Микропланшет анализа для оценки химического воздействия на RBL-2H3 дегрануляцию тучных клеток: Влияние триклозан без использования органического растворителя

Дегрануляцию тучных клеток, высвобождение медиаторов аллергии, играет важную роль в аллергии, астмы и паразитов защиты. Здесь мы показываем, методы ¹ для оценки воздействия наркотиков и токсикантов на дегрануляцию, методология недавно использовали проявляют мощное тормозящее действие антибактериальный агент триклозан ^2.

Тучные клетки играют важную роль в аллергических заболеваний и иммунной защиты от паразитов. После активации (например, путем аллергеном), их дегрануляции, процесс, который приводит к экзоцитоз медиаторов аллергии. Модуляция дегрануляцию тучных клеток на наркотики и токсические вещества могут иметь положительные или неблагоприятное воздействие на здоровье человека. Мачта функции клеток была расчлененный подробно с использованием крыс базофильные клетки лейкоз тучных (RBL-2H3), широко распространенной моделью человеческой клетки слизистой оболочки мачта ^3-5. Мачта компонент гранул клеток и аллергический посредник β-гексозаминидазы, которая распространяется линейно в тандеме с гистамина из тучных клеток ^6, можно легко и надежно измерять посредством реакции с флуорогенного субстрата с образованием измеримые интенсивности флуоресценции в микропланшет-анализа, который поддается высокой пропускной исследования ^1. Первоначально опубликовано Naal соавт. ^1, мы адаптировали эту дегрануляции тест для скрининга OF наркотиков и токсикантов и продемонстрировать его использование здесь.

Триклозан широким спектром антибактериального агента, который присутствует во многих потребительских товарах и было обнаружено, что терапевтический помощь в человеческих аллергических заболеваний кожи ^7-11, хотя механизм этого эффекта неизвестна. Здесь мы показываем, анализа на эффект триклозана на дегрануляцию тучных клеток. Недавно мы показали, что триклозан сильно влияет на функции клеток мачты ^2. В попытке избежать использование органических растворителей, триклозан растворяли непосредственно в водном буфере с высокой температурой и перемешивании, и полученную концентрации подтверждена с помощью УФ-и видимой области спектра (с использованием ε ₂₈₀ = 4200 л / M / см) ^12. Этот протокол имеет потенциал для использования с различными химическими веществами, чтобы определить их воздействие на дегрануляцию тучных клеток, и более широко, их аллергический потенциал.

Тучные клетки высоко гранулированный иммунные эффекторные клетки, которые служат ключевыми медиаторами при астме, аллергии, паразиты обороны и канцерогенез ^13-16. Они живут почти в каждой ткани васкуляризированной ^15, где они безопасно хранить аллергических и воспалительных медиаторов в цитоплазматических гранул до момента активации к дегрануляции. Дегрануляция является экзоцитоз мембраносвязанных гранул, что приводит к выделению фармакологически активных медиаторов, таких как гистамин, триптазы и лейкотриены ^15. Этот процесс приводит к инициированию типа я реакции гиперчувствительности, которые являются критическими в монтажной защиту против паразитов, а также инициирование аллергический, астматический, и канцерогенных ответов ^15.

Тучные клетки и базофилы выразить FcεRI рецепторов с высоким сродством рецепторы для иммуноглобулина Е (IgE) ^17. Воздействие аллергеном или антигеном вызывает агрегации множественного IgE-связанных рецепторов FcεRI ^17, и именно с этойо-называемый "сшивание" от IgE-связанного Fc рецепторов, который инициирует процесс дегрануляции: каскад событий фосфорилирования тирозина, активацию фосфолипазы С, отток кальция из внутренних запасов и приток кальция в клетку ^18. Этот приток кальция необходимо для дегрануляции, и, кроме того, сигналы гранул сплав с мембраной до возникновения экзоцитоз гранул ^15. Экспериментально кальциевого ионофора может быть использован для трансфера кальций непосредственно через клеточную мембрану ^19, которая по существу обходит все передачи сигнала шаги перед стадией приток кальция ^20, что позволяет для идентификации пути мишени токсикантов как до, либо после кальциевой сигнализации ^20.

Дегрануляция могут быть измерены быстро и эффективно, контролируя высвобождение из β-гексозаминидазы в клеточном супернатанте, которая распространяется линейно из гранул вместе с гистамином ^6, но ягораздо проще обнаружить с помощью простой фермент-субстрат реакции и микропланшет-ридера для анализа флуоресцентного продукта. Этот планшет анализа, как указано в протоколе раздел основан на надежный метод, первоначально разработанный Naal соавт. ^1, который количественно расщепление флуорогенный субстрат 4-метилумбеллиферил-N-ацетил-β-D-глюкозаминид на β- гексозаминидазы. Мы модифицировали анализа для проверки воздействия наркотиков и токсикантов, с триклозан отраженных здесь. Этот метод надежно количественно дегрануляции, является недорогой альтернативой, например, проточной цитометрии методах выявления на основе ^21, и имеет потенциал, чтобы оказать себе приятно, чтобы высокопроизводительного скрининга из широкого спектра антиаллергенные препараты, а также иммунотоксические или аллергенных химикатов. Этот последний пункт особенно важен в свете в 2007 году Национальный научно-исследовательский совет доклад "испытания на токсичность в ^21-м веке: видение и Stratгии »( http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970 ), которая выступает за развитие высокой пропускной токсикологии испытания, которые используют культуру клеток сократить использование дорогостоящих традиционных лабораторных животных, таких как мыши. Дегрануляции протокол, разработанный Naal соавт. ¹ и модифицирована нами ^2, использует RBL-2H3 клеточная линия, которая является широко признанным модель гомологичных человеческих клеток слизистой оболочки мачты или базофилы ^3-5. (Методы культивирования RBL-2H3 клетки описаны в Hutchinson и соавт. ^22). Этот анализ, вероятно, может быть адаптирована к любой тип мачты прилагается клетки.

Триклозан (TCS) является широким спектром антимикробного, который был использован для более чем 30 лет в больницах, средства личной гигиены, товары народного потребления ^23,24. Механизм действия антимикробных характерные для TCS является ингибирование жирных кислот биосинтез, вероятно, путем ингибирования еноил-ацилбелком-носителем редуктазы ^25,26. Он находится во всем мире в широком диапазоне потребительских продуктов, таких как гель, лосьон для рук, зубную пасту, жидкость для полоскания рта, а в руке мыло в концентрации до 0,3% или 10 мМ ^24. Широкое применение TCS привело к обнаружению уровней у человека ^27-29 и в реках и ручьях ^30. Исследование, проведенное Allmyr соавт. Показали, что ²⁷ TCS и его метаболиты присутствуют как в плазме, и молоко от кормящих матерей. Важно отметить, что TCS легко впитывается в кожу, ^31-37. Queckenberg соавт. ³⁷ найдены ~ 10% поглощение ~ 70 мМ крем TCS в человеческую кожу в течение 12 ч, в результате чего в значительной концентрации в коже, где тучные клетки находятся.

