줄기 세포에서 망막 색소 상피 세포의 효율적인 유도

Stem cell-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells may be used for multiple applications including cell-based therapies for retinal degeneration, disease modeling, and drug studies. Here we present a simple protocol for reproducibly deriving RPE from stem cells.

No cure has been discovered for age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex multifactorial disease with an unknown etiology, although it is largely thought to occur due to death or dysfunction of the retinal pigment epithelium (RPE), a monolayer of cells that underlies the retina and provides critical support for photoreceptors. RPE cell replacement strategies may hold great promise for providing therapeutic relief for a large subset of AMD patients, and RPE cells that strongly resemble primary human cells (hRPE) have been generated in multiple independent labs, including our own. In addition, the uses for iPS-RPE are not limited to cell-based therapies, but also have been used to model RPE diseases. These types of studies may not only elucidate the molecular bases of the diseases, but also serve as invaluable tools for developing and testing novel drugs. We present here an optimized protocol for directed differentiation of RPE from stem cells. Adding nicotinamide and either Activin A or IDE-1, a small molecule that mimics its effects, at specific time points, greatly enhances the yield of RPE cells. Using this technique we can derive large numbers of low passage RPE in as early as three months.

The various cell types that occupy the retina are organized in a functional architecture. The photoreceptors in the back of the retina are responsible for converting light into electrical impulses through phototransduction. However, phototransduction cannot occur without the coordinated efforts of other neighboring cell types including Mueller glia and retinal pigment epithelium (RPE) cells. A monolayer of RPE cells partitions the sensory retina from the choriocapillaris, the primary blood supply for photoreceptors, and are ideally situated to control multiple functions important for photoreceptor homeostasis. In fact, the RPE and photoreceptors are so co-dependent they are widely considered to be one single functional unit. (For a review of all the diverse functions of the RPE see Strauss, 2005¹.) Death or dysfunction of retinal pigment epithelium cells can induce age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of permanent vision loss in industrialized countries^2-4.

AMD is a multifactorial disease of RPE, photoreceptors, and the choroidal vasculature; risk factors are diverse and include combinations of environmental and genetic influences^5,6. Treatments for AMD are very limited, but one promising potential therapy is RPE cell replacement^7,8. While the outcomes have been mixed, the transplantation of RPE cells in AMD patients (and in other patients with retinal degeneration) and also in rodent models of retinal degeneration, has the potential to transiently prevent significant photoreceptor atrophy^9-23. (The animal model commonly used for these studies are Royal College of Surgeons (RCS) rats, which harbor a mutation in the MerTK gene. This mutation renders RPE cells incapable of phagocytosing photoreceptor outer segments and promotes retinal degeneration²⁴.) While the reported survival rates of implanted RPE in the subretinal space of RCS rats and mice vary greatly, there is potential for them to survive for several months or years^9,10,12,20.

RPE cells can be obtained in sufficient numbers for transplantation by deriving them from pluripotent stem cells^9-14,25-28. Several independent groups have demonstrated that these cells function in similar ways to their somatic counterparts, and long term studies suggest that they are safe upon implantation in rat and mouse disease models^{9,10,12,14,19,20,25,29-32}. The use of induced pluripotent stem cells instead of embryonic stem cells may be advantageous since ethical issues and immunological challenges associated with allogeneic RPE may be obviated^33,34. Another exciting application for iPS technology is disease modeling³⁵. The ability to interrogate large numbers of RPE cells derived from patients with RPE diseases could be invaluable for understanding their molecular bases. This type of study has been performed recently with Best disease patient RPE and could pave the way for similar studies of inherited maculopathies³⁶.

The derivation of RPE from stem cells is a relatively simple process and can be done entirely in xeno-free conditions. The simplest strategy is to derive monolayers of RPE cells spontaneously, however, the yield can be significantly improved using directed differentiation techniques. But these techniques involve the use of exogenous protein factors that can be expensive and often generated in bacteria or other non-human sources^10,12,37. In our studies we followed an established protocol¹⁰ that utilizes nicotinamide and Activin A, a signaling factor that has been shown to be sufficient for RPE specification³⁸. Here we will demonstrate that the small molecule IDE-1 can adequately replace Activin A, thus reducing costs and alleviating concerns associated with the use of recombinant proteins³⁹. Additionally, we utilize xeno-free serum replacement, and we culture the differentiating RPE cells on a synthetic xeno-free substrate. RPE cells have been shown previously to differentiate very effectively using this approach⁴⁰.

