Dérivation efficace des cellules d'épithélium pigmentaire de la rétine à partir de cellules souches

Stem cell-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells may be used for multiple applications including cell-based therapies for retinal degeneration, disease modeling, and drug studies. Here we present a simple protocol for reproducibly deriving RPE from stem cells.

No cure has been discovered for age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex multifactorial disease with an unknown etiology, although it is largely thought to occur due to death or dysfunction of the retinal pigment epithelium (RPE), a monolayer of cells that underlies the retina and provides critical support for photoreceptors. RPE cell replacement strategies may hold great promise for providing therapeutic relief for a large subset of AMD patients, and RPE cells that strongly resemble primary human cells (hRPE) have been generated in multiple independent labs, including our own. In addition, the uses for iPS-RPE are not limited to cell-based therapies, but also have been used to model RPE diseases. These types of studies may not only elucidate the molecular bases of the diseases, but also serve as invaluable tools for developing and testing novel drugs. We present here an optimized protocol for directed differentiation of RPE from stem cells. Adding nicotinamide and either Activin A or IDE-1, a small molecule that mimics its effects, at specific time points, greatly enhances the yield of RPE cells. Using this technique we can derive large numbers of low passage RPE in as early as three months.

The various cell types that occupy the retina are organized in a functional architecture. The photoreceptors in the back of the retina are responsible for converting light into electrical impulses through phototransduction. However, phototransduction cannot occur without the coordinated efforts of other neighboring cell types including Mueller glia and retinal pigment epithelium (RPE) cells. A monolayer of RPE cells partitions the sensory retina from the choriocapillaris, the primary blood supply for photoreceptors, and are ideally situated to control multiple functions important for photoreceptor homeostasis. In fact, the RPE and photoreceptors are so co-dependent they are widely considered to be one single functional unit. (For a review of all the diverse functions of the RPE see Strauss, 2005¹.) Death or dysfunction of retinal pigment epithelium cells can induce age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of permanent vision loss in industrialized countries^2-4.

AMD is a multifactorial disease of RPE, photoreceptors, and the choroidal vasculature; risk factors are diverse and include combinations of environmental and genetic influences^5,6. Treatments for AMD are very limited, but one promising potential therapy is RPE cell replacement^7,8. While the outcomes have been mixed, the transplantation of RPE cells in AMD patients (and in other patients with retinal degeneration) and also in rodent models of retinal degeneration, has the potential to transiently prevent significant photoreceptor atrophy^9-23. (The animal model commonly used for these studies are Royal College of Surgeons (RCS) rats, which harbor a mutation in the MerTK gene. This mutation renders RPE cells incapable of phagocytosing photoreceptor outer segments and promotes retinal degeneration²⁴.) While the reported survival rates of implanted RPE in the subretinal space of RCS rats and mice vary greatly, there is potential for them to survive for several months or years^9,10,12,20.

RPE cells can be obtained in sufficient numbers for transplantation by deriving them from pluripotent stem cells^9-14,25-28. Several independent groups have demonstrated that these cells function in similar ways to their somatic counterparts, and long term studies suggest that they are safe upon implantation in rat and mouse disease models^{9,10,12,14,19,20,25,29-32}. The use of induced pluripotent stem cells instead of embryonic stem cells may be advantageous since ethical issues and immunological challenges associated with allogeneic RPE may be obviated^33,34. Another exciting application for iPS technology is disease modeling³⁵. The ability to interrogate large numbers of RPE cells derived from patients with RPE diseases could be invaluable for understanding their molecular bases. This type of study has been performed recently with Best disease patient RPE and could pave the way for similar studies of inherited maculopathies³⁶.