TCS было показано в клинических условиях для управления человеческой аллергических заболеваний кожи ^7-11, но механизм, посредством которого TCS уменьшает аллергические заболевания кожи была неизвестна ^38. Использование флуоресцентных detaile анализа микропланшетD В этом видео, мы недавно показали, что TCS, при таких низких концентрациях, как 2 мкм, что значительно ослабляет мачту функции клеток и дегрануляцию, обеспечивая потенциальное объяснение этих клинических данных ^2. В дополнение к предоставлению объяснение этих клинических данных, наши данные в Палмер и др.. ² показывают, что TCS цели сигнальных молекул вниз по течению притока кальция. Из-за важности кальциевой сигнализации во многих иммунологических и других биологических процессов, TCS потенциально может оказать неблагоприятное воздействие на широкий спектр необходимых биологических процессов. В самом деле, Udoji соавт. Показали, что ³⁹ TCS подавляет человека природных клеток-киллеров литической активности, еще одной важной врожденной иммунной функции.

За свой ​​потенциал в качестве терапевтической помощи при аллергических заболеваний кожи (или, наоборот, как иммунотоксикантом), TCS также может быть эндокринные нарушающими ^40-49. Таким образом, четкой процедуры по подготовке этого химического вещества в растворе яы, представляющие интерес для токсикологов. Поскольку TCS представляет собой небольшую молекулу гидрофобные органические транспортные средства часто используются, чтобы сделать его более растворимы в воде. В большинстве исследований токсичности где TCS была протестирована, препарат участвует растворения в воде с помощью органического растворителя, такого как этанол, ацетон или масло ^2,50,51. Однако зачастую этих растворителей являются биологически активными сами, что усложняет интерпретацию химический анализ данных ^51. На самом деле, в соответствии с Rufli соавт. ⁵² и др. ^53, рекомендуется, чтобы тестируемые растворы для водных экспериментов токсичности готовятся с использованием физических методов над химическими методами, в связи с возможным химических растворителей для создания токсичности артефактов. Ранее нами было показано, что TCS растворенные в 0,24% этанол / вода (об / об) и обрабатывали ультразвуком в течение 30 мин гасит RBL дегрануляцию тучных клеток ^2. Этанол при более высоких концентрациях, чем 0,24%, как было показано ослабить мачта деградацией клеткиnulation ^{54,55-примеры} потенциально смешанного воздействия органических растворителей на исследования токсичности.

Это не только важно учитывать влияние растворителей на организм или клетки, используемые для исследования, но и важно для мониторинга влияния растворителя на химический тест сам. Например, скоро и соавт. ⁵¹ обнаружили, что растворение TCS в полиэтиленгликоле (обычно находится в зубные пасты и жидкости для полоскания рта) ослаблены антибактериальными и против зубного налета эффектов у здоровых женщин женщины в то время как растворение в маслах вызванный полной потере функции. Таким образом, способность различных растворителей модулировать токсических веществ и наркотиков, включая TCS, эффекты должны быть рассмотрены в тесте конструкции. Использование масла или вкусовые добавки могут мешать эффекты TCS в различных продуктах ^50,51.

В попытке устранить необходимость в использовании органических растворителей, мы улучшили наш способ растворения TCS ^2, устраняя использование органического зольвыразить. В настоящем Протоколе, мы растворяем TCS гранулы непосредственно в водный буферный раствор с выделением тепла (≤ 50 ° C), а затем проверить концентрацию этого запаса TCS УФ-и видимой области спектра. Эти усовершенствования возможно потому, TCS растворим в воде до 40 мкМ ( http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf ), и было показано, что устойчивость к разложению при нагревании до 50 ° C ( HTTP: / oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf ) ^56,57. У нас также есть дополнительное преимущество УФ-и видимой области спектра, а также TCS, как известно, сильно поглощают при 280 нм с ⁵⁸ коэффициент молярной экстинкции 4200 л / моль / см ^12.

Этот протокол обеспечивает простой, но эффективный способ растворить TCS гранул в буфер без помощи органического растворителя, в том числе низкой стоимости и быстрой проверкиконцентрации, и описывает мощную флуоресцентного исследования микропланшет для мониторинга химического воздействия на дегрануляцию тучных клеток.

Отметим, что все буфера рецептов включены в таблицу в конце текста протокола.

День 1:

1. Подготовка клетки

1. План из 96-луночных схема установки пластины, центрирование образцов на макете, чтобы избежать краевых эффектов. Выделить трех повторностей для каждой концентрации TCS испытания (± дегрануляции стимулятор антигена или ионофор), а также трех повторах с учетом спонтанного выхода (не дегрануляции стимулятор), максимальная высвобождения (0,2% Тритон Х-100 [TX] моющего средства лизис), а также скважин зарезервированы для фоновых проб (который не будет содержать клетки). Для каждой параллельной день эксперимента, выбрать новую рандомизированных расположение концентрации TCS образца.
2. Теплый RBL среды (Рецепт предоставлен в таблице) и трипсин в 37 ° С водяной бане.
3. Проверьте RBL клеток в Т-25 колбу (2-4 дней с момента Вашего последнего прохода и менее 3-4 месяцев, так как они оттаивают) для общих признаков хорошего исцелениего: Собственные рН судить по цветному средств массовой информации, и отсутствие облачности. Поместить колбу под световым микроскопом для подтверждения того, что колба не загрязнен и что клетки появляются здоровые, правильно сливающиеся, и по большей части прилагается. Обратите внимание, что клетки должны быть проверены на загрязнение микоплазмой примерно каждые шесть недель ^22.

Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение .

4. Возьмите колбу RBL клетки в стерильной культуре ткани (TC) капот. Клетки прикрепляются к ботТом из колбы. Рабочее под капотом ТС и с использованием стандартного метода стерильных, удалить носитель из колбы с стерильной пипетки; клетки остаются прикрепленными к нижней части колбы. Затем промыть колбу с 2 мл трипсина, то отбросить эту стирки.
5. Добавить именно 2 мл трипсина, чтобы покрыть дно колбы. Введен в 37 ° C инкубаторе в течение 5 мин, чтобы позволить клеткам отделяться от дна колбы.
6. Через 5 мин попала в стенке колбы с ладонью, чтобы ослабить клеток. Сразу же, добавить 18 мл RBL СМИ, чтобы промыть клетки с колбы и, чтобы утолить трипсина. Сразу принимают клетку-Медиа-трипсина смесь из колбы и переход к новой, стерильные 50 мл трубки (общий объем в эту трубку в настоящее время 20 мл).
7. После перемешивания осторожно, но тщательно удалить 50 мкл клеточной суспензии из этой трубки и передать 1,5 мл стерильную пробирку микроцентрифужных, который представляет собой образец для подсчета. Возьмем этого образца, а также 50 мл0; пробирку, содержащую клетки-Медиа-смесь трипсина из капота TC к настольным.
8. Вращайте 50 мл трубки в центрифуге (с соответствующим балансом) в течение 8 минут при 500 мкг; эта сила гранул клетки эффективно.
9. В ходе выделения времени, подсчитывают клетки в образце, которые были выделены перед формованием. Чтобы сделать это, сначала добавить 50 мкл трипанового синего красителя до 50 мкл клеток в 1,5 мл трубки и осторожно, но тщательно пипетку вверх и вниз 5x перемешать. Сразу же, перевести 10 мкл этой смеси к стеклу гематоцитометр, и считать клетки в сетке районе после инструкциями производителя. Граф по крайней мере, 100 клеток за разумные статистические результаты.
10. Вернуться в капюшоне TC, удалить супернатант из клеток, которые осаждали.
11. Закрывают клетка трубки, и вылить осадок на дне пробирки, чтобы ослабить клеток.
12. Добавить файлы мультимедиа в клетки обрабатывали трипсином для получения плотности 0,5 × 10 ⁶ клеток / мл, из расчета на количество клеток.
13. Хорошо перемешайте но осторожно, чтобы сохранить клетки приостановлено во время процедуры покрытия. Использование Pipetman, положить 100 мкл клеток / лунку в 96-луночный планшет (плоский, черный низ), после шаблона листа пластины. Случайно как клетки добавляли в лунки, чтобы избежать систематической ошибки, и смесь после каждого набора из трех скважин добавляется. Будьте уверены, чтобы не поставить клетки в лунки, предназначенного для фоновых проб.
14. После того как все клетки были переданы, поместите пластину крышки на пластине, и передают в инкубатор (37 ° C / 5% CO ₂₎ в течение ночи. Очистка после стандартной стерильной техники.

