Эффективное Вывод пигментного эпителия сетчатки клеток из стволовых клеток

Stem cell-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells may be used for multiple applications including cell-based therapies for retinal degeneration, disease modeling, and drug studies. Here we present a simple protocol for reproducibly deriving RPE from stem cells.

No cure has been discovered for age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex multifactorial disease with an unknown etiology, although it is largely thought to occur due to death or dysfunction of the retinal pigment epithelium (RPE), a monolayer of cells that underlies the retina and provides critical support for photoreceptors. RPE cell replacement strategies may hold great promise for providing therapeutic relief for a large subset of AMD patients, and RPE cells that strongly resemble primary human cells (hRPE) have been generated in multiple independent labs, including our own. In addition, the uses for iPS-RPE are not limited to cell-based therapies, but also have been used to model RPE diseases. These types of studies may not only elucidate the molecular bases of the diseases, but also serve as invaluable tools for developing and testing novel drugs. We present here an optimized protocol for directed differentiation of RPE from stem cells. Adding nicotinamide and either Activin A or IDE-1, a small molecule that mimics its effects, at specific time points, greatly enhances the yield of RPE cells. Using this technique we can derive large numbers of low passage RPE in as early as three months.

The various cell types that occupy the retina are organized in a functional architecture. The photoreceptors in the back of the retina are responsible for converting light into electrical impulses through phototransduction. However, phototransduction cannot occur without the coordinated efforts of other neighboring cell types including Mueller glia and retinal pigment epithelium (RPE) cells. A monolayer of RPE cells partitions the sensory retina from the choriocapillaris, the primary blood supply for photoreceptors, and are ideally situated to control multiple functions important for photoreceptor homeostasis. In fact, the RPE and photoreceptors are so co-dependent they are widely considered to be one single functional unit. (For a review of all the diverse functions of the RPE see Strauss, 2005¹.) Death or dysfunction of retinal pigment epithelium cells can induce age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of permanent vision loss in industrialized countries^2-4.

AMD is a multifactorial disease of RPE, photoreceptors, and the choroidal vasculature; risk factors are diverse and include combinations of environmental and genetic influences^5,6. Treatments for AMD are very limited, but one promising potential therapy is RPE cell replacement^7,8. While the outcomes have been mixed, the transplantation of RPE cells in AMD patients (and in other patients with retinal degeneration) and also in rodent models of retinal degeneration, has the potential to transiently prevent significant photoreceptor atrophy^9-23. (The animal model commonly used for these studies are Royal College of Surgeons (RCS) rats, which harbor a mutation in the MerTK gene. This mutation renders RPE cells incapable of phagocytosing photoreceptor outer segments and promotes retinal degeneration²⁴.) While the reported survival rates of implanted RPE in the subretinal space of RCS rats and mice vary greatly, there is potential for them to survive for several months or years^9,10,12,20.

RPE cells can be obtained in sufficient numbers for transplantation by deriving them from pluripotent stem cells^9-14,25-28. Several independent groups have demonstrated that these cells function in similar ways to their somatic counterparts, and long term studies suggest that they are safe upon implantation in rat and mouse disease models^{9,10,12,14,19,20,25,29-32}. The use of induced pluripotent stem cells instead of embryonic stem cells may be advantageous since ethical issues and immunological challenges associated with allogeneic RPE may be obviated^33,34. Another exciting application for iPS technology is disease modeling³⁵. The ability to interrogate large numbers of RPE cells derived from patients with RPE diseases could be invaluable for understanding their molecular bases. This type of study has been performed recently with Best disease patient RPE and could pave the way for similar studies of inherited maculopathies³⁶.

The derivation of RPE from stem cells is a relatively simple process and can be done entirely in xeno-free conditions. The simplest strategy is to derive monolayers of RPE cells spontaneously, however, the yield can be significantly improved using directed differentiation techniques. But these techniques involve the use of exogenous protein factors that can be expensive and often generated in bacteria or other non-human sources^10,12,37. In our studies we followed an established protocol¹⁰ that utilizes nicotinamide and Activin A, a signaling factor that has been shown to be sufficient for RPE specification³⁸. Here we will demonstrate that the small molecule IDE-1 can adequately replace Activin A, thus reducing costs and alleviating concerns associated with the use of recombinant proteins³⁹. Additionally, we utilize xeno-free serum replacement, and we culture the differentiating RPE cells on a synthetic xeno-free substrate. RPE cells have been shown previously to differentiate very effectively using this approach⁴⁰.