The derivation of RPE from stem cells is a relatively simple process and can be done entirely in xeno-free conditions. The simplest strategy is to derive monolayers of RPE cells spontaneously, however, the yield can be significantly improved using directed differentiation techniques. But these techniques involve the use of exogenous protein factors that can be expensive and often generated in bacteria or other non-human sources^10,12,37. In our studies we followed an established protocol¹⁰ that utilizes nicotinamide and Activin A, a signaling factor that has been shown to be sufficient for RPE specification³⁸. Here we will demonstrate that the small molecule IDE-1 can adequately replace Activin A, thus reducing costs and alleviating concerns associated with the use of recombinant proteins³⁹. Additionally, we utilize xeno-free serum replacement, and we culture the differentiating RPE cells on a synthetic xeno-free substrate. RPE cells have been shown previously to differentiate very effectively using this approach⁴⁰.

When differentiated as a monolayer, we visualize pigmented colonies containing RPE cells after as early as five weeks¹². Once they reach sufficient size, they can be manually excised and transferred to another dish for expansion. RPE cells are notorious for dedifferentiating with each passage, and the use of anything older than five passages should be avoided (we find that sufficient numbers of cells for characterization and transplantation in animal models can easily be generated after two or three passages). Once fully differentiated, we employ multiple techniques to characterize the cells anatomically and functionally to ensure that they will serve as adequate replacements for diseased RPE. The description of these techniques, and protocol for implanting the iPS-RPE in the subretinal space of rodents, are beyond the scope of this methods paper and have been previously published^12,32,41.

While developing standardized protocols for effective derivation of iPS-RPE is clearly important for the clinics, there is also significant preclinical work to still be done in animal models. There are concerns regarding immunogenicity of iPS-derived cells, and multiple different implantation techniques, including implanting cells on artificial substrates, are being explored^42,43. For these reasons, we feel that the publication of standardized protocols is beneficial to facilitate both clinical and preclinical studies. Especially if direct comparisons will be done of iPS-RPE cells derived in different labs by different research groups.

1. différenciation dirigée des cellules souches dérivées RPE

Remarque: Toutes les étapes d'incubation sont effectuées à 37 ° C dans 5% de CO ₂

1. Maintenir les lignes ou les hanches (hES nourrir quotidienne) dans les médias de maintenance (MM; Tableau 1). Une fois que les lignes ont atteint les normes suffisantes de contrôle de la qualité, les maintenir sur une couche de cellules nourricières de souris embryonnaires (MEF) ensemencé à une densité de 250 000 / puits d'une plaque de six. Cultures sans Xeno-peuvent également être générés suivant le protocole établi par Tucker et al. ^40.
2. Autoriser les colonies de cellules souches pour atteindre la confluence.
3. Mettre aux médias de différenciation avec nicotinamide (DM / NIC; Tableau 1); nourrir tous les jours.
4. Après trois semaines de culture, passer aux médias de différenciation avec nicotinamide et soit activine-A ou IDE-1 (DM / NIC / AA ou DM / NIC / IDE1; Tableau 1) pour améliorer la différenciation des RPE.
5. Après cinq semaines de culture, revenir au DM / NIC. Tétées quotidiennes ne sont plus nécessaires une fois que les indicateurs de pH dans l'arrêt de médias jaunir le jour après le repas.
6. Attendez îlots de cellules pigmentées à comparaître qui sont assez grand pour être coupé et enlevé (voir les figures 2D-F et 3A).