ДЕНЬ 2:

2. Подготовка триклозан

1. С помощью мерного цилиндра, измеряют 250 мл Tyrodes буфер (рецепт приведены в таблице) в 500 мл колбу Эрленмейера с надписью "TCS-буфера." Добавить мешалкой. Используйте посуду, мешалкой, термометром, предназначенных для использования с TCS только.
2. Также в это время, измерения 250Tyrodes мл в отдельный 500 мл коническую колбу, с надписью "контроль буфера." Использование изделия из стекла, мешалкой, термометром, которые создаются для ТКС. Добавить мешалкой.
3. Взвесить 0,0022 г гранул TCS и переход в «TCS-буфер" колбы (который содержит 250 мл буфера Tyrodes). Для того, чтобы эффективно передавать гранул коническую колбу, используйте 10 мл из измеренных Tyrodes 250 мл смыть весят лодке, убедившись, что все TCS был передан.
4. Место "TCS-буфер" колбу на электрической плитке комбинация / магнитная мешалка, и установить его для перемешивания при manageably высокой скорости. После хорошо перемешать, эта акция TCS будет номинально составлять 30 мкм (фактическая концентрация будет рассчитан после нагрева). (Все ли перемешивание в химическом вытяжном шкафу.)
   1. Также в это время, поместите "контроль буфера" колбы (не содержащие TCS) на вторую конфорку комбинация / магнитная мешалка, и установить его для перемешивания при аналогичной скорости.
5. Включите UV / VIS прогрева лампы лампы для последующего использования.
6. Нагрейте "TCS-буфера" решение до 50 ° С при постоянном перемешивании. Как только до температуры, времени в течение 90 мин. Во время 90 мин, продолжать следить 50 ° C температуре и соответствующей скорости перемешивания часто.
   1. Одновременно нагреть "буфер управления« раствором (который находится в 250 мл простого буфера Tyrodes) до 50 ° C при непрерывном перемешивании. По достижении 50 ° С, время в течение 90 мин, в течение которых температура (хранение при 50 ° C) и перемешивание и контролироваться.
7. В конце 90 мин, принимать как колб Эрленмейера с конфорками и трансфер в настольный.
8. С помощью функции сканирования на длине волны УФ / ВИД спектрофотометр, пустой машины на 1 мл с подогревом "буфер управления" решения перед сканированием 1 мл с подогревом "TCS-буфер" решение. Проверьте форму спектраD записи значение абсорбции при 280 нм. Для определения концентрации, использование Ламберта-Бера уравнение ₍₂₈₀ ε = ₂₈₀ ℓ в) использование ε ₂₈₀ из 4200 л / моль / см ¹² и ℓ 1 см.
9. После определения концентрации TCS, добавляют 0,249 г бычьего сывороточного альбумина (BSA) в оставшиеся 249 мл "TCS-буфер" раствор и хорошо перемешать.
   1. Одновременно добавляют 0,249 г BSA к оставшимся 249 мл "буфер управления" решения, и хорошо перемешать.

ДЕНЬ 2:

3. Антиген-стимулированных Дегрануляция анализа с использованием RBL-2H3 клетки

1. Перед тем как начать, проверьте рН все буферы используются, и обеспечить, чтобы они были четкими и не облачное: это включает Tyrodes буфера, буфер ацетата натрия и глицин карбонатного буфера (рецепты приведены в таблице).
2. Теплый RBL СМИ и трипсина в 37 ° С водяной бане.
3. Сделать БТ (1 мг / мл0; БСА в Tyrodes буфер): 0,05 г BSA + 50 мл Tyrodes буфера (X2). Введен в 37 ° С водяной бане.
4. Убедитесь, 0,2% Тритон Х-100: 3,136 мл BT + 64 мкл 10% Triton X-100 (конечная концентрация Тритона Х-100 0,2%). Хорошо перемешайте инверсии, но не вихрь. Введен в 37 ° С водяной бане.
5. Начать подготовку TCS и подогревом буфера Tyrodes (шаги "2", выше). Примечание: Не начинайте следующий шаг (IgE экспозиции), пока "TCS-буфер» и «буфер управления" решения достигать 50 ° C и перемешивали в течение первые 70 мин 90 мин тепла / время перемешивания.
6. Как только оба решения были перемешивают при 50 ° C в течение 70 мин, составляет 0,1 мкг / мл анти-DNP мыши IgE (Sigma) в средствах массовой информации RBL для образца скважин быть ориентированы (100 мкл / лунку). IgE акции не должны быть старше 30 дней при хранении при 4 ° С; записывать, как старые акции. Флик смешать, но не вихрь IgE.
7. Под капотом TC,добавить 0,6 мкл IgE акций (акции составляет 1 мг / мл) до 6 мл RBL СМИ в 50 мл трубки. В соответствии со вторым 50 мл пробирку, добавляют 6 мл простого RBL среды только (которая предназначена для несенсибилизированных образцов).
8. Дамп все носители из 96-луночный планшет (который был подготовлен в 1 день) в раковину, и довести пластины под капотом ТС.
9. Случайно добавить 100 мкл среды / IgE смеси скважин, которые должны стимулироваться (48 скважин общей сложности). Эта смесь не предназначена для "спонтанной", "Техас" и "фон" образцов.
10. Случайно добавить 100 мкл простой RBL СМИ только "TX", "спонтанные" и "фон" скважин.
11. Поместите пластину крышки на пластине, а затем переместите пластину в 5% CO _2/37 ° C инкубаторе в течение 1 часа.
12. Во время инкубации 1 ч, выполните шаги 3,13 - 3,24.
13. По крышке, готовить разведения антигена. Добавить 0,53 мкл 1,6 мг / мл со DNP-BSA + 850 мкл & #160; BT, чтобы получить антиген концентрации 1 мкг / мл. Vortex и инвертировать этот запас перемешать.
14. Как только "TCS-буфера" и "буфер управления" были нагреты и затем перемешивают в течение 90 мин при 50 ° С, продолжать с остальной частью подготовки к TCS протокол (переход к шагу 2.6 - 2.8.1). После BSA растворяется в обоих решений, продолжают ниже.
15. Начать подготовку экспозиции буфере, Ag ±, ± TCS. Во-первых, из 249 мл образца "TCS-буфер" раствор (который уже был нагревают и перемешивают в течение 90 мин), передачи 50 мл на новую 50 мл коническую трубку. Удалить 20 мкл этого 50 мл аликвоты и заменить его с 20 мкл 1 мкг / мл антигена подготовленные ранее для конечной концентрации антигена 0,0004 мкг / мл DNP-BSA. Vortex и инвертировать.
    1. Добавьте описание этого "Tube 1, высокое TCS / + Ag / + BT." Он используется для разведения и высокие концентрации воздействия TCS.
16. Из 249 мл образца "контроль буфера" решение, передавать от 50 мл до 50 мл новой трубки. Удалить 20 мкл этого нового 50-мл аликвоту и заменить с 20 мкл 1 мкг / мл антигена подготовленные ранее для конечной концентрации антигена 0,0004 мкг / мл DNP-BSA. Vortex и инвертировать.
    1. Добавьте описание этого "Tube 2, нет TCS / + Ag / + BT». Используется для разведения и TCS 0 мкМ концентрации TCS экспозиции.
17. Теперь возьмите 50 мл "TCS-буфера" решение и положить в другую 50 мл трубки. Удалить 20 мкл этого нового 50-мл аликвоту и заменить его с 20 мкл простой BT. Vortex и инвертировать. Нет антигена не добавляется.
    1. Добавьте описание этого "Tube 3, высокое TCS / Нет Ag / + BT." Это используется для фона.
18. Передача 50 мл "контроль буфера" решение еще 50-мл трубки. Возьмите 20 мкл из этого пе ж 50 мл аликвоты и заменить его с 20 мкл простой BT. Vortex и инвертировать. (Нет Ag не добавляется.)
    1. Добавьте описание этого "труба 4, нет TCS / Нет Ag / + BT." Это используется для фона и спонтанной образцов.

