Assay Microplate כדי להעריך את ההשפעות כימיות על degranulation תא התורן RBL-2H3: השפעות של Triclosan ללא שימוש בממס אורגני

degranulation תא פיטום, השחרור של מתווכים אלרגיים, הוא חשוב באלרגיה, אסתמה, והגנה טפילה. כאן אנו מדגימים טכניקות ¹ להערכת השפעות של תרופות וtoxicants על degranulation, מתודולוגיה מנוצל לאחרונה להפגין השפעה המעכבת החזקה של סוכן אנטיבקטריאלי triclosan ^2.

תאי פיטום ממלאים תפקידים חשובים במחל אלרגיות והגנה חיסונית נגד טפילים. לאחר הפעלה (למשל, על ידי אלרגן), הם degranulate, תהליך שתוצאת exocytosis של מתווכים אלרגיים. אפנון של degranulation תא תורן על ידי תרופות וtoxicants עשוי להיות השפעה חיובית או שלילית על בריאות אדם. תפקוד תא תורן כבר גזור בפירוט עם השימוש בתאי פיטום לוקמיה basophilic עכברוש (RBL-2H3), מודל מקובל של תא פיטום אדם רירי ^3-5. מרכיב תורן תא גרגר והמתווך אלרגי β-hexosaminidase, אשר שוחרר לינארית בד בבד עם היסטמין מתאי פיטום ^6, ניתן למדוד בקלות ובאופן אמין באמצעות תגובה עם מצע fluorogenic, מניב למדידה עוצמת הקרינה בassay microplate שניתן ל מחקרי תפוקה גבוהה ^1. פורסם במקור על ידי Naal et al. ^1, יש לנו להתאים assay degranulation זה להקרנה Oתרופות F ו toxicants ומדגים את השימוש בו כאן.

Triclosan הוא סוכן ספקטרום רחב נגד חיידקים שנמצא במוצרים צריכה רבים וכבר מצא להיות סיוע טיפולי במחלת עור אלרגית אנושית ^7-11, למרות שהמנגנון להשפעה זו אינה ידוע. כאן אנו מדגימים assay להשפעת על triclosan degranulation תא תורן. לאחרונה הראו כי triclosan מאוד משפיע על תפקוד תא תורן ^2. במאמץ להימנע משימוש בממס אורגני, triclosan מתמוסס ישירות לתוך המאגר מימית עם חום וערבוב, וריכוז כתוצאה הוא אישר שימוש בספקטרופוטומטריה UV-Vis (באמצעות ε ₂₈₀ = 4200 L / M / ס"מ) ^12. פרוטוקול זה יש פוטנציאל לשמש במגוון רחב של חומרים כימיים כדי לקבוע את ההשפעות שלהם על degranulation תא תורן, ובאופן רחב יותר, פוטנציאל אלרגי שלהם.

תאי פיטום הם מאוד מגורענים מפעיל תאים חיסוניים המשמשים כמתווכים עיקריים באסטמה, אלרגיות, טפילים והגנת ^13-16 היווצרות הסרטן. הם מתגוררים כמעט בכל רקמת vascularized ^15, שבו הם בבטחה לאחסן מתווכים אלרגיים ודלקתיים בגרגרי cytoplasmic עד הופעלו לdegranulate. Degranulation הוא exocytosis של גרגרי קרום נכנסים, מה שגורם לשחרור של מתווכים פעילים פרמקולוגית כגון היסטמין, tryptase, ולאוקוטריאנים ^15. תוצאות תהליך זה בתחילתו של הסוג אני תגובות רגישות יתר שהם קריטיים בהגנה מפני טפילי הרכבה, כמו גם ייזום תגובות אלרגיות, אסתמה, ומסרטנות ^15.

תאי מאסט ובזופילים לבטא קולטנים FcεRI, הקולטנים גבוהה הזיקה לאימונוגלובולין E (IgE) ^17. חשיפה לאלרגן או אנטיגן גורמת לצבירה של קולטנים FcεRI IgE בכריכות מרובים ^17, וזה של זהO-נקרא "crosslinking" של קולטני Fc IgE בכריכות שיוזמת את תהליך degranulation: מפל של אירועי טירוזין זרחון, ההפעלה של פוספוליפאז C, זרימת הסידן מהחנויות פנימיות, וזרם של סידן לתוך התא ^18. זרימת סידן זה היא הכרחי עבור degranulation, ועוד יותר, מאותתת היתוך גרגיר עם הקרום לפני גרימת exocytosis גרגר ^15. בניסוי, ionophore סידן יכול לשמש לסיד מעבורת ישירות על פני קרום תא ^19, שלמעשה עוקף את כל התמרה אות שלבים לפני שלב זרימת סידן ^20, המאפשר את זיהוי של יעד על ידי מסלול toxicant כמו להיות במעלה הזרם או במורד הזרם של סידן איתות ^20.

Degranulation ניתן למדוד במהירות וביעילות על ידי ניטור שחרורו של β-hexosaminidase לsupernatant התא, אשר שוחרר לינארית מהגרגרים לצד היסטמין ^6, אבל אניזה הרבה יותר קל לזהות באמצעות תגובת אנזים-מצע וקורא microplate פשוט assay מוצר הניאון. assay microplate זה, כמפורט בסעיף הפרוטוקול, מבוסס על שיטה שפותחה במקור על ידי חזקה Naal et al. ^1, אשר מכמתת את המחשוף של מצע fluorogenic 4-methylumbelliferyl-N-אצטיל-β-D-β-glucosaminide ידי hexosaminidase. יש לנו שונה assay להשפעות של תרופות ובדיקת toxicants, עם triclosan מודגש כאן. שיטה זו אמינה מכמתת degranulation, הוא אלטרנטיבה זולה, למשל, שיטות זיהוי ²¹ המבוססים על תזרים cytometric, ויש לו הפוטנציאל להשאיל את עצמה יפה להקרנת תפוקה גבוהה של מגוון רחב של תרופות לטיפול באלרגיה, כמו גם immunotoxic או כימיקלים אלרגניים. הנקודה אחרונה זו חשובה במיוחד לאור בדיקת רעילות "2007 דו"ח המועצה הלאומי למחקר במאה ה ^-21: חזון וstrategy "(http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970), הפועל למען הפיתוח של בדיקות רעלים תפוקה גבוהה המנצלות תרבית תאים כדי להקטין את השימוש יקר של חיות מעבדה מסורתיות כגון עכברים. פרוטוקול degranulation שפותח על ידי Naal et al. ¹ והותאם על ידינו ^2, מנצל את שורת תאי RBL-2H3, שהוא מודל מקובל היטב הומולוגית לתאי פיטום ריריים אדם או בזופילים ^3-5. (שיטות לתאי RBL-2H3 culturing מפורטות באצ'ינסון ואח'. ^22). assay זה סביר יכול להיות מותאם לכל סוג תא תורן מצורף.