2. Isolating pigmentées îlots

1. Enduire les puits d'une plaque de 24 puits avec une matrice qui imite l'environnement naturel des cellules (est préférable gratuitement xéno-).
   REMARQUE: lames de la cornée et tranchants, pinces à pointe fine sont très utiles pour la cueillette. La totalité de la feuille de cellules différenciées peut se détacher alors que la cueillette. Évitez cela en travaillant avec soin et initialement prélèvement de colonies dans le centre de l'assiette.
2. Remplissez autant de puits de la plaque de 24 puits avec les médias de différenciation (DM; Tableau 1) que nécessaire. Cette décision dépendra du nombre de colonies pigmentéesrecueillis.
3. Dans une hotte de culture cellulaire avec un microscope à dissection, couper manuellement îlots pigmentées. Hacher chaque îlot au bas de la plaque d'origine en utilisant un scalpel dans environ 6/2 pièces et saisir les parties pigmentées avec des pinces coupantes.
4. Transfert 1-2 pièces pigmentées dans chaque 24 puits.
5. Ne pas changer de support pendant 3-5 jours jusqu'à ce que les cellules adhèrent, puis commencer à changer de support trois fois par semaine. (Se ils ne adhèrent pas après cette heure, la probabilité est bon qu'ils ne le sera jamais).
6. Développer cellules pendant 3-4 semaines dans les médias de différenciation (DM; Tableau 1) - Une image d'une culture typique est montré à la figure 3B. Les cellules peuvent toujours pas remplir la totalité de bien, mais attendre plus longtemps ne semble pas aider. Nourrir les cellules trois fois par semaine.
7. Après environ trois semaines, supprimer manuellement des amas de cellules blanches en bouquets si nécessaire avec des pinces coupantes. Ne faites pas cette étape si cela est nécessaire - il est facile d'introduire des contaminants. Il est idéal pourtenter d'obtenir plus purs populations de RPE des colonies pigmentées d'origine à l'étape 1.6.

3. Le repiquage de cellules souches dérivées RPE

1. Détacher les cellules avec 200 ul d'une solution de dissociation cellulaire (de préférence pas trypsine un réactif qui peut être inactivée par dilution est préférable) pour 5-8 minutes à 37 ° C, et l'inactiver par dilution avec du DM. Utiliser une pipette de 200 pi pour laver toutes les cellules et de les remettre en suspension (Si le bien sélectionné ne contient que quelques cellules, envisager la mise en commun des cellules de deux 24-puits).
2. Centrifugeuse (800 g pendant 5 min), éliminer le surnageant et remettre en suspension dans 3 ml de milieu de DM.
3. Re-cellules d'une plaque (ou deux) 24-puits dans une matrice revêtue de 6 puits dans 3 ml de DM par puits (1: 5 expansion).
4. Développer pendant 1-2 semaines jusqu'à ce que les cellules sont ~ 90% de confluence; une image d'une culture pure entièrement différenciée est représenté sur la figure 3C.
5. Détacher les cellules avec 1 ml cellule dsolution issociation pendant environ 5-8 min à 37 ° C, l'inactiver par dilution avec DM, utilisez 1000 pipette ul pour laver toutes les cellules, et les remettre en suspension.
6. Isoler (800 g pendant 5 min), éliminer le surnageant et remettre en suspension dans 18 ml de milieu de DM.
7. Re-cellules de la plaque 6 puits une dans chaque matrice six puits revêtus 6 dans 3 ml de DM par puits (1: 6 expansion) ou revêtue d'un ballon de 75 cm ² (1: 7,5 expansion).
8. Répétez les étapes 3.4 à 3.8 que nécessaire jusqu'à ce que suffisamment de cellules sont obtenues.
   REMARQUE: Essayez de recueillir autant de colonies que possible pour l'expansion plutôt que de planifier pour amplifier les cultures via des passages depuis chaque passage induit RPE dédifférenciation.

Les étapes décrites dans ce manuscrit, comme représenté sur la figure 1, peuvent être utilisés pour générer facilement RPE partir de cellules souches tel que présenté antérieurement ^10,12. Après avoir maintenu les lignes iPS pour plusieurs semaines, des colonies pigmentées commencent à apparaître dans les colonies après 5-7 semaines (7 semaines vieilles cultures sont présentées à la figure 2A-C). Ces colonies peuvent continuer à croître pendant des semaines que les cultures sont maintenues. Une fois atteint tailles suffisantes, comme représenté sur la figure 2D-F (8 semaines) vieilles cultures, ils peuvent être excisés manuellement comme illustré sur la figure 3A. Excision attention pour éviter toute contamination avec des cellules non-RPE facilitera grandement la génération des cultures RPE suffisamment pur (figure 3B-C).

