Derivazione efficiente di cellule retiniche epitelio pigmentato da cellule staminali

Stem cell-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells may be used for multiple applications including cell-based therapies for retinal degeneration, disease modeling, and drug studies. Here we present a simple protocol for reproducibly deriving RPE from stem cells.

No cure has been discovered for age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex multifactorial disease with an unknown etiology, although it is largely thought to occur due to death or dysfunction of the retinal pigment epithelium (RPE), a monolayer of cells that underlies the retina and provides critical support for photoreceptors. RPE cell replacement strategies may hold great promise for providing therapeutic relief for a large subset of AMD patients, and RPE cells that strongly resemble primary human cells (hRPE) have been generated in multiple independent labs, including our own. In addition, the uses for iPS-RPE are not limited to cell-based therapies, but also have been used to model RPE diseases. These types of studies may not only elucidate the molecular bases of the diseases, but also serve as invaluable tools for developing and testing novel drugs. We present here an optimized protocol for directed differentiation of RPE from stem cells. Adding nicotinamide and either Activin A or IDE-1, a small molecule that mimics its effects, at specific time points, greatly enhances the yield of RPE cells. Using this technique we can derive large numbers of low passage RPE in as early as three months.

The various cell types that occupy the retina are organized in a functional architecture. The photoreceptors in the back of the retina are responsible for converting light into electrical impulses through phototransduction. However, phototransduction cannot occur without the coordinated efforts of other neighboring cell types including Mueller glia and retinal pigment epithelium (RPE) cells. A monolayer of RPE cells partitions the sensory retina from the choriocapillaris, the primary blood supply for photoreceptors, and are ideally situated to control multiple functions important for photoreceptor homeostasis. In fact, the RPE and photoreceptors are so co-dependent they are widely considered to be one single functional unit. (For a review of all the diverse functions of the RPE see Strauss, 2005¹.) Death or dysfunction of retinal pigment epithelium cells can induce age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of permanent vision loss in industrialized countries^2-4.

AMD is a multifactorial disease of RPE, photoreceptors, and the choroidal vasculature; risk factors are diverse and include combinations of environmental and genetic influences^5,6. Treatments for AMD are very limited, but one promising potential therapy is RPE cell replacement^7,8. While the outcomes have been mixed, the transplantation of RPE cells in AMD patients (and in other patients with retinal degeneration) and also in rodent models of retinal degeneration, has the potential to transiently prevent significant photoreceptor atrophy^9-23. (The animal model commonly used for these studies are Royal College of Surgeons (RCS) rats, which harbor a mutation in the MerTK gene. This mutation renders RPE cells incapable of phagocytosing photoreceptor outer segments and promotes retinal degeneration²⁴.) While the reported survival rates of implanted RPE in the subretinal space of RCS rats and mice vary greatly, there is potential for them to survive for several months or years^9,10,12,20.

RPE cells can be obtained in sufficient numbers for transplantation by deriving them from pluripotent stem cells^9-14,25-28. Several independent groups have demonstrated that these cells function in similar ways to their somatic counterparts, and long term studies suggest that they are safe upon implantation in rat and mouse disease models^{9,10,12,14,19,20,25,29-32}. The use of induced pluripotent stem cells instead of embryonic stem cells may be advantageous since ethical issues and immunological challenges associated with allogeneic RPE may be obviated^33,34. Another exciting application for iPS technology is disease modeling³⁵. The ability to interrogate large numbers of RPE cells derived from patients with RPE diseases could be invaluable for understanding their molecular bases. This type of study has been performed recently with Best disease patient RPE and could pave the way for similar studies of inherited maculopathies³⁶.

The derivation of RPE from stem cells is a relatively simple process and can be done entirely in xeno-free conditions. The simplest strategy is to derive monolayers of RPE cells spontaneously, however, the yield can be significantly improved using directed differentiation techniques. But these techniques involve the use of exogenous protein factors that can be expensive and often generated in bacteria or other non-human sources^10,12,37. In our studies we followed an established protocol¹⁰ that utilizes nicotinamide and Activin A, a signaling factor that has been shown to be sufficient for RPE specification³⁸. Here we will demonstrate that the small molecule IDE-1 can adequately replace Activin A, thus reducing costs and alleviating concerns associated with the use of recombinant proteins³⁹. Additionally, we utilize xeno-free serum replacement, and we culture the differentiating RPE cells on a synthetic xeno-free substrate. RPE cells have been shown previously to differentiate very effectively using this approach⁴⁰.