Triclosan (TCS) הוא מיקרוביאלית ספקטרום הרחב שהיה בשימוש כבר יותר מ -30 שנים בבתי חולים, מוצרי טיפוח, ומוצרים צריכה ^23,24. אופן פעולה אופייני למיקרוביאלית של TCS הוא העיכוב של סינתזת חומצות שומן, ככל הנראה על ידי עיכוב enoyl-acylרדוקטאז מנשא חלבון ^25,26. הוא נמצא בעולם במגוון רחב של מוצרים צריכה, כגון ג'ל רחצה, קרם ידי, משחת שיניים, מי פה, וסבונים ביד בריכוזים של עד 0.3% או 10 מ"מ ^24. שימוש נרחב של TCS הביא רמות לגילוי בבני אדם ^וב27-29 נהרות ונחלים ^30. מחקר שנעשה על ידי Allmyr et al. הוכיח כי ²⁷ TCS ומטבוליטים שלה נמצאים גם הפלזמה וחלב מאמהות מיניקות. חשוב לציין, TCS נספג בקלות אל תוך העור ^31-37. Queckenberg et al. ~ ³⁷ מצאו קליטת 10% מ~ 70 מ"מ TCS קרם לעור אנושי בתוך 12 שעות, וכתוצאה מכך הריכוז משמעותי בעור, שבו תאי פיטום מתגוררים.

TCS הוכח קליני כדי לנהל את מחלת עור אלרגית אנושית ^7-11, אבל המנגנון שבאמצעותו TCS מקל על מחלות עור אלרגיות כבר ידוע ^38. שימוש detaile assay microplate הניאוןד בסרטון הזה, אנחנו לאחרונה הוכיחו כי TCS, בריכוזים נמוכים כמו 2 מיקרומטר, פוגם באופן משמעותי את תפקוד תא תורן וdegranulation, מתן הסבר פוטנציאל לנתונים קליניים אלה ^2. בנוסף למתן הסבר לנתונים קליניים אלה, הממצאים שלנו בפאלמר et al. ² מציעים לי TCS מטרות מולקולות איתות במורד הזרם של זרימת סידן. , TCS עלול להיות בשל חשיבותו של הסידן באיתות חיסונית רבים ותהליכים ביולוגיים אחרים השפעות שליליות על מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים הדרושים. למעשה, Udoji et al. הראו כי ³⁹ TCS מדכא פעילות תאי רוצח טבעית אנושית ממס, תפקוד מערכת החיסון מולדים חשוב נוסף.

מעבר לפוטנציאל שלה ככלי עזר טיפולי במחלת עור אלרגית (או, לחלופין, כimmunotoxicant), TCS יכול להיות גם האנדוקרינית משבש ^40-49. לפיכך, נוהל ברור על איך להכין כימיקל זה בפתרון אנישל עניין לtoxicologists. בגלל TCS הוא מולקולה הידרופובי קטנה, כלי רכב אורגניים משמשים לעתים קרובות כדי להפוך אותו ליותר מסיס במים. ברוב המחקרים רעילות שבו TCS כבר נבדקו, הכנה כרוכה בפירוק במים בעזרת ממס אורגני כגון אתנול, אצטון, או שמן ^2,50,51. עם זאת, לעתים קרובות פעמים ממסים אלה הן פעילים מבחינה ביולוגית את עצמם, ובכך סבכו את הפרשנות של הבדיקה כימי נתונים ^51. למעשה, על פי Rufli et al. ⁵² ואחרים ^53, מומלץ שפתרונות בדיקה לניסויים רעילות מים מוכנים באמצעות שיטות פיסיות על פני שיטות כימיות, בשל הפוטנציאל של ממסים כימיים כדי ליצור חפצים רעילות. יש לנו הראינו בעבר כי TCS מומס באתנול / מים (כרך / כרך) 0.24% וsonicated למשך 30 דקות dampens degranulation תא תורן RBL ^2. אתנול בריכוזים גבוהים יותר מאשר 0.24% הוכח לצנן degra תא תורןnulation ^{54,55-דוגמאות} להשפעות שעלולים להיות המבלבלות של ממסים אורגניים על מחקרים רעילות.

לא רק שזה חשוב להביא בחשבון את ההשפעה של ממסים על האורגניזם או תאים המשמשים למחקר, אבל גם זה חשוב לעקוב אחר ההשפעה של ממס בכימי המבחן עצמו. לדוגמה, Skaare et al. מצאו כי ⁵¹ המסת TCS בפוליאתילן גליקול (נפוץ במשחות שיניים ושטיפת פה) נחלשו השפעות אנטי בקטריאלי ואנטי פלאק בנשים נשיות בריאים בזמן פירוק בשמנים נגרם אובדן תפקוד מלא. לכן, היכולת של ממסים שונים כדי לווסת toxicant וסמים, כולל TCS, אפקטים יש לשקול בעיצוב assay. שימוש בשמנים או תוספי טעם עלול להפריע את ההשפעות של TCS במוצרים שונים ^50,51.