Figure 1: Schéma dépeignant iPS-RPE dérivation . Cellules souches naïves sont cultivées dans des milieux de maintenance jusqu'à atteindre la confluence. Au jour 0 médias de différenciation (DM) manque bFGF mais contenant nicotinamide est ajoutée (DM / NIC). Les cellules sont nourris quotidiennement avec ce média pour trois semaines. À la fin de trois semaines les médias de DM est complété avec soit activine A (/ NIC / AA DM) ou IDE-1 (DM / NIC / IDE1) afin d'améliorer la spécification de l'EPR recombinant et les cellules sont nourris avec ce média pour deux semaines. Lors de ce traitement colonies pigmentées commencent à apparaître, ces agrandir au cours des prochaines semaines et par semaine 8 peut être enlevé manuellement et transférés dans de nouvelles plaques d'expansion dans DM. (Voir le tableau 1 pour les composants spécifiques des médias) Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2: une activine Ad petites colonies pigmentées IDE-1 d'améliorer le rendement des iPS-RPE. (A) commencent à apparaître après sept semaines de culture spontanément entre les cellules non-RPE dans une seule feuille qui est adhérente au fond d'une plaque à 6 puits (certains sont marqués par des flèches). (B et C) La supplémentation avec des résultats IDE-1 ou l'activine A dans l'apparence de même colonies plus pigmentées (certains sont marqués avec des flèches en AC), démontrant que la supplémentation avec soit activine A ou IDE-1 améliore RPE différenciation. (DF) Après 8 semaines, les effets de la supplémentation avec IDE-1 ou l'activine A sont encore plus prononcée. Les deux numéros et tailles des îlots pigmentées sont plus grandes après différenciation dirigée. La barre d'échelle = 5 mm

Figure 3: Expansion et différenciation terminale desiPS-RPE pigmentées. (A) Représentant l'image d'une colonie pigmentée iPS-RPE qui est assez grand à l'accise. Les cellules non RPE entourent la colonie dans le fond d'une plaque à 6 puits. Le contour bleu marque la région qui serait excisé. (B) Image de cellules post-confluentes immatures iPS-RPE dans la culture après la première étape d'expansion. (C) l'âge de deux mois cellules iPS-RPE terminale différenciées. Notez la présence de limites des cellules évidentes et niveaux homogènes de pigmentation démontrant la différenciation avancée. Barres d'échelle = 100 um

Dans ce manuscrit, nous décrivons les étapes pour générer efficacement un grand nombre de cultures iPS-RPE pures. Nous avons montré précédemment en utilisant ce protocole de différenciation dirigée avec activine A que nous pouvons générer iPS-RPE qui ressemblent fortement hRPE basée sur la transcriptomique, protéomique, métabolomique et fonctionnalité, et qu'ils retarder la dégénérescence rétinienne lorsqu'ils sont implantés chez des rats RCS ^12,31,32 . Le processus de génération iPS-RPE prend du temps, mais pas laborieux (figure 1). Une fois que les cultures atteignent la confluence iPS elles doivent être nourries avec un milieu de différenciation sur une base quotidienne. Nous complétons les médias soit avec l'activine A ou une moins chère petite molécule IDE-1, et de continuer à nourrir pendant deux semaines tout en surveillant les cultures pour les colonies iPS-RPE pigmentées qui apparaissent généralement après 5-7 semaines (Figure 2A-C). Une fois atteint des tailles suffisantes (Figures 2D-F et 3A), les colonses sont retirés manuellement et transférés dans de nouvelles plaques d'expansion. Cela se produit à peu près au bout de 8 semaines et est l'étape la plus laborieuse de l'ensemble du protocole.