	BSA	TCS	Антиген
Труба 1		High []
Tube 2		NO
Труб 3	/ Files/ftp_upload/50671/check.jpg "ширина =" 15px "/>	High []	NO
Труба 4		NO	NO

19. Подсчитывают и записывают объемы разведений после определения концентрации "TCS-буфер" акции. Общий объем для каждого разведения концентрация должна быть 1 мл и должен быть подготовлен в стерильную пробирку микроцентрифужных. Используйте калиброванный P2 и P1000 Pipetman.

20. После 1-часовой инкубации IgE, возьмите пластинку из инкубатора и бросить все средства массовой информации в раковину. (Примечание: если испытание химических веществ, как известно, более токсичны, чем потребительский продукт TCS, опасных отходов может быть необходимым.)
21. Использование Combitip, случайно промыть клетки в 96-луночный планшет с BSA-Tyrodes буфера (200мкл / лунку). Выпуск промывочного буфера на сторонах скважины, а не непосредственно на прикрепленных клеток для того, чтобы не мешать прикрепленных клеток. Повторите этот процесс во второй раз.
22. Чтобы подготовить для применения процедуры, вихревые и инвертировать права разведения перед добавлением к пластине.
23. Начиная с верхней части пластины: Случайно добавить трижды по 200 мкл каждого из антигенов растворы (с правильной концентрации TCS) в соответствующие лунки. Продолжайте нижней части пластины. Добавить "контроль буфера" решение плюс Ag (от "Tube 2" выше) для всех "издевается" на тарелку.
24. Добавить 200 мкл соответствующего решения соответствующие лунки:
    1. Добавить 200 мкл 0,2% Тритон Х-100 в "TX" назначенных скважин.
    2. Затем добавьте 200 мкл труб от 3 до 3 скважины с надписью "Фон (BKGD)-Высокая TCS" на тарелку.
    3. Наконец, добавьте 200 мклиз труб от 4 до 6 скважин с надписью "Спонтанная".
25. Инкубировать в течение 1 часа в 37 ° C / 5% CO _2.
26. Во время инкубации 1 час: Получить два ведра льда (один для "старых" пластины в инкубатор и один для новой пластинкой). Оттепель 4-метилумбеллиферила-N-ацетил-бета-D-глюкозаминид (4-MU) при комнатной температуре в течение 40 мин, имея в фольгу, поскольку он чувствителен к свету.
    1. После 4-MU со размораживают, составляют 4-MU рабочего раствора: 150 мкл запас + 14,85 мл холодного буфера ацетат (рецепт приведен в таблице); вихревой и инвертировать. Хранить в 50 мл центрифужные пробирки, завернуты в фольгу, а на льду до использования.
    2. Использование Combitip, случайно добавить 100 мкл холодного 4-MU рабочий раствор в самом низу каждой лунке NEW Гренье черный 96-луночный планшет (на ведро со льдом, № 2). Начало первой путем добавления рабочего раствора случайно в верхней части пластины, случайно в нижней части пластины, случайно в Triton X-100 скважини, наконец, в случайном фоне скважин.
    3. Убирайся новую коробку P200 советы для следующего шага.
27. В конце 1-часовой инкубации, положить ячейки пластины из инкубатора на ведро льда № 1, супернатант пипетки вверх и вниз 4-5x (мягко, не вводим пузырей), собираются вокруг скважины для хорошего перемешивания, но не касаясь клетки при перемешивании . Систематически, вынуть 25 мкл образца из каждой лунки и поместить в новую тарелку с субстратом (одинаковый порядок образцы, как это первоначально планировалось выход). Внесите вверх и вниз, чтобы смешать образец полностью, когда в новой скважины, без введения пузырьков.
28. Выдержите в течение 30 мин при 37 ° C / 5% CO _2.
29. Через 30 мин инкубации случайно добавить 200 мкл холодного глицин-карбонатного буфера на лунку (с использованием Combitip), чтобы заполнить скважин глубиной до 325 мкл общего. (Сделать это дополнение к Тритон Х-100 выборок последнего, чтобы избежать Тритон Х-100 трансмиссионные). Проверьте пузыри, прежде чем чтение пластину (мешке с пипетки чистой P10TE Совет поп пузырьков).
30. Запустите пластину в флуоресценции планшет-ридер (перейдите в раздел 4).