במאמץ למנוע את הצורך בשימוש בממסים אורגניים, שיפרנו על השיטה שלנו להמסת TCS ² על ידי ביטול השימוש בסול אורגנילפרוק. בפרוטוקול הנוכחי, אנו לפזר גרגרי TCS ישירות לתוך המאגר מימית עם חום (≤ 50 מעלות צלזיוס), ולאחר מכן לוודא את הריכוז של מניית TCS זה על ידי ספקטרופוטומטריה UV-Vis. שיפורים אלו אפשריים כי TCS הוא מסיס במים עד 40 מיקרומטר (http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf) והוכח להתנגד השפלה כאשר מחומם ל -50 מעלות צלזיוס (http:/ / Oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf) ^56,57. יש לנו גם יתרון נוסף של ספקטרופוטומטריה UV-Vis, כמו TCS ידוע גם לקלוט חום ב280 ננומטר ⁵⁸ עם מקדם הכחדה טוחנת של 4,200 ליטר / מול / ¹² ס"מ.

פרוטוקול זה מספק דרך פשוטה, אך יעילה לפזר גרגרי TCS למאגר ללא סיוע של ממס אורגני, ובכלל זה בעלות נמוכה ואימות מהירהריכוז, ומתאר assay microplate ניאון רב עוצמה למעקב אחר השפעות כימיות על degranulation תא תורן.

שים לב שכל מתכוני החיץ כלולים בטבלה בסוף טקסט הפרוטוקול.

יום 1:

1. הכנת התאים

1. לתכנן את 96 גם התקנת צלחת תכנית, שבמרכזה דגימות בדיקה בפריסה על מנת להימנע מהשפעות הקצה. להקצות שלוש משכפל עבור כל TCS ריכוז נבדק (± ממריץ degranulation של אנטיגן או ionophore), כמו גם triplicates לשחרור ספונטני (ללא ממריץ degranulation), שחרור מרבי (0.2% X-100 [טקסס] תמוגה חומר ניקוי טריטון), כמו גם בארות שמורות לדגימות רקע (שלא יכיל תאים). עבור כל יום ניסיוני לשכפל, לבחור פריסה אקראית חדשה מדגם ריכוזי TCS.
2. תקשורת החמה RBL (מתכון קבוע בטבלה) וטריפסין ב37 ° C אמבט מים.
3. בדקו תאי RBL בבקבוק T-25 (2-4 ימים מאז המעבר האחרון ופחות מ 3-4 חודשים מאז שהם מופשרים) לסימנים כלליים של לרפא טובה: pH התקין שצוין על ידי צבע של תקשורת, וחוסר עננות. מניחים את הבקבוק תחת מיקרוסקופ אור כדי לוודא שהבקבוק הוא נקי מזיהום ושהתאים נראים בריאים, ומחוברות כמו שצריך, ובעיקר מחוברים. שימו לב שתאים צריכים להיבדק לזיהום Mycoplasma בערך כל שישה שבועות ^22.

לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

4. קח את הבקבוק לתוך תא RBL רקמת סטרילית התרבות (TC) מכסה המנוע. התאים מחוברים לבוטטום של הבקבוק. עבודה מתחת למכסת מנוע TC ובאמצעות טכניקה סטרילית סטנדרטית, להסיר את כל התקשורת מבקבוק עם פיפטה סטרילית; התאים נשארים מחוברים לחלקו התחתון של הבקבוק. בשלב הבא, יש לשטוף בקבוק עם טריפסין 2 מ"ל, ואז להשליך לשטוף את זה.
5. הוסף טריפסין מ"ל בדיוק 2 כדי לכסות את תחתית הבקבוק. הכניס לתוך 37 ° C בחממה במשך 5 דקות כדי לאפשר לתאים להתנתק מהחלק התחתון של הבקבוק.
6. לאחר 5 דקות, פגע בצדו של הבקבוק עם כף יד פתוחה כדי לשחרר את התאים. באופן מיידי, להוסיף מדיה 18 מ"ל RBL כדי לשטוף את תאי הבקבוק וכדי להרוות את טריפסין. מייד לקחת את תערובת תא מדיה טריפסין מהבקבוק ולהעביר לצינור חדש, סטרילי 50 מ"ל (הנפח הכולל בצינור הזה הוא עכשיו 20 מ"ל).
7. לאחר הערבוב בעדינות אך ביסודיות, להסיר 50 μl של השעיה תא מהצינור הזה, ולהעביר לצינור 1.5 מיליליטר סטרילי microcentrifuge, שהוא מדגם שנספר. קח מדגם זה, כמו גם 50 מ"ל0; צינור המכיל תערובת תאים-Media-טריפסין מתוך מכסה המנוע TC לbenchtop.
8. לסובב את צינור מיליליטר 50 בצנטריפוגה (עם איזון ראוי) עבור 8 דקות ב XG 500; ביעילות תאי כדורי כוח הזה.
9. במהלך זמן הספין, לספור את התאים במדגם שבודדו לפני ספינינג. כדי לעשות זאת, ראשון להוסיף 50 μl של trypan כחול צבע ל50 μl של תאים בצינור 1.5 מ"ל, ובעדינות אך ביסודיות פיפטה מעלה ומטה כדי לערבב 5x. באופן מיידי, להעביר 10 μl של תערובת זו לhematocytometer הזכוכית, וספירת תאים באזור הרשת בעקבות הוראות יצרן. לספור לפחות 100 תאים לתוצאות סטטיסטיות סבירות.
10. חזרה במכסת מנוע TC, להסיר supernatant מהתאים שהסתחררו כלפי מטה.
11. שווי צינור התא, וקפיץ גלולה בחלק התחתון של הצינור כדי לשחרר את התאים.
12. הוסף מדיה לתאי trypsinized להניב צפיפות של 0.5 x 10 ⁶ תאים / מ"ל, המבוסס על ספירת התאים.
13. מערבבים היטב אך בעדינות כדי לשמור על תאים מושעים במהלך הליך הציפוי. שימוש Pipetman, לשים 100 תאי μl / גם בצלחת 96 היטב (בחלק תחתון שטוח, שחור), בעקבות גיליון תבנית הצלחת. האקראי כמה תאים נוספים לבארות כדי למנוע טעות שיטתית, ומערבב אחרי כל קבוצה של שלוש בארות נוסף. הקפד לא לשים את התאים לתוך הבארות שכותרתו עבור דגימות הרקע.
14. ברגע שכל התאים הועברו, הנח את מכסה הצלחת לצלחת, ולהעביר לחממה (CO ₂ 37 ° C / 5%) למשך הלילה. לנקות בעקבות טכניקה סטרילית סטנדרטית.