When differentiated as a monolayer, we visualize pigmented colonies containing RPE cells after as early as five weeks¹². Once they reach sufficient size, they can be manually excised and transferred to another dish for expansion. RPE cells are notorious for dedifferentiating with each passage, and the use of anything older than five passages should be avoided (we find that sufficient numbers of cells for characterization and transplantation in animal models can easily be generated after two or three passages). Once fully differentiated, we employ multiple techniques to characterize the cells anatomically and functionally to ensure that they will serve as adequate replacements for diseased RPE. The description of these techniques, and protocol for implanting the iPS-RPE in the subretinal space of rodents, are beyond the scope of this methods paper and have been previously published^12,32,41.

While developing standardized protocols for effective derivation of iPS-RPE is clearly important for the clinics, there is also significant preclinical work to still be done in animal models. There are concerns regarding immunogenicity of iPS-derived cells, and multiple different implantation techniques, including implanting cells on artificial substrates, are being explored^42,43. For these reasons, we feel that the publication of standardized protocols is beneficial to facilitate both clinical and preclinical studies. Especially if direct comparisons will be done of iPS-RPE cells derived in different labs by different research groups.

줄기 세포 유래 망막 색소 상피 1. 감독 차별화

주 : 모든 인큐베이션 단계는 5 % CO _2에서 37 ℃에서 수행

1. 유지 보수 미디어 (; 표 1 MM)의 배아 줄기 또는 엉덩이 라인 (매일 공급)를 유지한다. 라인이 품질 관리 기준을 충분히 도달했으면, 마우스 배아 피더 세포의 층에이를 유지 보수 (MEFs에)은 250,000의 밀도 / 웰의 여섯 웰 플레이트에 시딩. 제노없는 배양 또한 터커 외. ^(40)에 의해 확립 된 프로토콜은 다음 생성 될 수있다.
2. 줄기 세포 식민지 포화 상태에 도달 할 수 있습니다.
3. 니코틴 아미드 (; 표 1 DM / NIC)와 차별화 미디어로 전환; 매일 공급.
4. RPE 차별화를 강화하기 위해, 문화 삼주 후, 니코틴 및 중 하나를 Activin-A 또는 IDE-1 (표 1 DM / NIC / AA 또는 DM / NIC / IDE1)와 차별화 미디어로 전환합니다.
5. 문화 오주 후, DM / NIC로 전환. 매일 먹이를 더 이상 공급 후 노란색 하루를 돌려 미디어 정지의 pH를 표시 한 번 필요하지 않습니다.
6. (그림 2D-F와 3A 참조)만큼 잘라 제거 할 큰이 나타나는 색소 세포의 섬 기다립니다.

