo de trabalho de quatro câmaras. medições e função de pressão foram registrados durante 1 h após a reanimação. Este modelo estratégia de tratamento permitiu observar os efeitos de agentes farmacológicos que podem diminuir a incidência de arritmias cardíacas e / ou dano isquêmico, durante e after cirurgia de coração aberto.

Actualmente procedimentos de coração aberto, os médicos utilizam agentes de tratamento anti-arrítmicos e outras sistemicamente. No entanto, isso pode ser problemático para muitos pacientes, especialmente aqueles que já estão comprometidos clinicamente. Por exemplo, tratamentos intravenosos pode resultar em quedas na pressão sanguínea sistémica ou disfunção renal; Além disso, eles podem criar problemas de gestão de anestesia e / ou outros efeitos colaterais a longo prazo.

Aqui criámos um modelo para testar a eficácia de administração de agentes farmacológicos para o espaço pericárdico. Por exemplo, esta abordagem pode ser utilizada para testar fármacos antiarrítmicos, estudando os compostos que possam aumentar a função cardíaca e / ou promover a recuperação do miocárdio após procedimentos cirúrgicos. Foram obtidos benefícios observados para a entrega alvo de tratamentos para o espaço pericárdico contra a administração intravenosa: por exemplo, o nosso laboratório demonstrou que a entrega localizada de antiardrogas rítmicos, tais como metoprolol, é protectora contra a incidência de arritmias, minimizando a redução da pressão arterial ^1. Esta estratégia de entrega de destino também oferece a oportunidade para administrar concentrações focais maiores, minimizando os níveis sistêmicos. Por exemplo, elevados níveis de concentrações entregues por via intravenosa de ácidos gordos podem resultar em hemólise, mas a entrega pericárdico minimiza esta preocupação ^2.

Este paradigma estudo consiste em três grandes objectivos para determinar a eficácia de pericárdio entregues compostos: 1) a determinação in situ dos períodos refractários do nó ventricular atrial, os átrios e ventrículos, antes do tratamento e 30 e 60 min após o tratamento; 2) a relação da carga AF situ antes do tratamento e 30 e 60 de tratamento min post (timepoints adicionais foram muitas vezes adicionados) 3) análise funcional do coração após ter sido reanimado ³ including monitorização hemodinâmica, freqüência cardíaca, o metabolismo do coração (lactato e glicose), amostrados no seio coronário, a fração de ejeção (EF%) e espessura da parede ventricular (cm) monitorado a cada 10 min pós reanimação Este modelo estratégia de tratamento nos permitiu observar os efeitos da agentes farmacológicos que podem diminuir a incidência de arritmias cardíacas e / ou dano isquêmico, durante e após a cirurgia de coração aberto ou transplante.

Este protocolo foi aprovado pela Universidade de Minnesota Institutional Animal Care e do Comitê Use.

Figura 1. Diagrama de Estudo Paradigm Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Preparação cirúrgica do Swine