When differentiated as a monolayer, we visualize pigmented colonies containing RPE cells after as early as five weeks¹². Once they reach sufficient size, they can be manually excised and transferred to another dish for expansion. RPE cells are notorious for dedifferentiating with each passage, and the use of anything older than five passages should be avoided (we find that sufficient numbers of cells for characterization and transplantation in animal models can easily be generated after two or three passages). Once fully differentiated, we employ multiple techniques to characterize the cells anatomically and functionally to ensure that they will serve as adequate replacements for diseased RPE. The description of these techniques, and protocol for implanting the iPS-RPE in the subretinal space of rodents, are beyond the scope of this methods paper and have been previously published^12,32,41.

While developing standardized protocols for effective derivation of iPS-RPE is clearly important for the clinics, there is also significant preclinical work to still be done in animal models. There are concerns regarding immunogenicity of iPS-derived cells, and multiple different implantation techniques, including implanting cells on artificial substrates, are being explored^42,43. For these reasons, we feel that the publication of standardized protocols is beneficial to facilitate both clinical and preclinical studies. Especially if direct comparisons will be done of iPS-RPE cells derived in different labs by different research groups.

1. направленной дифференцировки стволовых клеток, полученных НПП

Примечание: Все стадии инкубации проводили при 37 ° С в 5% СО ₂

1. Поддержание линии HES или бедер (подача в день) на техническое обслуживание средств массовой информации (мм Таблица 1). После того, как линии достигли достаточных стандарты контроля качества, поддерживать их на слой мышиных эмбриональных клеток-фидеров (MEFs) высевали при плотности 250000 / лунку пластины шесть. Xeno свободной культуры также могут быть получены в соответствии с протоколом, установленном Tucker и соавт. ^40.
2. Разрешить стволовых клеток колонии, чтобы достичь слияния.
3. Переключитесь на дифференциации средств массовой информации с никотинамид (DM / NIC; Таблица 1); кормить ежедневно.
4. После трех недель в культуре, переключитесь на дифференциации средств массовой информации с никотинамида и либо активин-А или IDE-1 (DM / NIC / AA или DM / NIC / IDE1, в таблице 1) для увеличения НПП дифференциации.
5. После пяти недель в культуре, вернуться к DM / NIC. не Ежедневные кормления больше не надо раз индикаторов рН в СМИ остановки желтеют день после кормления.
6. Подождите островков пигментных клеток казаться, что достаточно велики, чтобы быть вырезано и не удалено (рисунки 2D-F и 3А).

2. Разделительные Пигментные Островки

1. Шерсть лунки 24-луночного планшета с матрицей, которая имитирует естественное окружающей среды клеток (ксено свободной предпочтительно).
   ПРИМЕЧАНИЕ: роговица ножи и острые, остроконечный пинцет являются очень полезными для сбора. Весь лист дифференцированных клеток может снять во время уборки. Избежать этого можно, работая тщательно и первоначально собирание колонии в центре блюда.
2. Заполните столько лунки 24-луночного планшета с дифференциацией средств массовой информации (DM, в таблице 1) по мере необходимости. Это решение будет зависеть от количества пигментных колонийсобраны.
3. В капот культуре клеток с рассекает сферу, вручную вырезать пигментные островки. Крошить каждый островок в нижней части исходной пластины с использованием скальпель примерно 2-6 частей и захватить пигментные части с острыми щипцами.
4. Трансфер 1-2 пигментные части в каждом 24-а.
5. Не изменяйте СМИ в течение 3-5 дней, пока клетки придерживаться, а затем начать сменить носитель три раза в неделю. (Если они не придерживаются после этого времени, вероятность того, хорошо, что они никогда не будут).
6. Развернуть клеток в течение 3-4 недель в среде для дифференцировки (DM, в таблице 1) - образ типичного культуры, показанных на рисунке 3B. Клетки могут еще не полностью заполнять хорошо, но ждать больше не похоже, чтобы помочь. Поток ячеек три раза в неделю.
7. Примерно через 3 недели, вручную удалить скопления лейкоцитов в случае необходимости с острыми щипцами сгустки. Не сделать этот шаг, если это не является необходимым - это легко ввести загрязняющих веществ. Это идеально подходит дляпопытаться получить чистые популяции ПЭС от оригинальных пигментных колоний в шаге 1.6.