2. 분리 안료 독도

1. 외투 세포 자연 환경 (이종이없는 것이 바람직하다) 본뜬 매트릭스 24- 웰 플레이트의 웰.
   참고 : 각막 블레이드 날카로운, 뾰족한 집게 따기위한 매우 유용합니다. 따기 동안 분화 된 세포의 전체 시트를 분리 할 수​​ 있습니다. 신중하게 작업하고 처음에 접시의 중앙에 식민지를 선택하여이 피하십시오.
2. (; 표 1 DM) 필요에 따라 차별화 미디어를 24 웰 플레이트의 많은 우물을 입력합니다. 착색 된 콜로니의 수에 의존 할 것이다 이러한 결정수집.
3. 해부와 세포 배양 후드에서 수동으로 착색 된 섬을 잘라. 약 2-6 조각으로 메스를 사용하여 원래 판의 맨 아래에 각각의 섬을 잘라 날카로운 집게로 착색 된 부분을 잡아.
4. 각 24 웰에 1-2 착색 된 조각을 전송합니다.
5. 세포가 준수 할 때까지 3~5일을 위해 미디어를 변경하지 마십시오, 다음 미디어에게 일주일에 세 번 변경 시작합니다. (그들은이 시간 이후 준수하지 않는 경우, 가능성은 결코 좋은입니다).
6. (; 표 1 DM) - 전형적인 문화의 이미지가 그림 3b에 도시되어 차별화 미디어 3-4 주 동안 세포를 확장합니다. 세포는 여전히 전체를 잘 채울 수 있지만 더 이상 기다리는 것은 해결 될 수 없다. 일주일에 세포를 세 번 피드.
7. 약 3 주 후, 수동 날카로운 집게로 필요한 경우 대단히 짧은 흰색 세포의 클러스터를 제거합니다. 필요한 경우가 아니면이 단계를 수행하지 마십시오 - 그것은 오염 물질을 소개하기 쉽습니다. 그것은에 이상적입니다단계 1.6 원래 색소 식민지에서 RPE의 순수한 인구를 얻으려고.

3.과 Passaging 줄기 세포 유래 망막 색소 상피

1. 세포 해리 용액 200 μL를 가진 세포를 분리하여 37 ℃에서 5-8 분 동안 (바람직 희석 바람직하다 통하여 불 활성화 될 수있는 시약의 트립신 생략), 및 DM 희석하여 비활성화. 모든 세포를 씻어하고 (두 24 우물에서 세포를 풀링을 고려, 몇 세포가 포함되어 잘 선택한 경우)을 재현 탁하기 위해 200 μL 피펫을 사용합니다.
2. 원심 분리기 (5 분 800 XG)는, 3 ㎖의 DM 미디어에서 뜨는 및 재현 탁를 폐기합니다.
3. 다시 플레이트 세포 하나 (또는​​ 2) 잘 당 DM의 3 ㎖ 한 매트릭스 코팅 6 자에 24 우물에서 (1 : 5 확장).
4. 세포가 ~ 90 % 컨 플루 언트 될 때까지 1~2주 대한 확대; 완전히 차별화 된 순수 문화의 이미지는 그림 3C에 표시됩니다.
5. 1 ml의 세포 D와 세포를 분리37 ° C에서 약 5-8 분 issociation 솔루션은, DM 희석하여 비활성화 모든 세포를 씻어 1,000 μL 피펫을 사용하고이를 재현 탁.
6. (5 분 800 XG) 스핀 다운 18 ML의 DM 미디어에서 뜨는 및 재현 탁를 폐기합니다.
7. (6 팽창 1) 또는 ⁽²⁾ 75cm 플라스크 하나가 코팅 된 (1 : 7.5 확장) 여섯 매트릭스로 한 각 6- 웰 플레이트에서 다시 셀 웰 당 3 ㎖ DM 6- 웰 코팅.
8. 충분한 세포를 얻을 때까지 반복 3.4-3.8 필요한 단계를 반복합니다.
   참고 : 오히려 각 통로 RPE의 탈분화를 유도하기 때문에 계대를 통해 문화를 증폭 계획보다 확장 가능한 한 많은 식민지를 수집하려고합니다.

도 1에 도시 된 바와 같이,이 논문에서 설명하는 단계는, 이전에보고 된 바와 같이 ^{(10, 12)를} 용이하게 줄기 세포에서 RPE를 생성하는데 사용될 수있다. 몇 주 동안 만능 줄기 라인을 유지 한 후, 색소 식민지 5-7주 (7 주 된 문화가 그림 2A-C에 나와 있습니다) 후 식민지에서 나타나기 시작. 이러한 식민지 문화가 유지 될 때 주 동안 계속 증가 할 수 있습니다. 도 3a에 도시 된 바와 같이,도 2D-F (8 주령 배양)에 나타내는 바와 같이, 충분한 크기에 도달하면, 이들은 수동으로 절개 할 수있다. 주의 절제 크게 충분히 순수 RPE 문화 (그림 3B-C)의 생성을 촉진 할 것이다 비 망막 색소 상피 세포의 오염을 방지 할 수 있습니다.