When differentiated as a monolayer, we visualize pigmented colonies containing RPE cells after as early as five weeks¹². Once they reach sufficient size, they can be manually excised and transferred to another dish for expansion. RPE cells are notorious for dedifferentiating with each passage, and the use of anything older than five passages should be avoided (we find that sufficient numbers of cells for characterization and transplantation in animal models can easily be generated after two or three passages). Once fully differentiated, we employ multiple techniques to characterize the cells anatomically and functionally to ensure that they will serve as adequate replacements for diseased RPE. The description of these techniques, and protocol for implanting the iPS-RPE in the subretinal space of rodents, are beyond the scope of this methods paper and have been previously published^12,32,41.

While developing standardized protocols for effective derivation of iPS-RPE is clearly important for the clinics, there is also significant preclinical work to still be done in animal models. There are concerns regarding immunogenicity of iPS-derived cells, and multiple different implantation techniques, including implanting cells on artificial substrates, are being explored^42,43. For these reasons, we feel that the publication of standardized protocols is beneficial to facilitate both clinical and preclinical studies. Especially if direct comparisons will be done of iPS-RPE cells derived in different labs by different research groups.

1. differenziazione Regia di Stem Cell-RPE derivati

NOTA: Tutte le fasi di incubazione sono eseguite a 37 ° C in 5% CO ₂

1. Mantenere le linee hES o anche (sfamare giorno) in mezzi di manutenzione (MM; Tabella 1). Una volta che le linee hanno raggiunto un livello sufficiente di controllo della qualità, li mantengono su uno strato di cellule feeder embrionali di topo (MEF) seminate ad una densità di 250.000 / pozzetto di una piastra ben sei. Culture senza Xeno possono anche essere generati seguendo il protocollo stabilito dalla Tucker et al. ^40.
2. Lasciare le colonie di cellule staminali per raggiungere confluenza.
3. Passare ai media differenziazione Nicotinamide (DM / NIC, tabella 1); alimentare quotidiano.
4. Dopo tre settimane di cultura, passare a mezzi di differenziazione con nicotinamide e sia Activin-A o IDE-1 (DM / NIC / AA o DM / NIC / IDE1; Tabella 1) per migliorare la differenziazione RPE.
5. Dopo cinque settimane di cultura, tornare a DM / NIC. Poppate giornaliere non sono più necessarie, una volta gli indicatori di pH nei fermata supporto girando giallo il giorno dopo la poppata.
6. Attendere isolotti di cellule pigmentate a comparire che sono abbastanza grandi per essere tagliato e rimosso (vedi figure 2D-F e 3A).

2. isolanti pigmentate Islets

1. Rivestire le pozzetti di una piastra da 24 pozzetti con una matrice che simula l'ambiente naturale delle cellule (senza xeno è preferibile).
   NOTA: le lame affilate, cornea e pinze dalla punta sottile sono molto utili per la raccolta. L'intero foglio di cellule differenziate possono staccarsi mentre la raccolta. Evitare questo lavorando con attenzione e inizialmente raccolta colonie nel centro del piatto.
2. Riempire altrettanti pozzetti della piastra 24 pozzetti con i media differenziazione (DM; Tabella 1) come necessario. Questa decisione dipenderà dal numero di colonie pigmentateraccolti.
3. In una cappa di coltura cellulare con un ambito dissezione, tagliate manualmente isolotti pigmentate. Tritare ogni isolotto sul fondo del piatto originale utilizzando un bisturi in circa 2-6 pezzi e afferrare le parti pigmentate con pinze taglienti.
4. Trasferire 1-2 pezzi pigmentate in ogni 24 pozzetti.
5. Non modificare i media per 3-5 giorni fino cellule aderiscono, quindi iniziare a cambiare i media tre volte a settimana. (Se non aderiscono dopo questo tempo, la probabilità è bene che non lo farà mai).
6. Espandere le cellule per 3-4 settimane a supporto di differenziazione (DM; Tabella 1) - L'immagine di una cultura tipica è mostrato in figura 3B. Le cellule non possono ancora riempire tutto bene, ma aspettare più a lungo non sembra aiutare. Concime cellule tre volte alla settimana.
7. Dopo circa 3 settimane, rimuovere manualmente gruppi di globuli bianchi in gruppi, se necessario, con una pinza taglienti. Non fare questo passo se non è necessario - è facile introdurre contaminanti. E 'ideale percercare di ottenere più pure popolazioni RPE dalle colonie pigmentate originali al punto 1.6.