3. пассажи стволовых клеток, полученных НПП

1. Отделить клетки с 200 мкл раствора с клеточной диссоциации (предпочтительно не трипсином-реагент, который может быть инактивирован путем разбавления предпочтительно) в течение 5-8 мин при температуре 37 ° С, и инактивировать его разбавлением DM. Использование 200 мкл пипетки, чтобы смыть все клетки и ресуспендируют их (Если выбранный также содержит только несколько клеток, считают объединения клеток из двух 24-луночных).
2. Центрифуга (800 мкг в течение 5 мин), отбросить супернатант, и ресуспендируют в 3 мл DM сред.
3. Re-пластинчатые клетки от одного (или двух) 24-колодцы в одной матрице покрытием 6-а в 3 мл DM на лунку (1: 5 расширения).
4. Развернуть течение 1-2 недель, пока клетки не являются ~ 90% сливной; Изображение полностью дифференцированных чистой культуры показано на фиг.3С.
5. Отделить клетки с 1 мл клеточной DДиссоциация раствор в течение приблизительно 5-8 мин при 37 ° С, его инактивации путем разбавления DM, использовать 1000 мкл пипетки, чтобы смыть все клетки, и ресуспендируют их.
6. Спин вниз (800 мкг в течение 5 мин), отбросить супернатант, и ресуспендируют в 18 мл DM СМИ.
7. Повторное пластины клетки один 6-а каждый из шести матрицы с покрытием 6-скважин в 3 мл на лунку DM (1: 6 расширения) или один с покрытием 75см ² колбу (1: 7,5 расширение).
8. Повторите шаги 3.4-3.8 мере необходимости, пока достаточное количество клеток не получают.
   Примечание: старайтесь, чтобы собрать как можно больше колоний, как это возможно для расширения, а не планирует усиливать культур с помощью пассирования, так как каждый проход вызывает НПП дедифференцировку.

Шаги, описанные в этой рукописи, как показано на рисунке 1, может быть использован для генерации легко RPE из стволовых клеток, как сообщалось ранее ^10,12. После сохранения линии плюрипотентных в течение нескольких недель, пигментные колонии начинают появляться в колониях после 5-7 недель (7 недельных культуры, показанных на рисунке 2А-С). Эти колонии могут продолжать расти в течение нескольких недель, как Культуры поддерживали. После достижения достаточных размеров, как показано на рисунке 2D-F (8 недельных культуры), они могут быть вырезан вручную, как показано на фиг.3А. Тщательное удаление, чтобы избежать загрязнения с не-РПЭ клеток значительно облегчают создание достаточно чистых ПЭС культур (3В-C).

Рисунок 1: схематическое изображение IPS-НПП вывод . Наивные стволовые клетки культивируют в средах обслуживания до достижения слияния. В день 0 дифференцировки (DM) не хватает bFGF, но содержащий никотинамид добавляется (DM / NIC). Клетки кормили ежедневно с этого носителя в течение трех недель. В конце три недели ДМ носитель с добавлением либо рекомбинантного активин A (DM / NIC / АА) или IDE-1 (ДМ / NIC / IDE1) для повышения НПП спецификации и клетки подают с этого носителя в течение двух недель. Во время этого лечения пигментированные колонии начинают появляться, это увеличить в течение ближайших нескольких недель, и за неделю 8 может быть удалены вручную и переданы новым пластин для расширения в DM. (Табл 1 для конкретных компонентов среды) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: активин A А.Н.д IDE-1 увеличить выход IPS-ПЭС. (А) Небольшие пигментированные колонии начинают появляться после семи недель в культуре спонтанно между не-RPE клеток в одном листе, который прилегает к нижней части 6-луночного планшета (в некоторых отмечены стрелками). (В и С) Дополнение с IDE-1 или Activin А приводит к появлению еще более пигментированные колонии (некоторые обозначены стрелками в переменного тока) демонстрирует, что добавки с обеих активин А или IDE-1 повышает НПП дифференциация. (DF) После 8 недель влияние пищевых добавок с IDE-1 или активин А еще более выраженным. Оба числа и размеров пигментных островков больше, после направленной дифференцировки. Шкала бар = 5 мм

Рисунок 3: Расширение и терминальной дифференцировкипигментные IPS-НПП. () Представитель образ пигментированной IPS-НПП колонии, что является достаточно большим, чтобы акциза. Номера окружают клетки ПЭС колонию в нижней части 6-луночный планшет с. Синий контур обозначает область, которая будет удалить. (B) изображение после вырожденных незрелые IPS-RPE клеток в культуре после первой стадии расширения. (С) два месяца терминально дифференцированные клетки IPS-ППД. Обратите внимание на наличие границ очевидных клеток и однородных уровней пигментации, демонстрирующих передовые дифференциации. Масштабные линейки = 100 мкм