יום 2:

2. הכנת Triclosan

1. שימוש בגליל, מאגר מדד מדורג 250 מיליליטר Tyrodes (מתכון קבוע בטבלה) לתוך בקבוק 500 מיליליטר Erlenmeyer שכותרתו "TCS-חיץ". הוסף לעורר הבר. השתמש בכלי זכוכית, מערבבים הבר, מדחום מיועד לשימוש עם TCS בלבד.
2. גם בשלב זה, מדד 250Tyrodes מ"ל לתוך בקבוק 500 מ"ל Erlenmeyer נפרד, שכותרתו "חיץ שליטה". זכוכית שימוש, מערבבים הבר, מדחום שאינם מיועדים לTCS. הוסף לעורר הבר.
3. לשקול את 0.0022 גרם של גרגירי TCS ולהעביר לבקבוק "TCS-חיץ" (המכיל 250 מיליליטר Tyrodes מאגר). על מנת להעביר גרגרי יעילות לבקבוק Erlenmeyer, השתמש 10 מ"ל מ250 מ"ל שנמדד Tyrodes כדי לשטוף לשקול סירה, כדי לוודא שכל TCS כבר הועבר.
4. מקום בקבוק "TCS-חיץ" על גבי פלטה חמה שילוב / צלחת ומערבבים מגנטית, ולהגדיר אותו כדי לעורר במהירות manageably גבוהה. ברגע שגם מעורב, מניית TCS זה נומינלי תהיה 30 מיקרומטר (ריכוז בפועל יחושב לאחר חימום). (האם כל הערבוב במנדף כימי.)
   1. גם בשלב זה, למקם את בקבוק "שליטת החיץ" (המכיל שום TCS) על גבי פלטה חמה / צלחת ומערבבים שנייה שילוב מגנטי, ולהגדיר אותו כדי לעורר במהירות דומה.
5. הפעל מנורת UV / Vis לחמם את המנורה לשימוש מאוחר יותר.
6. מחממים את הפתרון "TCS-החיץ" עד 50 ° C תוך ערבוב מתמיד. פעם אחת עד לטמפרטורה, זמן של 90 דקות. במהלך 90 דקות, ימשיך לעקוב אחר 50 ° C טמפרטורה ומהירות מתאימה ערבוב לעתים קרובות.
   1. במקביל, מחמם את הפתרון "שליטת החיץ" (שהוא רק 250 מ"ל של חיץ Tyrodes רגיל) ל -50 מעלות צלזיוס עם ערבוב רציף. לאחר שהגיע 50 מעלות צלזיוס, זמן של 90 דקות, שבמהלכו טמפרטורת הזמן (שמירה על 50 מעלות צלזיוס) וערבוב שניהם תחת פיקוח.
7. בסוף 90 דקות, לקחת שתי צלוחיות Erlenmeyer את הצלחות וההעברה לbenchtop החמות.
8. שימוש בפונקציית סריקת אורך הגל בספקטרופוטומטר UV / יס, ריק במכונה על 1 מ"ל של הפתרון המחומם "שליטת החיץ" לפני סריקת 1 מ"ל של תמיסה מחוממת "TCS-חיץ". בדקו את הצורה של הקשת,ערך ספיגה שיא ד ב 280 ננומטר. כדי לקבוע את הריכוז, השתמש במשוואת באר למברט ₍₂₈₀ = ₂₈₀ ε ℓ ג) באמצעות ε ₂₈₀ של 4200 ליטר / מול / ¹² ס"מ וℓ של 1 ס"מ.
9. לאחר קביעת ריכוז TCS, להוסיף 0.249 גרם אלבומין בסרום שור (BSA) ל249 מ"ל הנותר של הפתרון "TCS-החיץ", ומערבבים היטב.
   1. במקביל, מוסיף 0.249 גרם לBSA 249 מ"ל הנותר של פתרון "שליטת חיץ", ומערבבים היטב.

יום 2:

3. אנטיגן מגורה Assay degranulation באמצעות תאי RBL-2H3

1. לפני שמתחיל, בדוק את ה-pH של כל המאגרים בשימוש, ולהבטיח כי הם ברורים ולא מעונן: זה כולל חיץ Tyrodes, חיץ נתרן אצטט, וחיץ קרבונט גליצין (מתכונים מפורטים בטבלה).
2. תקשורת חמה RBL וטריפסין באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
3. הפוך BT (1 מ"ג / מ"ל0; BSA בTyrodes חיץ): 0.05 G BSA + 50 מיליליטר Tyrodes חוצץ (X2). הכניס לתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
4. הפוך 0.2% טריטון X-100: 3.136 מ"ל של BT + 64 μl של 10% טריטון X-100 (ריכוז סופי של טריטון X-100 הוא 0.2%). מערבבים היטב על ידי היפוך, אבל לא מערבולת. הכניס לתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
5. התחל הכנת חיץ Tyrodes המחומם (צעדים "2" לעיל) הערה TCS ו:. אל תתחיל את הצעד הבא (חשיפת IgE) עד "TCS-החיץ" ופתרונות "בקרת חיץ" להגיע ל -50 מעלות צלזיוס, ומערבבים במשך 70 דקות הראשונה של זמן חום 90 דקות / ערבוב.
6. ברגע ששני פתרונות כבר עוררו על 50 מעלות צלזיוס במשך 70 דקות, לפצות 0.1 מיקרוגרם / מ"ל ​​אנטי DNP עכבר IgE (סיגמא) בתקשורת RBL לדוגמה בארות להיות רגיש (100 μl / טוב). IgE המניות לא צריכה להיות מבוגרות יותר מ -30 ימים שבם מאוחסנים על 4 מעלות צלזיוס; להקליט בן כמה המניות היא. פליק לערבב, אבל לא לעשות IgE מערבולת.
7. מתחת למכסת מנוע TC,להוסיף 0.6 IgE מניית μl (המניות היא 1 מ"ג / מ"ל) לתקשורת RBL מ"ל 6 בצינור 50 מ"ל. בתוך צינור מ"ל 50 שניות, להוסיף 6 מ"ל של תקשורת RBL רגיל בלבד (אשר מיועד לדגימות nonsensitized).
8. לזרוק את כל המדיה מצלחת 96 היטב (שהוכן ביום 1) לכיור, ולהביא את הצלחת מתחת למכסת מנוע TC.
9. באופן אקראי להוסיף 100 תקשורת μl / תערובת IgE לבארות שצריכים להיות מגורה (סה"כ 48 בארות). תערובת זו אינה מיועדת ל" ספונטנית "," טקסס ", ודגימות" רקע ".
10. באופן אקראי להוסיף 100 תקשורת RBL רגיל μl רק "טקסס", "הספונטנית", ובארות "רקע".
11. לשים מכסה צלחת על צלחת, ולאחר מכן לעבור לצלחת 5% CO _2/37 ° C בחממה במשך שעה 1.
12. במהלך הדגירה שעה 1, בצע את השלבים 3.13-3.24.
13. על benchtop, להכין את דילולים אנטיגן. הוסף 0.53 μl של DNP-BSA + 850 μl 1.6 מ"ג / מיליליטר המניות & #160; BT כדי לקבל ריכוז של אנטיגן 1 מיקרוגרם / מ"ל. וורטקס ולהפוך מניית לערבב.
14. פעם אחת "TCS-החיץ" ו" חיץ שליטה "כבר מחוממים ולאחר מכן עוררו עבור 90 דקות ב -50 מעלות צלזיוס, להמשיך עם שאר ההכנות לפרוטוקול TCS (ללכת לצעדים 2.6 - 2.8.1). לאחר BSA הוא נמס לתוך שני פתרונות, תמשיך בהמשך.
15. להתחיל בהכנת מאגרי החשיפה, עם ± Ag, ± TCS. ראשית, ממדגם 249 מ"ל של פתרון "TCS-חיץ" (שחומם כבר ועורר על 90 דקות), העברת 50 מ"ל לצינור חרוטי 50 מ"ל חדש. הסר μl 20 של 50 מיליליטר aliquot הזה ולהחליף אותו עם 20 μl של אנטיגן מיקרוגרם / מ"ל ​​1 מוכן קודם לכן לריכוז סופי של אנטיגן 0.0004 מיקרוגרם / מ"ל ​​DNP-BSA. וורטקס ולהפוך.
    1. תווית זו "צינור 1, גבוה TCS / + Ag / + BT." הוא משמש לדילולים וחשיפת הריכוז הגבוה ביותר TCS.
16. מן המדגם 249 מ"ל של פתרון "שליטת חיץ", להעביר 50 מ"ל לצינור 50 מ"ל חדש. הסר μl 20 של aliquot 50 מ"ל החדש ולהחליף עם 20 μl של אנטיגן מיקרוגרם / מ"ל ​​1 מוכן קודם לכן לריכוז סופי של אנטיגן 0.0004 מיקרוגרם / מ"ל ​​DNP-BSA. וורטקס ולהפוך.
    1. תווית "צינור 2, לא TCS / + Ag / + BT" הזה. משמש לדילולי TCS ו0 חשיפת ריכוז TCS מיקרומטר.
17. עכשיו קח את 50 מ"ל של תמיסה "TCS-חיץ" והכניס לתוך שפופרת 50 מ"ל אחר. הסר μl 20 מaliquot 50 מ"ל החדש ולהחליף אותו עם 20 μl של BT רגיל. וורטקס ולהפוך. הוא הוסיף שום אנטיגן.
    1. תווית זו "תחתית 3, גבוהה TCS / לא Ag / + BT." זה משמש עבור רקע.
18. העבר את 50 מ"ל של תמיסה "שליטת חיץ" לצינור 50 מ"ל אחר. קח את 20 μl מזה ne aliquot w 50 מ"ל ולהחליף אותו עם 20 μl של BT רגיל. וורטקס ולהפוך. (אין Ag הוא הוסיף.)
    1. תווית זו "צינור 4, לא TCS / לא Ag / + BT." זה משמש עבור רקע ודגימות ספונטניות.

	BSA	TCS	אנטיגן
צינור 1		גבוה []
צינור 2		לא
צינור 3	/ "Width =" files/ftp_upload/50671/check.jpg 15px "/>	גבוה []	לא
צינור 4		לא	לא

19. לחשב ולהקליט את כרכים לדילולים לאחר קביעת הריכוז של מניית "TCS-החיץ". סה"כ נפח לכל ריכוז דילול צריך להיות 1 מ"ל וצריך להיות מוכן בצינור microcentrifuge סטרילי. השתמש P2 המכויל וP1000 Pipetman.