RPE 3. Passaging Stem-Cell derivati

1. Staccare cellule con 200 microlitri con una soluzione di dissociazione cellulare (preferibilmente non tripsina-un reagente che può essere inattivato mediante diluizione è preferibile) per 5-8 minuti a 37 ° C, e inattivare esso diluendo con DM. Utilizzare una pipetta 200 microlitri per lavare via tutte le cellule e risospendere loro (Se il pozzetto selezionato contiene solo poche cellule, prendere in considerazione la messa in comune le cellule da due 24 pozzetti).
2. Centrifuga (800 xg per 5 minuti), scartare il surnatante e risospendere in 3 ml DM media.
3. Cellule Re-piastra da uno (o due) 24 pozzetti in una matrice rivestite 6 pozzetti in 3 ml di DM per pozzetto (1: 5 di espansione).
4. Espandere per 1-2 settimane, fino a quando le cellule sono ~ 90% confluenti; l'immagine di coltura pura completamente differenziata è mostrato in Figura 3C.
5. Staccare le cellule con 1 ml di cellule dSoluzione issociation per circa 5-8 minuti a 37 ° C, inattivare dal diluizione con DM, utilizzare 1.000 microlitri pipetta per lavare via tutte le cellule, e risospendere.
6. Spin down (800 xg per 5 minuti), scartare il surnatante e risospendere in 18 ml DM media.
7. Cellule Re-piastra da 6 pozzetti uno ciascuno in sei matrice 6-pozzetti rivestiti in 3 ml di DM per pozzetto (1: 6 espansione) o uno rivestite 75 centimetri ² beuta (1: 7,5 espansione).
8. Ripetere i passaggi 3,4-3,8 necessaria fino a quando si ottengono abbastanza cellule.
   NOTA: cercare di raccogliere il maggior numero possibile di colonie di espansione piuttosto che la pianificazione di amplificare le culture attraverso passaging poiché ogni passaggio induce RPE dedifferentiation.

La procedura descritta in questo manoscritto, come illustrato nella figura 1, possono essere utilizzati per generare facilmente RPE da cellule staminali come precedentemente riportato ^10,12. Dopo aver mantenuto le linee iPS per diverse settimane, colonie pigmentate cominciano ad apparire nelle colonie dopo 5-7 settimane (7 settimane vecchie culture sono mostrati in figura 2A-C). Queste colonie possono continuare a crescere per settimane come le culture sono mantenuti. Una volta raggiunto dimensioni sufficienti, come mostrato nella Figura 2D-F (8 settimane di età culture), possono essere asportati manualmente come illustrato nella Figura 3A. Escissione attenzione ad evitare la contaminazione con le cellule non-RPE agevolerà notevolmente la generazione di colture sufficientemente puri RPE (Figura 3B-C).

Figura 1: Schema raffigurante iPS-RPE derivazione . Le cellule staminali Naive sono coltivate in mezzi di manutenzione fino a raggiungere confluenza. Al giorno 0 supporti differenziazione (DM) manca bFGF ma contenenti nicotinamide è aggiunto (DM / NIC). Le cellule sono alimentati quotidianamente con questo supporto per tre settimane. Alla fine di tre settimane i media DM è integrato sia con Activin A (DM / NIC / AA) specifica ricombinante RPE o IDE-1 (DM / NIC / IDE1) per migliorare e le cellule sono alimentati con questo supporto per due settimane. Durante questo trattamento colonie pigmentate cominciano ad apparire, questi ingrandire nel corso delle prossime settimane e per settimana 8 può essere rimosso e trasferito a nuove piastre per l'espansione in DM manualmente. (Vedi Tabella 1 per componenti multimediali specifici) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2: attivina A und piccole colonie pigmentate IDE-1 migliorare la resa di IPS-RPE. (A) cominciano ad apparire dopo sette settimane in coltura spontaneamente tra cellule non RPE in un singolo foglio che è aderente al fondo di una piastra da 6 pozzetti (alcuni sono contrassegnati con le frecce). (B e C), integrazione con i risultati IDE-1 o Activin A nella comparsa anche di colonie più pigmentati (alcuni sono contrassegnati con frecce in AC) a dimostrazione che la supplementazione con o Activin A o IDE-1 aumenta RPE differenziazione. (DF) Dopo 8 settimane gli effetti della supplementazione con IDE-1 o Activin A sono ancora più pronunciato. Sia il numero e le dimensioni delle isole pigmentate sono più grandi dopo la differenziazione diretta. Barra di scala = 5 mm

Figura 3: espansione e differenziazione terminaleiPS-RPE pigmentate. (A) immagine Rappresentante di una colonia di pigmentato iPS-RPE che è abbastanza grande da accise. Cellule non-RPE circondano la colonia nel fondo di una piastra da 6 pozzetti. Il contorno blu segna la regione che verrebbe asportato. (B) Immagine di post-confluenti cellule immature iPS-RPE della cultura dopo la prima fase di espansione. (C) due mesi di età differenziate cellule iPS-RPE. Si noti la presenza di bordi delle celle evidenti e livelli omogenei di pigmentazione che dimostrano differenziazione avanzata. Bar Scala = 100 micron