그림 1 : 도식 묘사 만능 줄기-RPE 유도 룽. 나이브 줄기 세포가 포화 상태에 도달 할 때까지 유지 배지에서 배양 하였다. 일 0 차별화 미디어 (DM)에서의 bFGF 부족하지만 포함 된 니코틴은 (DM / NIC)를 추가됩니다. 세포를 3 주 동안이 미디어를 매일 공급된다. 주일의 끝에서 DM 매체 중 재조합 티빈 A (DM / NIC / AA) 또는 IDE-1 (DM / NIC / IDE1)을 향상시키기 RPE 스펙으로 보충하고 세포를 2 주 동안이 미디어와 함께 공급된다. 착색 식민지가 나타나기 시작이 치료 중에는 다음은 수동으로 제거 및 DM의 확장을 위해 새로운 접시로 전송할 수 있습니다 다음 몇 주 동안과 주 (8)에 의해 확대. (특정 미디어 구성 요소 표 1 참조) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2 :를 티빈d 개의 IDE-1 만능 줄기-RPE의 수율을 향상시킬 수 있습니다. (A) 작은 색소 식민지 (6 웰 플레이트의 하단에 부착입니다 자발적으로 한 장에 비 망막 색소 상피 세포 사이의 문화 일곱 주 후 일부 나타나기 시작 ) 화살표로 표시되어 있습니다. (B 및 C)보다 색소 식민지의 모양에 IDE-1 또는를 Activin 결과를 보완 (일부는 AC에 화살표가 표시되어 있습니다)를 Activin A 또는 IDE-1 중 하나와 그 보충을 보여주는이 RPE을 향상 차별화. (DF) 팔주 IDE-1 또는를 Activin과 보충의 효과 후 더욱 뚜렷하다. 두 착색 아일렛의 개수 및 크기가 지시 분화 후 크다. 스케일 바 = 5mm

그림 3 : 확장 및 터미널 차별화소비세에 충분히 큰 착색 된 만능 줄기-RPE 식민지의 색소 만능 줄기-RPE. (A) 대표 이미지입니다. 비 RPE 세포를 6 웰 플레이트의 바닥에 콜로니를 둘러싸. 파란색 1 {절제 될 영역을 표시합니다. 첫 번째 확장 단계 이후 문화 후 합류 미성숙 만능 줄기-RPE 세포의 (B) 이미지. (C) 두 개월 된 말기 분화 만능 줄기-RPE 세포를. 고급 차별화를 보여주는 명백한 셀 경계와 색소 침착의 균일 한 수준의 존재를합니다. 스케일 바 = 100 μm의

이 논문에서 우리는 효율적으로 순수 만능 줄기-RPE 문화의 큰 숫자를 생성하는 단계를 설명합니다. 우리는 우리가 강하게 transcriptomics, 단백질 체학, 대사 체학 및 기능에 따라 hRPE 유사 만능 줄기-RPE를 생성 할 수 있습니다를 Activin이 감독 분화 프로토콜을 사용하여 이전에 보여 주었다 및 RCS 쥐 ^12,31,32를 이식 할 때 그들은 망막 변성을 지연하는 것이 . 만능-RPE를 생성하는 과정은 시간이 많이 소요 아니라 고된 (도 1)이다. 만능 문화 포화 상태에 도달하면 그들은 매일 차별화 매체를 공급해야합니다. 우리를 Activin A 또는 덜 비싼 작은 분자 IDE-1 중 하나와 미디어를 보완하고, 일반적으로 5-7주 (그림 2A-C) 후 나타나는 색소 만능 줄기-RPE 식민지의 문화를 모니터링하면서 2 주 동안 먹이를 계속합니다. 일단 충분한 크기에 도달하기 (도 2D 및 3A-F), coloniES는 수동으로 제거 및 확장을위한 새로운 접시로 전송됩니다. 이것은 대략 후 8주 발생하고 전체 프로토콜의 가장 힘든 공정이다.