L'aspect le plus difficile est d'éviter la contamination par des cellules non-RPE dans les cultures en expansion en collectant accidentellement cellules voisines indésirables dans ou autour des colonies pigmentées. Selon le degré de contamination, îlots de cellules non-RPE peuvent être retirés manuellement lors de l'expansion, bien que chaque fois que les cultures sont traitées risques supplémentaires consistant à introduire des contaminants bactériens ou fongiques sont augmentés. Il est à noter que, dans notre expérience, la iPS-RPE peut effectivement "supplanter" un petit nombre de cellules contaminantes pendant les étapes de repiquage. Mais nous vous recommandons fortement de prendre la plus grande prudence lors de la cueillette des colonies pour se assurer qu'ils sont aussi pur que possible pour éviter d'avoir à recourir à ces étapes. Par le deuxième ou le troisième passage des cultures iPS-RPE sont suffisamment pur et suffinuméros caces de cellules sont disponibles pour la caractérisation et l'implantation.

La technique présentée ici ne est certainement pas la seule méthode pour dériver les cellules souches dérivées RPE. En fait, ce ne est ni le plus facile, ni le plus rapide. La méthode la plus simple et la plus largement est d'utiliser différenciation spontanée. (Cependant, la supplémentation avec IDE-1 pendant deux semaines est peu coûteux et augmente considérablement le rendement des iPS-RPE.) IPS-RPE ont également généré en corps embryoïdes qui se différencient en sphères de cellules RPE polarisés qui peuvent être contraints d'adhérer à la surface de des plaques de culture et d'élargir en monocouche. Cellules RPE génèrent en utilisant cette méthode ont également été caractérisé très vigoureusement et ressemblent fortement hRPE ^27. RPE permet de différencier très rapidement (en seulement 14 jours) à partir de cellules souches en complétant les médias avec nicotinamide, IGF1, Noggin, Dkk1 et bFGF pour les convertir en neurones destins progénitrices rétiniennes, puis en ajoutant plus tard, le pro-RPE facteurs nicotinamide unee activine A ^37. RPE peut également être généré encore plus rapidement directement à partir de fibroblastes dans environ un mois par transduction les fibroblastes avec un ensemble minimal de facteurs de transcription, y compris cmyc, MITF, OTX2, RAX et CRX ^44. Cependant, si ces résultats sont très encourageants l'EPR généré ces deux dernières techniques ne ont pas encore été caractérisé dynamique, par l'implantation in vivo. Par conséquent, nous suggérons que le lecteur examiner toutes les options RPE de dérivation attentivement au moment de décider qui d'employer dans leurs études.

Les avantages de l'utilisation du protocole décrit ici sont sa simplicité et les rendements constamment élevés de RPE de très haute qualité ^31. La supplémentation avec IDE-1 plutôt que activine A réduit considérablement le coût global et réduit le risque associé à l'utilisation de protéines recombinantes. Comme il ne est pas encore clair si le choix d'utiliser différentes méthodes de différenciation auraun impact sur le produit final, il pourrait être avantageux d'utiliser des protocoles normalisés, en particulier si des comparaisons directes entre RPE générée dans différents laboratoires seront nécessaires (peut-être en particulier dans le cas de la modélisation de la maladie). Un protocole simple comme celui-ci qui nécessite peu d'expertise et réactifs, et qui génère un rendement élevé des iPS-EPR, pourrait être idéal pour ces situations.

None of the authors have any commercial disclosures to declare.

We wish to thank the following individuals: Drs. Tim Krohne and Eyal Banin (along with Dr. Mandy Lehmann and David Friedlander) for generous help developing the differentiation protocols. Dr. Felicitas Bucher provided assistance differentiating the RPE cells used in this study. We also acknowledge the National Eye Institute (NEI grants EY11254 and EY021416), California Institute for Regenerative Medicine (CIRM grant TR1-01219), and the Lowy Medical Research Institute (LMRI) for very generous funding for this project.