In questo manoscritto abbiamo delineare i passi per generare in modo efficiente grandi quantità di culture iPS-RPE puri. Abbiamo dimostrato in precedenza con questo protocollo di differenziazione diretto con Activin A che possiamo generare iPS-RPE che assomigliano fortemente hRPE base di trascrittomica, proteomica, metabolomica, e funzionalità, e che ritardare la degenerazione retinica quando impiantato in ratti RCS ^12,31,32 . Il processo di generazione IPS-RPE richiede molto tempo, ma non laboriosa (Figura 1). Una volta che le culture IPS raggiungono la confluenza devono essere alimentati con mezzi differenziazione su base giornaliera. Ci completiamo i media sia con Activin A o una meno costosa piccola molecola IDE-1, e continuare ad alimentare per due settimane durante il monitoraggio delle culture per pigmentate colonie iPS-RPE che in genere compaiono dopo 5-7 settimane (Figura 2A-C). Una volta raggiunto dimensioni sufficienti (figure 2D-F e 3A), i colonies vengono rimossi manualmente e trasferite in piastre di espansione. Questo avviene approssimativamente dopo 8 settimane ed è il passo più laborioso l'intero protocollo.

L'aspetto più difficile è evitare la contaminazione con le cellule non-RPE nelle culture espansione raccogliendo accidentalmente cellule vicine indesiderate o intorno alle colonie pigmentate. A seconda del grado di contaminazione, isole di cellule non RPE possono essere rimossi manualmente durante l'espansione, anche se ogni volta le colture vengono trattate ulteriori rischi di introduzione di contaminanti batterici o fungini sono aumentati. Vale la pena notare che nella nostra esperienza IPS-RPE può effettivamente "outcompete" un piccolo numero di cellule contaminanti durante le fasi Passaging. Ma si consiglia vivamente di prendere molta cautela al momento del ritiro delle colonie per garantire che siano il più puro possibile per evitare di dover ricorrere a questa procedura. Con il secondo o terzo passaggio culture iPS-RPE sono sufficientemente puri e suffinumero cienti di cellule sono disponibili per la caratterizzazione e l'impianto.

La tecnica qui riportato non è certamente l'unico metodo per derivare cellule staminali derivate RPE. In realtà non è né il più facile né veloce. Il metodo più semplice e più ampiamente consiste nell'utilizzare differenziazione spontanea. (Tuttavia, la supplementazione con IDE-1 per due settimane è poco costoso e aumenta notevolmente la resa di IPS-RPE.) IPS-RPE hanno generato anche in corpi embrionali che differenziano in sfere di cellule RPE polarizzate che possono essere costretti ad aderire alla superficie piastre di coltura e si espandono come un monostrato. Cellule RPE generano con questo metodo sono stati anche molto energicamente caratterizzato e fortemente assomigliare hRPE ^27. RPE in grado di differenziare in modo estremamente rapido (in soli 14 giorni) da cellule staminali integrando media con nicotinamide, IGF1, Noggin, Dkk1, e bFGF per convertirli in neurali progenitrici della retina destino, poi aggiungere il pro-RPE fattori nicotinamide unnd Activin A ^37. RPE può essere generato ancora più rapidamente direttamente da fibroblasti in circa un mese trasduzione dei fibroblasti con un insieme minimo di fattori di trascrizione tra cui cMyc, MITF, OTX2, RAX, e CRX ^44. Tuttavia, mentre questi risultati sono molto incoraggianti RPE generato questi ultimi due tecniche non sono ancora stati rigorosamente caratterizzato dal loro impianto in vivo. Pertanto, suggeriamo che il lettore consideri tutte le opzioni RPE derivazione con attenzione al momento di decidere quale impiegare nei loro studi.

I vantaggi di usare il protocollo descritto qui sono la sua semplicità e costantemente alte rese di RPE altissima qualità ^31. La supplementazione con IDE-1, piuttosto che Activin A riduce notevolmente il costo complessivo e riduce il rischio connesso con l'utilizzo di proteine ​​ricombinanti. Poiché non è ancora chiaro se la scelta di utilizzare diversi metodi di differenziazione avràun impatto sul prodotto finale, potrebbe essere vantaggioso utilizzare protocolli standardizzati, soprattutto se confronti diretti tra RPE generato nei vari laboratori saranno necessari (forse in particolare nel caso di modelli di malattia). Un protocollo semplice come questo che richiede poca esperienza e reagenti, e che genera ad alto rendimento di IPS-RPE, potrebbe essere l'ideale per queste situazioni.

None of the authors have any commercial disclosures to declare.

We wish to thank the following individuals: Drs. Tim Krohne and Eyal Banin (along with Dr. Mandy Lehmann and David Friedlander) for generous help developing the differentiation protocols. Dr. Felicitas Bucher provided assistance differentiating the RPE cells used in this study. We also acknowledge the National Eye Institute (NEI grants EY11254 and EY021416), California Institute for Regenerative Medicine (CIRM grant TR1-01219), and the Lowy Medical Research Institute (LMRI) for very generous funding for this project.