가장 도전적인 양태는 실수 또는 착색 된 콜로니 주변에 인접한 원치 않는 세포를 수집하여 확대 배양 비 RPE 세포의 오염을 피할 수있다. 오염의 정도에 따라, 비 RPE 세포의 배양은 섬이 증가 세균성 또는 진균 오염물을 도입하는 추가적인 위험을 처리 할 때마다 있지만, 팽창 중에 수동으로 제거 될 수있다. 이는 우리의 경험에서 만능-RPE 실제로 계대 단계 동안 오염하는 소수의 세포를 "outcompete"수 있다는 주목할 가치가있다. 그러나 우리는 강하게이 단계에 의존하는 것을 피하기 위해 가능한 한 순수 보장하기 위해 식민지를 따기 때 큰주의를 복용하는 것이 좋습니다. 두 번째 또는 세 번째 흐름으로 유도 만능 줄기-RPE 문화는 충분히 순수하고 suffi 있습니다세포의 효율적인 숫자는 특성화 및 이식에 사용할 수 있습니다.

여기에보고 기술은 확실히 줄기 세포 유래 RPE를 도출하기위한 유일한 방법이 아니다. 사실 그것은 어느 쪽도 쉬운이나 빠른 없다. 가장 쉬운 방법은 널리 자발적인 분화를 사용하는 것이다. (단, 2 주 동안 IDE-1 보충 저렴하고 크게 만능 줄기-RPE의 수율을 증가시킨다.) 만능 줄기-RPE는 또한 표면에 부착하도록 강요 할 수 편광 망막 색소 상피 세포의 분야로 분화 배아 체에서 생성 한 문화 판과는 단일 층으로 확장합니다. 망막 색소 상피 세포도 매우 적극적으로 특징 지어 강하게 hRPE ^(27)과 유사 한이 방법을 사용하여 생성합니다. RPE는 니코틴과 미디어를 보완하여 줄기 세포에서 (단지 14 일) 빠르게 매우 차별화 할 수, IGF1은 소량는 Dkk1 및 bFGF를 다음 나중에 프로 RPE는 니코틴의 요인을 추가, 신경 망막 전구 운명으로 변환차를 Activin ^(37). RPE는 cMYC, MITF,의 Otx2, RAX, CRX ⁴⁴ 및 전사 인자를 포함한 최소한의 섬유 아세포로 형질 도입하여 약 1 달 섬유 아세포에서 더욱 빠르게 직접 생성 될 수있다. 그러나 이러한 결과는 매우 RPE을 장려하는 동안은이 마지막 두 가지 기술이 아직 엄격하게 생체 내에서 그들을 이식 특징되지 않은 생성. 따라서, 우리는 그들의 연구에서 사용되는 결정할 때 독자가주의 깊게 RPE 파생 옵션을 고려하는 것이 좋습니다.

여기에 설명 된 프로토콜을 사용하는 장점은 단순함과 매우 고품질의 RPE ^(31)의 일관되게 높은 수율이다. IDE-1보다는를 Activin과 보충 크게 재조합 단백질을 사용과 관련된 위험을 전체 비용을 줄이고 낮 춥니 다. 선택이있을 것이다 분화 다른 방법을 사용하는 경우는 아직 명확하지 않기 때문에최종 생성물에 영향은, 상이한 실험실에서 생성 RPE 간의 직접 비교가 (아마도 특별히 질병 모델의 경우에) 필요하다 특히, 표준화 된 프로토콜을 이용하는 것이 바람직 할 수있다. 약간의 전문 지식과 시약을 필요로하고, 그 만능 줄기-RPE의 높은 수율을 생성 이와 같은 간단한 프로토콜은 이러한 상황에 이상적 일 수 있습니다.

None of the authors have any commercial disclosures to declare.

We wish to thank the following individuals: Drs. Tim Krohne and Eyal Banin (along with Dr. Mandy Lehmann and David Friedlander) for generous help developing the differentiation protocols. Dr. Felicitas Bucher provided assistance differentiating the RPE cells used in this study. We also acknowledge the National Eye Institute (NEI grants EY11254 and EY021416), California Institute for Regenerative Medicine (CIRM grant TR1-01219), and the Lowy Medical Research Institute (LMRI) for very generous funding for this project.