1. Administrar 5-7mg / kg de tiletamina / zilazipam aos porcos (70-80 kg) por meio de injecção intramuscular. Colocar um cateter na veia da orelha e administrar 5-7 mg / kg metoexital através do acesso intravenoso. Entubar o animal com tubo endotraqueal e ventilar.
2. Deliver isoflurano> 1,2% MAC em uma mistura de ar e oxigénio casa de manter um plano cirúrgico de anestesia. Certifique-se de que o animal está em um plano profundo de Anesthesia antes de quaisquer manipulações, verificando a ausência de tom de mandíbula e manter a anestesia acima da concentração mínima alveolar para suínos. verificação da profundidade anestésica inicial é conduzida por assegurar a ausência de tom mandíbula e os níveis de isoflurano são monitorados continuamente durante todo o procedimento (> 1,5 MAC) para garantir um plano profundo de anestesia.
3. acessar cuidadosamente a jugular e da artéria carótida externa direita com cautério e dissecção romba. Coloque um cateter 8.5F Swan-Ganz na jugular externa e inflar o balão para 1,5 cc. Em seguida, atravessar o átrio direito, para o ventrículo e através da válvula pulmonar para baixo da artéria pulmonar até uma pressão de cunha é sentida.
4. Esvaziar o balão e deixar o cateter nesta posição. Grave a pressão do átrio direito e da pressão da artéria pulmonar usando o balão. Além disso, registar a pressão de cunha ou de pressão no pulmão (ou se os pulmões são considerados normais, então também registar a esquerda umapressão de teste).
   NOTA: Este cateter também permite a estimativa do débito cardíaco.
5. Coloque um cateter adicional pressão do balão 5.0f na jugular externa e para o ventrículo direito à pressão contínua registro.
6. Coloque um cateter balão de pressão 5.0f na artéria carótida, prolapso através da valva aórtica e manter no ventrículo esquerdo. Lave todos os cateteres de pressão com 20 unidades / soro fisiológico heparanized ml ligado a um transdutor de pressão, e gravar todos os dados de pressão do ventrículo esquerdo, ventrículo direito (e estimado débito cardíaco), pressão arterial pulmonar e pressão atrial direita.
7. Para o monitoramento periférico, aceder a um ramo da artéria femoral pela colocação de um cateter 18F para a pressão arterial em tempo real ou de monitoramento de gás de sangue. frequência cardíaca registro e temperatura durante o procedimento.
8. acessar cuidadosamente a jugular externa esquerda com cautério e dissecção romba. Coloque dois apresentadores hemostasia 11.0F na jugular e seguro com 0 fio de seda. Coloque cateteres direccionáveis ​​nos introdutores.
9. Sob orientação fluoroscópica, local de fixação ativa leva no apêndice atrial direito eo ápice do ventrículo direito.
   NOTA: A vantagem de fixação é um fio implantado cirurgicamente que conecta o coração a um marcapasso implantado.
10. cabos Connectanalyzer para os condutores e teste de captura utilizando um programador. Definir os parâmetros para 8V, 0,25 mseg de duração, e definir a frequência de estimulação em um mínimo de 10 bpm superior à taxa intrínseca naquele momento. Grave a impedância relativo para cada chumbo.
11. Adicione uma incisão cirúrgica medial do processo xifóide até perto da inserção dos músculos esternocleidomastóideos. Use uma serra esternal para remover a saliência anterior do esterno (osso da quilha) para permitir a dissecação parcial medial do esterno. Use uma tesoura de cortar as porções restantes da estrutura óssea do esterno. Dissecar o ligamento esternal-pericárdio e retrair o sternum.
12. Use dissecção romba para separar o pericárdio com as guarnições de pleurais. Faça uma incisão sagital medial (3-5 cm) no pericárdio e criar uma base de pericárdio com quatro suturas nó quadrado em cada canto (direita, esquerda, superior e inferior locais).
13. Coloque um eléctrodo bipolar temporária na região apical do ventrículo esquerdo e coloque um mergulho unipolar estimulação temporária chumbo no apêndice atrial esquerdo.
14. Eutanásia é realizado por remoção do coração sob anestesia profunda.

2. Preparação para a Monitorização eletrofisiológica

1. Cardiac Mapping System.
   1. Escolha um estudo AF em um sistema de mapeamento cardíaca Conecte os cabos de estimulação ventricular epicárdio bipolares e os eléctrodos epicárdicos no apêndice atrial com pinças para as configurações apropriadas na caixa de fuga. Conecte um eletrocardiograma e terrestres almofadas para o sistema.
2. Osciloscópio e grama Estimulador.
   1. Ligue obipolar eletrodo de estimulação ventricular esquerda e chumbo atrial unipolar na caixa de fuga a um estimulador Grass, que é conectado a um osciloscópio para verificação elétrica.
3. Programado eletrofisiológica Estimulação.
   1. Fixe os cabos atrial direito e leads do ventrículo direito em um pacemaker Coloque a cabeça de programador de telemetria sobre o pacemaker. Seleccione a estimulação dos eletrodos de estimulação (PES) estudo e definir os parâmetros para 8v; remover todos os parâmetros do paciente. Defina a duração de estimulação definido para 8 pulsos a 400 ms (ou 300 ms).