ДЕНЬ 2:

4. Флуоресцентные прочтения планшетов инструкции и данные анализа

1. Откройте Gen5 программы и открытые разделе эксперимента.
2. Включите планшет-ридер и вставьте пластину (верхнем левом углу A1).
3. Протокол Процедура Читать, чтобы установить пользовательские чтениях. Не добавляйте ничего об образцах, копирует и т.д., с целью сбора данных флуоресценции сырья из каждой лунки.
4. Под "Read" выберите "флуоресценция", "Конечная точка", "Нормальная Скорость", "Gain 40", "Возбуждение 360/40", "Выбросы 460/40," Оптика Должность: 50%. Топ оптического смещения: 7 мм. Нет дрожания, без задержки, не кинетика, а без монитора, температура: от инкубатора.
5. Выберите плоский черный низ, 96-луночный планшет (Гренье 96-луночный, плоское дно).
6. Сделка с пластиной макета: Протокол пластины макета. Настройка образцы без указания повторы, разведения и т.д.
7. Плита читать.
8. Сохранить файл: Нажмите кнопку "Excel" кнопку, которая будет экспортировать данные в файл Excel. Делайте это в течение пластины макета и матрицы. Сохраните файл на компьютере и на диске USB.
9. В Excel, вычесть среднее значение фона из каждого образца, в том числе Тритон Х-100 скважин.
10. Рассчитать относительную дегрануляции% путем деления каждого значения (уже имея вычетом фона) на среднее Тритон Х-100 значение, а затем умножить на 100, чтобы сделать его в процентах.
11. Средний всех трех экземплярах и рассчитать стандартное отклонение. График данных в Excel в виде среднего значения ± стандартное отклонение. Для статистической проверки, переместите теперь Prism программного обеспечения GraphPad.

ДЕНЬ 2:

5. Вынужденное ионофором Дегрануляции анализа с использованием RBL-2H3 клетки

1. Следуйте протокол для «Подготовка клетки" (п. 1 день 1) и «Подготовка триклозан" (Раздел 2, 2-й день), как описано выше. Например пластины макета для стимуляции ионофором показан ниже.

Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение .

2. Перед тем как начать, проверьте рН все буфера используется, и убедиться, что они ясны, а не снег. Tyrodes, натрий-ацетатный буфер, глицин и карбонатного буфера (рецепты приведены в таблице).
3. Подготовьте 50 мл коническую трубку BT путем добавления 0,05 г BSA до 50 мл буфера тиродес и, встряхивая, чтобы хорошо перемешать. Выдержите в 37 ° С водяной бане.
4. Убедитесь, 0,2% Тритон Х-100 с 0,0032% ДМСО (конечная кальциевого ионофора транспортное средство концентрации) добавлением 96 мкл 10% Triton X-100 до 4,704 мл BT. Хорошо перемешать. Затем вынуть 0,155 мкл этого раствора и выбросить. Теперь добавьте еще в 0,155 мкл 100% ДМСО.
5. Подготовить 5 мМ (2,5 мг / мл) А23187 ионофором из порошка путем добавления 400 мкл свежей 100% ДМСО в ионофором встряхивания флакона и перемешать. После того как в растворе,трансфер в 1,5-мл коническую трубку, запись содержания и сегодняшняя дата и срок действия (3 месяца от подготовки при хранении при температуре от -20 ° C).
   1. Кроме того, при использовании замороженных акций сегодня оттепели на льду, и убедитесь, что 5 мМ А23187 ионофором хорошо перемешивается и ясно. Vortex, Флик, и инвертировать этот запас перед использованием. Запись даты подготовки и Лот № А23187 этого.
6. Как только "TCS-буфера" и "буфер управления» были нагревают и перемешивают в течение 90 мин, продолжают остальной части подготовки к TCS протокол (переход к шагу 2.6-2.8.1). После BSA является хорошо смешиваются в обоих решениях выполните оставшиеся шаги протокола.
7. Из 249 мл образца "TCS-буфера" решение, передавать от 50 мл до 50 мл новую коническую трубку. Удалите 1,8 мкл аликвоты 50 мл и добавляют 1,8 мкл 5 мМ со ионофором. Vortex 3x в течение 8 секунд и инвертировать 3x. Конечная концентрация ионофором 180 нм. Заметим, что эта концентрация 23187 будет варьироваться в зависимости от штока потенции, и ионофором А23187 доза-ответ, рекомендуется для определения концентрации 23187, которое вызывает дегрануляцию уровне примерно 20% максимальное высвобождение, которое было идентифицировано как noncytotoxic в RBL-2H3 клетками цитотоксичность (см. ^2).
   1. Добавьте описание этого "Tube 1, высокое TCS / ионофором + / + BT». Используется для разведения и высокие концентрации воздействия TCS.
8. Из 249 мл образца "контроль буфера" решение, передавать от 50 мл до 50 мл новую коническую трубку. Выньте 1,8 мкл 50 мл аликвоты и добавить обратно в 1,8 мкл 5 мМ ионофором складе. Vortex 3x в течение 8 секунд и инвертировать 3x. Конечная концентрация ионофором составляет 180 нМ.
   1. Этикетка не эта "труба 2, NO TCS / ионофором + / + BT." Это используется для разведения и 0 мкМ концентрации TCS.
9. Из 249 мл образца R 20; TCS-буфера "решение, передавать от 50 мл до 50 мл новую коническую трубку. Вынуть 1,8 мкл новой 50 мл аликвоты и добавляют 1,8 мкл 100% ДМСО. Vortex 3x в течение 8 секунд и инвертировать 3x; ионофором не добавляется.
   1. Добавьте описание этого "Tube 3, высокое TCS / Нет ионофором / + BT / + ДМСО", используется для фона.
10. Из 249 мл образца "контроль буфера" решение, передавать от 50 мл до 50 мл новую коническую трубку. Выньте 1,8 мкл из нового 50 мл аликвоты и добавить 1,8 мкл 100% ДМСО. Vortex 3x в течение 8 секунд и инвертировать 3x. Нет ионофором не добавляется.
    1. Этикетка эта "труба 4, нет TCS / Нет ионофором / + BT / + ДМСО", используется для спонтанного образцы релизе.

	BSA	TCS	Ионофором	Добавлено 100% ДМСО
Труба 1	"SRC =" / files/ftp_upload/50671/check.jpg "ширина =" 15px "/>	High []		NO
Tube 2		NO		NO
Труб 3		High []	NO
Труба 4		NO	NO	Эк марки "FO: Content-ширина =" 0,1 В "SRC =" / files/ftp_upload/50671/check.jpg "ширина =" 15px "/>

11. Подсчитывают и записывают объемы разведений после определения концентрации "TCS-буфер" акции. Используйте калиброванный P2 и P1000 Pipetman. Общий объем для каждого разведения концентрация должна быть 1 мл, и должен быть подготовлен в стерильную пробирку микроцентрифужных:

12. Возьмите эти клетки высевали вчера из инкубатора, и пустой носитель в раковину. Использование Combitip, случайно промыть клетки в 96-луночный планшет с БТ (200 мкл / лунку). Повторите мыть второй раз.
13. Чтобы подготовить для применения процедуры, вихревые и инвертировать права разведения перед добавлением к пластине. Начиная с верхней части пластины: Случайно добавить трижды по 200 мкл каждого из правильной концентрации ТКС в correspoнахождении хорошо. Продолжайте нижней части пластины. Добавить "контроль буфера" решение плюс А23187 (от "Tube 2" выше) для всех "издевается" на тарелку.
14. Добавить 200 мкл соответствующего решения соответствующие лунки:
    1. Добавить 200 мкл 0,2% Тритон Х-100 в "TX" назначенных скважин.
    2. Затем добавьте 200 мкл труб от 3 до 3 скважины с надписью "Фон (BKGD)-Высокая TCS" на тарелку.
    3. Наконец, добавьте 200 мкл труб от 4 до шести скважин с надписью "Спонтанная".
15. Инкубировать в течение 1 часа в 37 ° C / 5% CO _2.
16. Во время 1 час инкубации: Получить два ведра льда (один для "старых" пластины в инкубатор и один для новой пластинкой). Оттепель 4-метилумбеллиферила-N-ацетил-бета-D-глюкозаминид (4-MU) при комнатной температуре в течение 40 мин, имея в фольгу, поскольку он чувствителен к свету.
    1. После 4-MU со размораживают, составляют 4-MU рабочая решенина 150 мкл запас + 14,85 мл холодного буфера ацетат (рецепт приведен в таблице); вихревой и инвертировать. Хранить в 50 мл центрифужные пробирки, завернуты в фольгу, а на льду до использования.
    2. Использование Combitip, случайно добавляют 100 мкл холодного 4-MU рабочего раствора в самой нижней части каждой лунке NEW Гренье черный 96-луночный планшет (на ведро льда # 2): запуск первого добавлением рабочий раствор случайно в верхней части пластиной, случайно в нижней части пластины, случайно в Triton X-100 скважин, и, наконец случайно в фоне скважин.
    3. Убирайся новую коробку P200 советы для следующего шага.
17. В конце 1-часовой инкубации, положить ячейки пластины из инкубатора на ведро льда № 1, супернатант пипетки вверх и вниз 4-5x (мягко, не вводим пузырей), собираются вокруг скважины для хорошего перемешивания, но не касаясь клетки при перемешивании . Систематически, вынуть 25 мкл образца из каждой лунки и поместить в новую тарелку с субстратом (одинаковый порядок SAmples, как планировалось первоначально выход). Внесите вверх и вниз, чтобы смешать образец полностью, когда в новой скважины, без введения пузырьков.
18. Выдержите в течение 30 мин при 37 ° C / 5% CO _2.
19. Через 30 мин инкубации случайно 200 мкл холодного глицин-карбонатного буфера на лунку (с использованием Combitip) для заполнения скважины до 325 мкл общего объема (делать это дополнение к Тритон Х-100 выборок последнего, чтобы избежать Тритон Х-100 трансмиссионные). Проверьте пузыри, прежде чем чтение пластину (мешок с чистой P10 пипетки поп пузырьков).
20. Запустите пластину в флуоресценции планшет-ридер (Выполните все этапы, в разделе 4).

При нагревании до 50 ° С в течение 90 мин, УФ-и видимой области спектра поглощения для TCS дает сильный, гладкую кривую между ~ 260 и 300 нм, с пиком при 280 нм, как показано на рисунке 1. УФ-и видимой области спектра, таким образом, важным инструментом, который может быть использован для вычисления концентрации, так как опубликовано молярный коэффициент поглощения при 280 нм составляет 4200 л / моль / см ^12. Мы обнаружили, что TCS не выпадать из раствора в течение времени кадра всего эксперимента дегрануляции после 50 ° С нагрева (данные не показаны).

После использования этого способа нагрева распустить TCS непосредственно в водном буфере, мы исследовали влияние ТЭС на дегрануляцию тучных клеток с помощью флуоресцентного анализа на основе, которая была оптимизирована с Naal соавт. ¹ Этот тест фиксирует уровень β-гексозаминидазы освобожден от мачты Клетки после одночасовой инкубации путем обнаружения флюорогенные продукта субстрата. Будь стимулируется дегранулируют по DNP-BSАнтигена (рис. 2) или кальция ионофором А23187 (рис. 3), можно ясно видеть, что TCS вызывает значительное от дозы ингибирование высвобождения из β-гексозаминидазы (т.е. дегрануляции).

На фиг.2 представитель результаты, полученные для IgE-сенсибилизированных RBL-клетки, которые инкубировали в течение 1 ч в "TCS-буфер" или "буфер управления", и подвергается DNP-BSA антиген доза 0,0004 мкг / мл. Эта концентрация DNP-BSA вызвало средняя абсолютная реакция дегрануляции 22,5% ± 0,1 (среднее значение ± стандартное отклонение) в отсутствие TCS. Статистически значимые ингибирования дегрануляции началась в 5 мкм, где дегрануляции уровни 0,79 раза ± 0,05 (среднее значение ± стандартное отклонение) 0 мкМ TCS уровнях управления. При увеличении концентрации TCS, существует большая увлажняющего эффекта TCS, показывая сильную связь доза-ответ. TCS, при 20 мкм, почT полностью отменяет дегрануляции ответа, до уровня примерно равной спонтанной дегрануляции (где не антиген присутствует). В целом, эта цифра показывает сильное ингибирование поливалентный стимулированных антигеном дегрануляцию тучных клеток из-за концентрации проверено TCS, без применения органических растворителей.

На рисунке 3, кальция А23187 ионофором был использован как способ исследовать механизм TCS-индуцированной дегрануляции демпфирования в RBL тучных клеток. 23187 используется в качестве альтернативы стимулятор, поскольку он обходит FcεRI сшивания и других сигнальных событий вверх по течению притока кальция, но все же вызывает дегрануляции. RBL тучные клетки инкубировали в течение 1 ч в "TCS-буфер" или "буфер управления", содержащие дозу кальциевого ионофора 180 нМ. При отсутствии TCS, такой концентрации 23187 вызвал среднее абсолютное ответ дегрануляции 25,1% ± 4,7 (среднее значение ± стандартное отклонение). Ингибирования дегрануляции былонашли с всего лишь 1 мкМ TCS (0,63 ± 0,11 [среднее ± стандартное отклонение]). При увеличении концентрации TCS, так что делает тяжести торможение: при 5 мкМ, 0,21 раза ± 0,04 от 0 мкМ уровней TCS контроля; в концентрации 10 мкМ, 0,09 ± 0,05, при 15 мкМ, 0,077 ± 0,006, а при 20 мкМ , 0,09 ± 0,02 (среднее значение ± SD). В самом деле, от 5 мкм и более высокие концентрации TCS, уровни A23187-индуцированной дегрануляции Было обнаружено, что вблизи уровня спонтанного управления (где нет 23187 не присутствует вообще). В целом, рисунке 3, в сочетании с фиг.2, показывают, что молекулярные мишени TCS, вероятно, ниже по потоку от притока кальция.

Рисунок 1:. Представитель TCS видимой и ультрафиолетовой областях спектра поглощения TCS имеет надежную горохак. при 280 нм, что позволяет легко определить _280, а также предоставление возможности использовать коэффициент молярной экстинкции 4200 л / моль / см ^12, чтобы определить фактическую концентрацию TCS растворенного в буфере тиродес. Желтый линия показывает пик при 280 нм. В этом примере значение оптической плотности при 280 нм составляет 0,11876, что указывает на концентрацию ТКС 28,28 мкм. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение .

Рисунок 2:. Представитель ответ IgE дегрануляции сенсибилизированных тучных клеток RBL подвергается 0,0004 мкг / мл BSA DNP-антиген и TCS (0-20 мкм) спонтанное значение выпуска (без антигена) изображена для справки. Значения представляют среднее7; стандартное отклонение трех образцов. Как показано, данные были нормированы на управление (0 мкМ ТКС) и значительные различия были определены в программное обеспечение Prism с односторонний ANOVA последующей пост Тьюки специальных тестов (сравнений до 0,001 мкМ ответ TCS среднем). Значение представлено *** р <0,001. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение .

Рисунок 3. Представитель ответ дегрануляцию тучных клеток RBL-стимулированными 180 нМ ионофором А23187 кальция в присутствии TCS (0-20 мкМ) спонтанное высвобождение образец (не ионофора присутствует) изображен в качестве примера. Величины представляют среднее ± стандартное отклонение трех образцов. Как Presenteд, данные нормализованы к контролю (0 мкМ ТКС) и значительные различия были определены в программное обеспечение Prism с односторонний ANOVA последующей пост Тьюки специальных тестов (сравнений до 0,001 мкМ ответ TCS среднем). Значение представлено *** р <0,001; ** р <0,01. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение .

В 2004 году Naal соавт. ¹ разработали мачты биосенсоров ячейки для высокой пропускной тестирование дегрануляции. Это надежный анализ, который мы адаптировали для нашего исследования TCS и подробно описанная в этом видео. До Naal соавт. ¹ анализе дегрануляцию тучных клеток были обычно оценивается с помощью β-гексозаминидаза ^59-61, но эти ранние способы, используемые флуорометры, в котором один образец был прочитан за раз. Важно отметить, что Naal соавт. установил прямые соответствия между их более высокой пропускной метод с использованием планшетного и ранее способом, в котором образцы прочитать одну-на-раз в флуорометре. В целом, Naal соавт. ¹ значительно улучшили скорость, мощность, простота и надежность анализа, адаптировав ее к высокой пропускной микропланшет платформы, а также путем включения несколько изменений в рабочий процесс. Здесь мы дополнительно приспособлен этого анализа для исследования различных химических тестов, в частности, здесь, Вездесущие наркотиков TCS. На видео подробно этапы этого анализа очень полезно. Кроме того, мы также разработали органических растворителей способ применения ККТ в водном буфере, и мы покажем простой, недорогой процедуры проверки TCS концентрации. Эти методы должны быть полезными для как бы растущий области токсикологии триклозана. В этой дискуссии, мы подробно несколько соображений, для использования этого теста дегрануляции для проверки других химических веществ, а также.

ТКС был получен непосредственно в водном буфере без помощи органических растворителей, концентрация была подтверждена с помощью УФ-и видимой области спектра (рис. 1), а затем эффект TCS (<30 мкМ) была рассмотрена дегрануляцию тучных клеток (фиг. 2 и 3) с использованием флуоресцентного анализа микропланшет обнаружить присутствие β-гексозаминидазы, суррогатного маркера дегрануляции. Мы обнаружили, что TCS способен значительно ослабить освобождение β-hexosaminidase из тучных клеток RBL при растворении в низкой концентрации этанола (0,24% об / об) ² или, как показано здесь, непосредственно в водном буфере. По вышеизложенного органическом растворителе, мы фактически видим более выраженным демпфирование в антиген-индуцированной дегрануляции по сравнению наших исследований, в которых TCS растворяли в 0,24%-ном этаноле (об / об). Например, здесь мы продемонстрировали> 50% снижение антиген-индуцированной дегрануляции (0,46 раза ± 0,07), который является намного больше, чем ~ 25% снижение мы сообщали в течение 10 мкМ TCS растворенного в 0,24%-ном этаноле (0,76 раза ± 0,02) ^2. В том же ключе, мы определили для А23187-стимулированных клеток, что, 5 мкм, TCS ингибирует дегрануляцию к спонтанным уровнем выпуска, причем этот эффект не была продемонстрирована до 10 мкМ TCS в наших предыдущих, этанол-использования, кабинет ^2. Есть две возможные причины такого расхождения: либо 0,24% этанола автомобиля ² ослабляет способность к TCS активна блокировка чел мачтыL дегрануляции или TCS мы использовали был менее концентрирован, чем ожидалось (с концентрацией не были проверены с помощью УФ-и видимой области спектра в предыдущем исследовании ^2). Что касается молекулярной мишени для ингибирования TCS о дегрануляцию тучных клеток, вполне вероятно, происходят где-то в каскаде сигнальной трансдукции вниз по течению притока кальция ^2. Мы использовали кальций ионофором А23187 как дегрануляции стимулятор обойти ранних сигнальных событий, а также ингибирующий эффект TCS сохранялось, что указывает на мишень для TCS торможения в дегрануляции путь не вероятно, расположенный выше по потоку от притока кальция. Ранее нами было показано, что мембрана ероша этих клеток также подавляется благодаря обработке TCS, что указывает на возможность общего целевой путь ^2.

Предыдущие исследования показали, спектр поглощения ТКС с максимальным пиком при 280 нм и молярного коэффициента поглощения оценивалась как 4200 л / моль / см при этом wavelenGTH (при значениях рН ниже рК) ^12. Было показано, что нагревание TCS не приводит к термическому разложению ^57, а другое исследование показало, успех в TCS растворение в воде при нагревании до 50 ° С без помощи органического растворителя ^56. Когда любой новый химический тест используют, его растворимость в водном буфере, конечно, должны быть тщательно рассмотрены. Мы также обнаружили, что при нагревании TCS, форма спектральной считывания не влияет ли нагревают в течение 40-90 мин (данные не приведены): это предполагает отсутствие деградации TCS при нагревании в течение более длительного периода времени. Однако следует отметить, что роспуска TCS больше на 90 мин 40 мин. Мы также подтвердили, что TCS не выпадать из раствора в течение всего срока дегрануляции эксперимент (данные не показаны).

DNP-BSA антигена и концентрации кальция ионофором используемые в данном исследовании были выбраны на основе антигена и ионофором доза анализов ответг были выбраны, чтобы вызвать умеренные уровни дегрануляции для представителя на фиг.2 и 3. Пример ответа анализа доза антигена можно видеть на фиг.1А наших предыдущих ² работы. При определении антигена или ионофором концентрации, которые будут использоваться в эксперименте, важно знать, что стимуляторы экспериментов доза-эффект нужно делать периодически, обычно по меньшей мере раз в два месяца, так как RBL-2H3 клетки иногда переменно функционировать. Концентрация, которая дает требуемый дегрануляции процент может варьироваться в зависимости от возраста клеток и на антиген / ионофором подготовки. Кроме того, как мы видели с неорганическими арсенита ^22, абсолютные проценты дегрануляции (уровни антигена, используемого) может повлиять уровней токсикантов воздействие на RBL дегрануляции, поэтому токсикантов доза-реакция должна быть сделана в несколько различных антиген / ионофором концентрациях. Важно также рассмотреть окончательный Concentration транспортного средства ДМСО при стимуляции дегрануляции с ионофором, так дегрануляции зависит от ДМСО ^62. Мы обнаружили, что концентрация ДМСО используемые в настоящем протоколе не влияют дегрануляции, фон показания, или на 0,2% Тритон Х-100 значений ^2.