В этой рукописи мы опишем шаги, чтобы эффективно генерировать большое количество чистых культур IPS-РПЭ. Ранее нами было показано с помощью указанного направленного протокол дифференцирование активин А что мы можем генерировать IPS-РПЭ, которые сильно напоминают hRPE на основе транскриптомика, протеомики, метаболомике и функциональности, и что они замедляют дегенерацию сетчатки при имплантации в RCS крыс ^12,31,32 , Процесс формирования IPS-РПЭ является трудоемким, но не трудоемкий (Рисунок 1). После того, как культуры плюрипотентных достичь слияния они должны быть поданы с среде для дифференцировки на ежедневной основе. Мы дополнение носитель либо активин А или менее дорогой IDE-1 маленькая молекула, и продолжают кормить в течение двух недель при мониторинге культур для пигментированных колоний IPS-ПЭС, которые обычно возникают после 5-7 недель (Фиг.2А-С). После достижения достаточного размера (рис 2D-F и 3А), колоныES вручную удалены и переносили в новые пластин для расширения. Это происходит примерно через 8 недель и наиболее трудоемким этапом всей протокола.

Наиболее сложным аспектом является избежание загрязнения с не-РПЭ клеток в расширяющейся культур, случайно сбора ненужных соседние клетки в или вокруг пигментных колоний. В зависимости от степени загрязнения, островки без ПЭС клеток можно удалить вручную при расширении, хотя каждый раз культур обрабатываются дополнительные риски введения бактериальных или грибковых загрязняющих веществ увеличиваются. Стоит отметить, что в нашем опыте IPS-НПП самом деле может "вытеснить" небольшое количество загрязняющих клеток во время стадий пересева. Но мы настоятельно рекомендуем большую осторожность при выборе колонии, чтобы они были как можно более чистым, чтобы избежать необходимости прибегать к этим шагам. Ко второй или третий проход культуры IPS-РПЭ достаточно чистый и для недопущения измененияциент число клеток доступны для характеризации и имплантации.

Техника сообщили здесь, конечно, не единственный способ для получения стволовых клеток, полученных НПП. На самом деле это не является ни простой, ни быстрым. Самый простой и наиболее широко метод заключается в использовании спонтанной дифференцировке. (Тем не менее, добавки с IDE-1 в течение двух недель недорого и значительно повышает урожайность IPS-ППД.) IPS-НПП также породили в эмбриональных органов, которые дифференцируются в сферах поляризованных клетках ПЭС, которые могут быть вынуждены придерживаться поверхности культуральные планшеты и расширить в виде монослоя. Клетки ПЭС генерировать с помощью этого метода были также очень энергично характеризуется и настоятельно напоминают hRPE ^27. НПП могут дифференцироваться чрезвычайно быстро (всего за 14 дней) из стволовых клеток, дополняя СМИ с никотинамида, IGF1, Noggin, Dkk1 и bFGF преобразовать их в нейронных сетчатки судьбы предшественников, а потом добавив про-РПЭ факторы никотинамид Ай Activin ^37. НПП также могут быть получены даже быстрее, непосредственно из фибробластов в течение приблизительно одного месяца по трансдукции фибробластов с минимальным набором факторов транскрипции, в том числе CMYC, MITF, Otx2, RAX, и CRX ^44. Тем не менее, в то время как эти результаты являются весьма обнадеживающими ПЭС генерируется эти последние две методики еще не были тщательно характеризуется имплантации их в естественных условиях. Таким образом, мы предполагаем, что читатель рассмотреть все варианты НПП деривационных тщательно при выборе использовать в своих исследованиях.

Преимущества использования протокола изложенной здесь являются его простота и стабильно высокие урожаи очень высокого качества ПЭС ^31. Дополнение с IDE-1, а не активин А значительно снижает общую стоимость и снижает риски, связанные с использованием рекомбинантных белков. Так как еще не ясно, если выбор использовать различные методы дифференциации будетвоздействие на конечный продукт, это может быть выгодно использовать стандартные протоколы, особенно если прямое сравнение между ПЭС, генерируемого в различных лабораторий необходимо (возможно, в частности, в случае моделирования болезни). Простой протокол как этот, который требует большого опыта и реагенты, и что порождает высокий выход IPS-ПЭС, может быть идеальным для таких ситуаций.

None of the authors have any commercial disclosures to declare.

We wish to thank the following individuals: Drs. Tim Krohne and Eyal Banin (along with Dr. Mandy Lehmann and David Friedlander) for generous help developing the differentiation protocols. Dr. Felicitas Bucher provided assistance differentiating the RPE cells used in this study. We also acknowledge the National Eye Institute (NEI grants EY11254 and EY021416), California Institute for Regenerative Medicine (CIRM grant TR1-01219), and the Lowy Medical Research Institute (LMRI) for very generous funding for this project.