3. estudo in situ

1. Período Refratário: Estudo Paradigm.
   1. Determinar o período atrial efetiva refratário (AERP), o nó ventricular atrial período refratário (AVNERP) ea ventricular período refratário efetivo (VERP) no início do estudo, e aos 30 e 60 minutos após a entrega do pericárdio do tratamento composto / droga / controle; pontos de tempo adicionais podem ser adicionados como desIred.
2. Período Refratário: Configurações do programador.
   1. Explosão induzir o parâmetro estudo PES 8 passos (400 ms ou 300 ms), seguido por um mínimo de 300 pacing ms. Reduzir o ritmo até o ventrículos / átrio (respectivamente) não conseguem contrair. Isso é notado a partir da detecção dos condutores de estimulação; determinando, assim, o período refractário relativa.

Figura 2. EnSiteSystem: AERP, AVNERP e VERP Determinação Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Determinação do parente AF Burden: Parâmetros.
   1. Sustentar o coração do animal em AF, após 1 min, deixe-a permanecer na AF para até 10 min:. Ie, antes de chocar os átrios com remos diretos em 5 joules de encerrar AF. Elindução AF ICIT até 10 vezes em cada ponto de tempo. Note-se, no presente estudo. AF é definida como um ritmo irregular com uma ausência de onda P.
4. Burden AF: Grama Estimulador e configurações osciloscópio.
   1. Otimizar os parâmetros para o estimulador Grass para entregar 4 Hz, com uma duração de pulso de 2 segundos ao apêndice atrial esquerdo (AAE), através da liderança de mergulho de estimulação; verificar este por um osciloscópio padrão. Entregar um único pulso ao LAA para induzir AF.

4. Coração Explantação e Reanimação (Transplant Model)

1. Aórtica cânula Root.
   1. Dissecar cuidadosamente o tecido de pericárdio em torno da aorta ascendente e remover os pericardium.Suture dois pontos (2-3 cm de distância) de 2.0 sutura Ethibond na aorta ascendente, e administrar 30.000 unidades de heparina por via intravenosa.
   2. Coloque a cânula da raiz da aorta entre os pontos de sutura e garantir a aorta. Com o sistema de distribuição pressurizado, remova tele estilete-bisel e colocar uma braçadeira no cânula não permitindo fluxo.
2. Preparação cardioplegia.
   1. Administrar solução cardioplégica St. Thomas frio para a aorta ascendente sob uma pressão de 150 mm / hg através de um saco pressurizado. Fixar um cateter de irrigação que é anexado à cardioplegia pressurizado com uma torneira de paragem de três vias na extremidade distal. Fixe o galo de parada à cânula da raiz da aorta, liberar uma descarga constante de cardioplegia através do cateter e seguro à cânula da raiz da aorta.
3. Cross-Clamp.
   1. Fixe a veia cava inferior com um atraumaticclamp 1-2 cm apenas superiores ao diafragma. Prender a aorta ascendente com um ângulo atraumática campo de 1-2 cm na aorta ascendente superior à cânula da raiz da aorta.
4. Cruz-Clamp / Cardioplegia.
   1. Retire o grampo da cânula da raiz da aorta e lave a cardioplegia a 150 mm / Hg para a válvula aórtica, fechando a válvula aórtica e perfusing as coronárias.
   2. Prender a veia cava superior e fazer uma pequena incisão na artéria pulmonar, de modo a não sobre pressurizar o coração. Uma vez que o coração é parado (assistolia), impostos especiais de consumo e remover o coração do peito e coloque em um banho de tampão Krebs-Henseleit fria (~ 3-8 ° C).
5. Reanimação.
   1. Canular os grandes vasos e preparar o coração utilizando metodologias visíveis Coração (3). Uma vez que o coração perfundido atinge 37 ± 5 ° C, uma restauração do ritmo sinusal nativa, oferecendo 34 J choques para os ventrículos através de eletrodos de patch do epicárdio.