В дополнение к поливалентный антиген DNP-BSA и кальциевый ионофор А23187, существует несколько других способов RBL-2H3 стимуляции. Одним из таких методов является стимулирование с помощью воздействия к соединению 48/80 вместе с кверцетин ^63. Другой способ сшивания IgE рецепторов, связанных с анти-IgE, IgG, как ранее испытанных вместе с TCS воздействия ^2. Многие другие методы стимуляции существуют, и каждый из этих методов указаны различные механистической аспект дегрануляцию тучных клеток. Этот планшет для анализа читатель может быть адаптирован для использования со многими из этих альтернативных стимуляторов, дальнейшее расширение его полезность.

Этот протокол дегрануляции имеет потенциал, чтобы быть использованы с широким разнообразием чеmicals. В изучении любого химического теста с помощью этого анализа, контроли должны использоваться для следующих целей: (1) эффект исследуемого вещества на фоне (без клетки) чтениях, (2) влияния химического на спонтанную дегрануляцию (элементы без IgE , отсутствие антигена, не ионофора), (3) эффект химической на Triton-X-100 значений лизированных клеток (без антигена, не ионофора). Эти тесты могут быть легко работал в пластину макета. Ранее мы обнаружили, что TCS не влияет ни один из этих трех параметров ^2. Кроме того, тесты должны быть запущены, чтобы определить, что химический анализ не мешает β-гексозаминидазы фермент / субстрат самой реакции в клетке без подготовки, как показано на рис S1 в Приложении разделе дополнительных данных Палмер и др. ^2. Мы обнаружили, что TCS не мешает способности β-гексозаминидаза расщеплять флуорогенный субстрат 4-MU ^2. Воздействие любых растворителей, используемых также должны быть рассмотреныво всех этих экспериментах управления. Например, подтверждено, что ДМСО, растворитель для ионофора, не оказывает никакого влияния на Triton-X-100 в образце уровни флуоресценции (данные не показаны). Отметим также, что мы выбрали все пластмассы, используемые в этом исследовании для не содержащих подрывающих эндокринную систему бисфенол А, к сожалению, хотя, всех видов пластмасс в настоящее время на рынке, вероятно, действительно содержат некоторые эндокринные нарушения деятельности, которые потенциально могли бы посрамить данных ^64.

В случае, если неполадки не требуется, несколько потенциальных аспектов этого протокола должна быть пересмотрена. Например, может оказаться, что (1) спонтанное высвобождение уровни слишком высоким (более ~ 7% лизиса значений), (2) доза-ответ либо стимулятор и / или химического теста не наблюдается, или (3) концентрация TCS в растворе слишком низка (менее 20 мкМ). В первом случае, высокий уровень спонтанной может быть признаком клеток в культуре быть слишком длинным или наличие контаминации микоплазмами, поэтому, Попробуйте эти эксперименты с RBL-2H3 клетки, которые были в культуре между 2-20 недель, и регулярно проверок на микоплазму. Если ответ дозу стимулятора не наблюдается, растворенным стимулятор концентрации может быть слишком низкой, а запасы должны быть переделаны. Так, например, кальциевый ионофор обычно выполнен в виде тонкой пленки, который должен быть восстановлен с ДМСО, требующих особого внимания и гораздо вортексе. Кроме того, новые акции ионофором с другим номером партии могут быть разные потенции просто из-за партии к партии изменения, поэтому реакция дегрануляции дозы рекомендуется с каждым вновь приобретенных ионофором наличии. Стоит также отметить, что очевидное отсутствие эффекта с данным химического теста может быть признаком того, что это химическое вещество может потребоваться больше инкубационный период для того, чтобы вызвать эффект. Если вы не достижение высокой доходности TCS в растворе, убедитесь, что температура остается постоянной (50 ° С ± 5) в то время как гранулы растворяются в буфер. TОн термометра никогда не должны касаться дна колбы, положение, которое привело бы к завышению температуры раствора. Кроме того, убедитесь, что есть постоянное интенсивном перемешивании и что 90 минут обратный отсчет не начнется, пока температура не впервые достиг 50 ° С.

Таблица устранения неполадок.

Как и в любом токсикологии / фармакологии эксперимента, химический анализ не должно быть открыто токсичными при тестируемой концентрации. Рекомендуется использовать методы, которые теста для апоптоза и некроза либо индивидуально, либо комбинированным (например, с клоногенных анализов), а также тесты на общее повреждение плазматической мембраны (например, лактат дегидрогеназа утечки). TCS, в концентрациях, показанных в этом исследовании, не цитотоксическое действие на RBL-2H3 клетки ^2. Особое внимание на обеспокоенность в связи с ионофором исследования является то, что ионофором плюс ионофором автомобиля(Вероятно ДМСО), а также химический анализ, а также любые органические растворители, могут быть потенциально цитотоксических варят, который необходимо тщательно контролировать, как это сделано в Palmer и др. ^2.

Наши методике получения TCS решения без использования органического растворителя будут полезны для дальнейшей токсикологических исследований этого вездесущий химической, без вмешательства растворитель артефактов, особенно важным фактором в водной токсикологии. Эти методы также возможность проверки концентрации TCS в растворе и количественной оценки эффектов, что химические вещества, такие как TCS, иметь на дегрануляцию тучных клеток. Этот протокол может быть использован для оценки воздействия широкого спектра химических веществ на дегрануляцию тучных клеток, таких, как вызывать эндокринные нарушения химических веществ ^55, и потенциально может быть расширен для высокопроизводительного скрининга. Кроме того, другие типы тучных клеток могут быть использованы в данном анализе в дальнейшей работе.

Нам нечего раскрывать.

НМ и RHK поддерживаются Высшая школа UMaine в биомедицинской науки и техники (GSBSE); RHK была также поддержана Мэн Сельскохозяйственная и лесная опытная станция. Дополнительное финансирование было предоставлено Национальным Институтом Общих Медицинских Наук (NIH P20-GM103423), Мэн Сельскохозяйственная и лесная опытная станция (номер гранта ME08004-10, ОКГ), Университет штата Мэн ADVANCE Rising Tide центр (NSF грант № 1008498) и исследовательский грант стартер в фармакологии / токсикологии от PhRMA Foundation (ОКГ). Мы благодарим д-ра. Дэвид и Барбара Holowka Baird к антигену и клеток. Мы благодарны Хина Хашми, Алехандро Велес, и Андрей Абовяна за помощь в оборудовании и заказах. Это Мэн Сельскохозяйственная и лесная опытная станция номер публикации 3311.