5. In Vitro Estudo Paradigm

1. Monitorar continuamente a função cardíaca por 60 minutos após a reanimação. monitorar continuamente ecocardiografia em modo 2D com uma visão de curto eixo: uma visão LV logo abaixo da válvula mitral.
2. Calcule espessura e ejeção frações da parede ventricular a cada 10 min pós reanimação (ver abaixo).Recolher amostras do seio coronário (1 cc) a -5 min e cada 5 min durante o período de avaliação.
3. Monitoring.
   1. Monitorar a hemodinâmica para ambos os ventrículos direito, incluindo pressões, fluxos e mudanças de volume e esquerdo.
4. Ecocardiografia: Fração de Ejeção.
   1. Coloque uma sonda de eco transtorácica diretamente no coração, capturando uma visão de curto eixo mid-papilar. Calcule a fração de ejeção (EF%) no modo de funcionamento de 4 câmaras a cada 10 minutos usando a equação: LV End diastólica Volume - LV Volume sistólico final X volume de 100 / LV End diastólica
5. Ecocardiografia: Ventricular Esquerda espessura da parede.
   1. Medir a espessura da parede ventricular (cm) a partir de uma janela de curto eixo mid-papilar em intervalos de 10 min para uma hora pós reanimação. Meça quatro cantos do ventrículo esquerdo usando uma tela de pinças e tirar a média.
6. Metabolismo do miocárdio.
   1. Coloque um steeracateter ble no seio coronário (CS). Amostra 1 cc do CS 5 min antes de reanimação e cada 5 minutos após a reanimação, durante 1 hora. Testar as amostras para os níveis de lactato e glicose; outros gases de sangue também pode ser avaliado.

Estes resultados são característica dos dados que podem ser recolhidas utilizando este modelo de entrega alvo de agentes farmacológicos no suína. Estes dados demonstraram aumentos notáveis ​​nestes ventrículo períodos refratários efetivos (Verp) após uma infusão de DHA in situ. Além disso, os dados estabelece um aumento da pressão do ventrículo esquerdo de DHA em comparação com o controlo in vitro. A pressão LV nos corações tratados DHA foram significativamente maiores em relação ao controle em vários pontos de tempo. Estes dados valida uma janela farmacológico para testar estratégias de tratamento in situ e in vitro.

Figura 3. Mudança no ventrículo período refratário efetivo (VERP). O ventrículo período refratário efetivo (VERP) foi determinada 5 min antes da entrega do pericárdio de ag controleEnt (solução salina) ou ácido docosa-hexaenóico (DHA), ou infusão de DHA, em adição a 30 e 60 min pós-parto pericárdico de ambos os tratamentos ou controlo. O VERP do grupo DHA tenderam para o aumento em relação aos controles. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. Pressão do Ventrículo Esquerdo em 4 câmaras Modelo de Trabalho A pressão máxima (mmHg) foi determinada a cada 5 minutos para 60 minutos após o coração foi reanimado utilizando as metodologias coração visíveis. DHA e DHA infusão (tratado durante mais de 10 minutos) os corações tratados tenderam para provocar pressão inicial maior do que o controlo para a maioria do período de teste. Um t-teste emparelhado-un foi concluída for cada ponto de tempo. (*, P = 0,065, +, P = 0,056, †, P = 0,059 ‡ .P = 0,058) Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O ventrículo período refractário efectivo (VERP) foi determinada 5 minutos antes da entrega de pericárdio de agente de controlo (solução salina) ou ácido docosa-hexaenóico (DHA), ou DHA infusão (em 10 min), em adição a 30 e 60 min a entrega de pós-pericárdico de ambos os tratamentos ou controle. O VERP do grupo DHA tenderam para o aumento em relação aos controles.

A pressão máxima (mm Hg) foi determinada a cada 5 minutos durante 60 minutos após o coração foi reanimado utilizando as metodologias coração visíveis. DHA e DHA infusão corações tratados tenderam para provocar pressão inicial maior do que o controlo para a maioria do período de teste. Um t-teste emparelhado-un foi concluída para cada ponto de tempo. (*, P = 0,065, +, P = 00,056, †, P = 0,059 ‡ .P = 0,058)

Aqui, demonstramos uma abordagem única para testar a eficácia potencial de compostos alvo entregues no espaço pericárdico. Este paradigma estudo pode ser utilizado para testar mercado actual libertado produtos farmacêuticos ou compostos experimentais, fornecendo, assim, as aplicações directas traducionais para vários cenários clínicos. Dentro dessa estratégia de tratamento existem duas grandes aplicações clínicas para a entrega de produtos farmacêuticos para o espaço pericárdico: 1) open-coração ou minimamente invasivos procedimentos cirúrgicos cardíacos; e 2) o transplante de coração e de preservação de órgãos. Além disso, este paradigma estudo tem vários parâmetros que podem ser analisados ​​para compreender melhor a eficácia preditivo dos próprios agentes farmacêuticos dentro destas estratégias de tratamento descrito no situ parâmetros incluem:. 1) os períodos refractários relativas da AVN, átrios e / ou ventrículos ; 2) a determinação da relação AF susceptibilidade / carga; e 3) hemodynam. ic e freqüência cardíaca respostas in vitro parâmetros incluem: 1) fração de ejeção relativos; 2) as respostas da espessura da parede do VE; 3) alterações metabólicas cardíacas; e 4) hemodinâmica e alterações do ritmo cardíaco. Os dados históricos que aqui apresentamos demonstram uma seleção desses parâmetros descritos. Os aspectos translacionais mais notáveis ​​destes estudos são para aberto ou procedimentos minimamente invasivos cardíacos, bem como captação de órgãos antes do transplante.

Mais especificamente, um berço de pericárdio formada colocado durante uma cirurgia de coração aberto, seja minimamente invasiva ou na sequência de um full-esternotomia, fornece uma oportunidade importante para administrar os compostos localizadas: ou seja, em concentrações mais elevadas do que pode ser administrado por via intravenosa e / ou sem side sistêmica efeitos. Para procedimentos cardíacos ainda menos invasivos (por exemplo, acesso subxifoidea), uma pequena incisão é feita no pericárdio, que também poderia ser utilizada como um canal para a administração de fármaco alvo. MYOCardial irritabilidade / insulto é muito maior, enquanto o coração é manipulada durante vários procedimentos cardíacos. Tratar de arritmias e / ou déficits funcionais directamente, podem ser um meio benéficos e fáceis para melhorar os resultados dos pacientes.

aplicações semelhantes poderiam ser facilmente realizado durante os procedimentos para a recuperação de órgãos, por exemplo, pré-condicionamento do coração antes da aquisição. É crucial que o miocárdio é otimamente condicionado por um procedimento complexo, que inclui a desfibrilação coração de volta em um ritmo sinusal normal após o transplante. Em outras palavras, há um aumento dos riscos de taquicardias auriculares e ventriculares e / ou fibrilação cardíaca durante a colheita e após o transplante. Além disso, é importante preservar os outros órgãos no dador durante o processo de aquisição, onde as drogas administrada perifericamente podem comprometer estes órgãos. Por exemplo, o metoprolol administrado por via intravenosa pode resultar em dysfuncti renal agudaquando administrado para tratar arritmias durante procedimentos cirúrgicos / aquisições ^1. Actualmente, o coração deve ser transplantado para o receptor dentro de cerca de 4-6 horas. Esta restrição de tempo permanece como um dos fatores limitantes na realização de transplantes cardíacos hoje. Assim, empregando o paradigma experimental descrevemos aqui pode ser um meio importante para a avaliação de compostos que podem ser benéficos no prolongamento do intervalo de tempo aceitável após a recuperação isquémica do órgão.

dados previamente recolhidos, a partir de nosso laboratório utilizando este paradigma estudo demonstraram que pode ser muito útil para a obtenção de vários parâmetros que podem ser analisados ​​para prever a eficácia dos agentes farmacêuticos-se numa estratégia de tratamento descrito. Mais especificamente, o estudo dos períodos refractários eficazes seguinte pericárdio entregues DHA, DHA infusão, metoprolol e outras drogas in situ tem sido importante para compreender o seu umpotencial ntiarrhythmic para este método de entrega de destino. Prolongando os períodos refractários eficazes e / ou reduzir as velocidades de condutância na AVN muitas vezes pode encerrar certos tipos de arritmias ^4. Aqui temos demonstrado aumentos notáveis ​​nestes períodos refractários eficazes na sequência de uma infusão de DHA, bem como após a entrega metoprolol em relação ao controle (publicado anteriormente, ^1. Além disso, é de interesse para determinar a carga AF relação por causa de sua relação com a a probabilidade de potenciação arrítmico num determinado paciente, aqui também notar alterações nesta resposta após o pré-condicionamento farmacológico.

A investigação dos parâmetros clínicos clinicamente relevantes após a reanimação de um coração pré-condicionado também dá idéias de translação quanto aos potenciais benefícios desta administração farmacológica em um receptor de transplante. Até à data, usando este objectivo de entrega / precondit geralioning abordagem de pesquisa, o nosso laboratório tem investigada uma variedade de agentes clinicamente administradas, bem como novos compostos farmacológicos que podem minimizar arritmias ou lesão isquêmica do coração (metoprolol, amiodarona, lidocaína, opióides delta, os ácidos ómega-3 gordos, ácido ursodyoxycholic, lipovenous , ácido docosa-hexaenóico e / ou combinações destes). Deve também notar-se que estes agentes também podem ser administrados como agentes de pós-condicionado no aspecto in vitro dos protocolos descritos dentro. Observando-se a hemodinâmica in vitro, os dados representativos para as pressões do LV são notavelmente mais elevado nos corações que foram tratados com uma infusão de DHA ou DHA em comparação com um controlo do veículo. Além disso, nosso laboratório tem observado mudanças na fração de ejeção e da espessura da parede do VE nos corações tratados em relação aos controles. Os parâmetros / fatores clínicos que podem ser estudadas são importantes para avaliar a função eficaz e observar o aparecimento de edema. Furtela, amostras do seio coronário, também pode ser obtida por análise de vários factores metabólicos: por exemplo, os níveis, de lactato e de glucose. Estes parâmetros são fundamentais para avaliar o metabolismo cardíaco relativa e / ou a função global do coração. Por exemplo, o aumento dos níveis de lactato são muitas vezes indicativo de acidose, por sua vez, resultando em função cardíaca pobre.

Os dados que obtivemos a partir de tais estudos têm demonstrado um modelo experimental viável (com limitações observadas devido à natureza aguda do estudo) para determinar a viabilidade de utilizar tanto medicamentos disponíveis clinicamente ou agentes experimentais de uma estratégia de entrega de destino pericárdio. Consideramos que a abordagem de investigação que descrevemos aqui é altamente reprodutível e proporciona novos conhecimentos relativos ao alvo e benefícios sistêmicos da entrega de vários agentes farmacológicos no espaço pericárdico. O resultado pode-se obter em tais protocolos projetados poderia ter imporimplicações translacionais tantes tanto para cirurgia cardíaca e transplante cardíaco.

The authors have nothing to disclose

We would like to give a big thanks to the Visible Heart Laboratory staff and students that have helped with this project: Nate Menninga, Lars Mattison and Megan Schmidt.