20. לאחר הדגירה IgE 1-HR, לקחת צלחת מהחממה ולזרוק את כל המדיה לתוך כיור. (הערה: אם ידועים כימיקלים בדיקה להיות רעיל יותר את המוצר לצרכן TCS, סילוק פסולת מסוכן עשויה להיות נחוצה.)
21. שימוש Combitip, באופן אקראי לשטוף תאים בצלחת 96 היטב עם BSA-Tyrodes חוצץ (200μl / טוב). שחרר את החיץ לשטוף על הצדדים של הבארות, ולא ישירות על גבי התאים המצורפים, על מנת להימנע מלהפריע לתאים המצורפים. חזור על התהליך בפעם שנייה.
22. כדי להכין את הטיפולים ליישום, מערבולת ולהפוך דילולים ממש לפני בנוסף לצלחת.
23. החל עם החלק העליון של הצלחת: אקראי להוסיף triplicates של 200 μl כל אחד מפתרונות אנטיגן (עם ריכוזים נכונים של TCS) לבארות המתאימות. המשך לתחתית צלחת. הוסף פתרון "שליטת חיץ" בתוספת Ag (מתוך "צינור 2" לעיל) לכל "הלועגים" בצלחת.
24. הוסף 200 μl של פתרונות מתאימים לבארות מתאימות:
    1. הוסף μl 200 בארות X-100 ל" טקסס ", המיועדים 0.2% טריטון.
    2. לאחר מכן, להוסיף 200 μl של צינור 3 ל3 הבארות שכותרתו "רקע (BkgD) TCS-הגבוה ביותר" על הצלחת.
    3. לבסוף, להוסיף 200 μlשל צינור 4 עד 6 בארות שכותרתו "ספונטנית".
25. דגירה את הצלחת במשך שעה 1 ב 37 ° C / 5% CO _2.
26. במהלך הדגירה שעה 1: קבל שני דליים של קרח (אחד לצלחת "ישנה" בחממה ואחד לצלחת חדשה). הפשירו 4-methylumbelliferyl-N-אצטיל-beta-D-glucosaminide (4-MU) בטמפרטורת חדר למשך עד 40 דקות, שמירה בנייר הכסף כי זה רגיש לאור.
    1. לאחר 4-MU המניה מופשר, להמציא פתרון 4-MU עובד: 150 מניות μl + 14.85 מ"ל של חיץ אצטט קר (מתכון נתון בטבלה); מערבולת והפוך. שמור ב50 צינור צנטריפוגות מ"ל, עטוף בנייר כסף, ועל קרח עד לשימוש.
    2. שימוש Combitip, באופן אקראי להוסיף פתרון עובד 4-MU קר μl 100 לחלק התחתון ביותר של כל טוב של ניו גרנייה שחורה צלחת 96 היטב (על קרח דלי # 2). ראשון להתחיל על ידי הוספת הפתרון עובד באופן אקראי בחלק העליון של הצלחת, באופן אקראי בתחתית הצלחת, באופן אקראי בתוך טריטון X-100 בארות,ולבסוף באופן אקראי בתוך בארות רקע.
    3. קבל את התיבה חדשה של P200 טיפים לשלב הבא.
27. בסוף הדגירה 1-HR, לשים תא צלחת מן החממה אל דלי קרח # 1, פיפטה supernatant למעלה ולמטה 4-5x (בעדינות, לא החדרת בועות), מסתובב גם לערבוב טוב, אבל לא נוגע בתאים תוך כדי ערבוב . באופן שיטתי, להוציא 25 מדגם μl מכל טוב ומקום לצלחת החדשה עם מצע (באותו סדר של דגימות, כפי שתוכנן במקור לצאת). פיפטה מעלה ומטה כדי לערבב מדגם באופן יסודי, כאשר בבאר חדשה, ללא החדרת בועות.
28. דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס / 5% CO _2.
29. לאחר הדגירה 30 דקות, באופן אקראי להוסיף 200 μl של גליצין-קרבונט חיץ קר בכל טוב (באמצעות Combitip) כדי למלא את הבארות עד 325 סך הכל μl. (הפוך תוספת זו לטריטון X-100 דגימות שעברה, כדי למנוע זליגת טריטון X-100). בדקו אם יש בועות לפני קריאת צלחת (לתקוע עם P10 pipet הנקיte טיפ פופ כל בועות).
30. הפעל את הצלחת בקורא צלחת הקרינה (ללכת לסעיף 4).

יום 2:

4. הוראות קורא צלחת ניאון וניתוח נתונים

1. פתח Gen5 תכנית, וסעיף ניסוי פתוח.
2. הפעל קורא צלחת וצלחת כנס (פינה שמאלית העליונה היא A1).
3. פרוטוקול נוהל קראו להגדיר קריאות מותאמות אישית. אל תוסיף שום דבר על דגימות, משכפל, וכו ', על מנת לאסוף נתונים הקרינה גלם מכל טוב.
4. תחת "לקרוא" לבחור "הקרינה", "נקודות קצה", "מהירות נורמלית", "רווח 40", "עירור 360/40", "פליטה", עמדת אופטיקה 460/40: 50% למעלה. למעלה אופטי קוזז: 7 מטרמ '. לא ללחוץ, אין עיכוב, אין קינטיקה, לא לפקח היטב, טמפרטורה: חממה לדרך.
5. בחר תחתון שחור שטוחה, צלחת 96 היטב (96 גרנייה היטב, תחתית שטוחה).
6. עסקה עם פריסת הצלחת: פרוטוקול פריסת צלחת. הגדר את הדגימות מבלי לציין חוזר, דילולים וכו '
7. צלחת לקרוא.
8. שמור את הקובץ: לחץ על הכפתור "אקסל", שייצא קובץ הנתונים ל-Excel. האם זה עבור פריסה וצלחת למטריצה. שמור את הקובץ במחשב ועל כונן USB.
9. ב-Excel, לחסר קריאה הממוצעת רקע מכל מדגם, כולל טריטון X-100 בארות.
10. חישוב% degranulation היחסי על ידי חלוקת כל ערך (שכבר היה נגרע רקע) על ידי הערך הממוצע טריטון X-100, ולאחר מכן להכפיל ב -100 כדי לעשות את זה באחוזים.
11. ממוצע של כל triplicates, ולחשב סטיית תקן. נתוני גרף בExcel כאומרים ערכי ± סטיית תקן. לבדיקה סטטיסטית, לעבור עכשיו לתוכנה על ידי פריזמה GraphPad.

יום 2:

5. Assay degranulation מגורה ionophore באמצעות תאי RBL-2H3

1. עקוב פרוטוקול ל" הכנת התאים "(סעיף 1, יום 1) ו" הכנת triclosan" (סעיף 2, יום 2), כפי שהורה לעיל. דוגמא פריסת הצלחת לגירוי ionophore מוצגת למטה.

לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

2. לפני שמתחיל, בדוק את ה-pH של כל המאגרים בשימוש, ולהבטיח כי הם ברורים ולא חלקית. Tyrodes, חיץ נתרן אצטט, וגליצין קרבונט חיץ (מתכונים מפורטים בטבלה).
3. הכן 50 מיליליטר צינור חרוטי אחד של BT על ידי הוספת 0.05 גרם לBSA חיץ 50 מיליליטר tyrodes ועל ידי vortexing לערבב היטב. דגירה של 37 ° C אמבט מים.
4. הפוך 0.2% טריטון X-100 עם 0.0032% DMSO (ריכוז רכב ionophore סידן הסופי) על ידי הוספת 96 μl של 10% טריטון X-100-4.704 מ"ל BT. מערבבים היטב. בשלב בא, להוציא 0.155 μl של פתרון זה וזורקים. עכשיו להוסיף בחזרה ב0.155 μl של 100% DMSO.
5. הכן מלאי 5 מ"מ (2.5 מ"ג / מ"ל) של A23187 ionophore מאבקה על ידי הוספת 400 μl של 100% DMSO הטרי לתוך בקבוקון ionophore וvortexing לערבב. פעם אחת בתמיסה,להעביר לצינור 1.5-מיליליטר חרוטי, תוכן תקליטים ותאריך של היום ופקיעת (3 חודשים מהכנה כאשר הם מאוחסנים כיאות ב -20 ° C).
   1. לחלופין, אם באמצעות מניות קפוא היום, הפשרה על קרח, ולבדוק שionophore 5 מ"מ A23187 הוא גם מעורב וברור. וורטקס, קפיצי, ולהפוך מניית הזו לפני השימוש. מועד קובע של הכנה ולוט # של A23187 זה.
6. פעם אחת "TCS-חיץ" ו" חיץ שליטה "כבר מחוממים ובחש עבור 90 דקות, תמשיך את שאר ההכנות לפרוטוקול TCS (ללכת לצעדים 2.6-2.8.1). לאחר BSA הוא מעורבב היטב לתוך שני פתרונות, המשך בשלבי הפרוטוקול הנותרים.
7. מן המדגם 249 מ"ל של פתרון "TCS-חיץ", להעביר 50 מ"ל לצינור חרוטי 50 מ"ל חדש. הסר 1.8 μl של aliquot 50 מ"ל ולהוסיף 1.8 μl של 5 מניות ionophore מ"מ. מערבולת 3x עבור 8 שניות ולהפוך 3x. ריכוז ionophore סופי הוא 180 ננומטר. שימו לב שזה ריכוז של A23187 ישתנה בהתאם לעוצמת מניית, ותגובת מינון ionophore A23187 מומלצת לזהות ריכוז של A23187 שמעורר רמת degranulation של בערך 20% שחרור מקסימאלי, שזוהה כnoncytotoxic לRBL-2H3 תאים על ידי assay cytotoxicity (ראה סעיף ^2).
   1. תווית זו "צינור 1, גבוה TCS / + ionophore / + BT." המשמש לדילולים וחשיפת הריכוז הגבוה ביותר TCS.
8. מן המדגם 249 מ"ל של פתרון "שליטת חיץ", להעביר 50 מ"ל לצינור חרוטי 50 מ"ל חדש. להוציא 1.8 μl של aliquot 50 מ"ל ולהוסיף חזרה ב1.8 μl של 5 מניות ionophore מ"מ. מערבולת 3x עבור 8 שניות ולהפוך 3x. ריכוז ionophore סופי הוא 180 ננומטר.
   1. תווית זו "צינור 2, לא TCS / + ionophore / + BT." זה משמש לדילולים ו 0 ריכוזי TCS מיקרומטר.
9. מן המדגם 249 מ"ל של R 20; פתרון "TCS-חיץ, להעביר 50 מ"ל לצינור חרוטי 50 מ"ל חדש. להוציא 1.8 μl של aliquot 50 מ"ל החדש ולהוסיף 1.8 μl של 100% DMSO. מערבולת 3x עבור 8 שניות ולהפוך 3x; לא ionophore הוא הוסיף.
   1. תווית זו "תחתית 3, גבוהה TCS / לא ionophore / + BT / DMSO +", המשמשת רקע.
10. מן המדגם 249 מ"ל של פתרון "שליטת חיץ", להעביר 50 מ"ל לצינור חרוטי 50 מ"ל חדש. להוציא 1.8 μl מaliquot 50 מ"ל החדש ולהוסיף 1.8 μl של 100% DMSO. מערבולת 3x עבור 8 שניות ולהפוך 3x. הוא הוסיף לא ionophore.
    1. תווית זו "צינור 4, לא TCS / לא ionophore / + BT / DMSO +", המשמשת דגימות שחרור ספונטניות.

	BSA	TCS	Ionophore	הוסיף 100% DMSO
צינור 1	"Src =" "width =" / files/ftp_upload/50671/check.jpg 15px "/>	גבוה []		לא
צינור 2		לא		לא
צינור 3		גבוה []	לא
צינור 4		לא	לא	אק סימן "עבור: תוכן-width =" 0.1 ב" src = "" width = "/ files/ftp_upload/50671/check.jpg 15px" />

11. לחשב ולהקליט את כרכים לדילולים לאחר קביעת הריכוז של מניית "TCS-החיץ". השתמש P2 המכויל וP1000 Pipetman. סה"כ נפח לכל ריכוז דילול צריך להיות 1 מ"ל, וצריך להיות מוכן בצינור microcentrifuge סטרילי:

12. קח את התאים מצופים אתמול מחוץ לחממה, ואת המדיה ריקה לכיור. שימוש Combitip, באופן אקראי לשטוף תאים בצלחת 96 היטב עם BT (200 μl / טוב). חזור על לשטוף בפעם שנייה.
13. כדי להכין את הטיפולים ליישום, מערבולת ולהפוך דילולים ממש לפני בנוסף לצלחת. החל עם החלק העליון של הצלחת: אקראי להוסיף triplicates של 200 μl כל אחד מן הריכוז הנכון של TCS לcorresponding היטב. המשך לתחתית צלחת. הוסף פתרון "שליטת חיץ" בתוספת A23187 (מתוך "צינור 2" לעיל) לכל "הלועגים" בצלחת.
14. הוסף 200 μl של פתרונות מתאימים לבארות מתאימות:
    1. הוסף μl 200 בארות X-100 ל" טקסס ", המיועדים 0.2% טריטון.
    2. לאחר מכן, להוסיף 200 μl של צינור 3 ל3 הבארות שכותרתו "רקע (BkgD) TCS-הגבוה ביותר" על הצלחת.
    3. לבסוף, להוסיף 200 μl של צינור 4 עד שש בארות שכותרתו "ספונטנית".
15. דגירה את הצלחת במשך שעה 1 ב 37 ° C / 5% CO _2.
16. במהלך הדגירה שעה 1: קבל שני דליים של קרח (אחד לצלחת "ישנה" בחממה ואחד לצלחת חדשה). הפשירו 4-methylumbelliferyl-N-אצטיל-beta-D-glucosaminide (4-MU) בטמפרטורת חדר למשך עד 40 דקות, שמירה בנייר הכסף כי זה רגיש לאור.
    1. לאחר 4-MU המניה מופשר, לפצות 4-MU העבודה solutiב: 150 מניות μl + 14.85 מ"ל של חיץ אצטט קר (מתכון נתון בטבלה); מערבולת והפוך. שמור ב50 צינור צנטריפוגות מ"ל, עטוף בנייר כסף, ועל קרח עד לשימוש.
    2. שימוש Combitip, באופן אקראי להוסיף פתרון עובד 4-MU קר μl 100 לחלק התחתון ביותר של כל טוב של ניו גרנייה שחורה צלחת 96 היטב (על קרח דלי # 2): ראשון להתחיל על ידי הוספת הפתרון עובד באופן אקראי בחלקו העליון של צלחת, באופן אקראי בתחתית הצלחת, באופן אקראי בתוך טריטון X-100 בארות, ולבסוף באופן אקראי בתוך בארות רקע.
    3. קבל את התיבה חדשה של P200 טיפים לשלב הבא.
17. בסוף הדגירה 1-HR, לשים תא צלחת מן החממה על קרח דלי # 1, פיפטה supernatant למעלה ולמטה 4-5x (בעדינות, לא החדרת בועות), מסתובב גם לערבוב טוב, אבל לא נוגע בתאים תוך כדי ערבוב . באופן שיטתי, להוציא 25 מדגם μl מכל טוב ומקום לצלחת החדשה עם מצע (באותו סדר של samples, כפי שתוכנן במקור לצאת). פיפטה מעלה ומטה כדי לערבב מדגם באופן יסודי, כאשר בבאר חדשה, ללא החדרת בועות.
18. דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס / 5% CO _2.
19. לאחר הדגירה 30 דקות, באופן אקראי להוסיף 200 גליצין-קרבונט חיץ קר μl לכל טוב (באמצעות Combitip) כדי למלא את הבארות עד 325 סך הכל μl (להפוך את זה בנוסף לטריטון X-100 הדגימות האחרונות, כדי למנוע זליגת טריטון X-100). בדקו אם יש בועות לפני קריאת צלחת (לתקוע עם נקי P10 פיפטה קצה כדי לפוצץ את כל בועות).
20. הפעל את הצלחת בקורא צלחת הקרינה (עקוב אחר כל השלבים בסעיף 4).

כאשר מחומם ל -50 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות, את ספקטרום ספיגת UV-Vis לTCS מייצר עקומה חזקה, חלק בין ~ 260 ו 300 ננומטר, עם שיא ב 280 ננומטר, כפי שמוצגת באיור 1. ספקטרופוטומטריה UV-Vis היא, אפוא, כלי חשוב שיכול להיות מנוצל לחישוב ריכוז, שכן מקדם הקליטה הטוחנת שפורסם ב 280 ננומטר הוא 4,200 ליטר / מול / ¹² ס"מ. מצאנו כי TCS אינו נופל מפתרון במסגרת הזמן של ניסוי degranulation כולו, לאחר 50 ° C החימום (מידע לא מוצג).

לאחר השימוש בשיטת חימום זו לפזר TCS ישירות לתוך המאגר מימית, בדקנו את ההשפעה של TCS על degranulation תא התורן באמצעות assay הקרינה מבוסס שהיה מותאם מNaal et al. ¹ assay זה רושם את הרמה של β-hexosaminidase שוחררה מתורן תאים לאחר הדגרה של שעה אחת על ידי איתור מוצר מצע fluorogenic. בין אם מגורה degranulate ידי DNP-BSאנטיגן (איור 2) או ionophore הסיד A23187 (איור 3), אחד יכול לראות בבירור שTCS גורם לעיכוב מינון תגובה משמעותי של שחרורו של β-hexosaminidase (degranulation כלומר).

איור 2 הוא נציג של תוצאות שהתקבלו עבור תאי RBL IgE רגישים, שטופחו במשך שעה 1 ב" TCS-חיץ "או" חיץ שליטה ", ונחשפו למינון האנטיגן DNP-BSA של 0.0004 מיקרוגרם / מ"ל. ריכוז זה של DNP-BSA עורר תגובת degranulation מוחלטת ממוצעת של 22.5% ± 0.1 (ממוצע ± סטיית תקן) בהעדר TCS. עיכוב משמעותי סטטיסטי של degranulation החל בשעה 5 מיקרומטר, שבו רמות degranulation היו 0.79 ± 0.05 פי (ממוצע ± סטיית תקן) של 0 רמות בקרת TCS מיקרומטר. ככל שעולה ריכוז TCS, יש השפעה ממתנת גדולה יותר של TCS, המציגה מערכת יחסים מינון תגובה חזקה. TCS, ב20 מיקרומטר, almosלא מבטל לחלוטין את תגובת degranulation, לרמות שווים בערך לdegranulation הספונטני (שבו אין אנטיגן הוא היום). בסך הכל, נתון זה מראה עיכוב חזק של degranulation תא multivalent אנטיגן מגורה תורן בשל ריכוז TCS-אומת, ללא השימוש בממסים אורגניים.

באיור 3, סידן ionophore A23187 שימש כדרך לחקור את המנגנון של TCS-Induced ריסון של degranulation בתאי פיטום RBL. A23187 משמש כממריץ אלטרנטיבי משום שהיא עוקפת את crosslinking FcεRI ואירועי איתות אחרות במעלה הזרם של זרימת סידן, אבל עדיין גורמת degranulation. תאי פיטום RBL הודגרו במשך שעה 1 ב" TCS-חיץ "או" חיץ שליטה ", המכיל מינון ionophore סיד של 180 ננומטר. בהעדרו של TCS, זה ריכוז של A23187 עורר תגובת degranulation מוחלטת ממוצעת של 25.1% ± 4.7 (ממוצע ± סטיית התקן). עיכוב של degranulation היהמצאתי עם קטן כמו 1 מיקרומטר TCS (0.63 ± 0.11 [ממוצע ± SD]). כתוצאת מגדילה ריכוז TCS, כך גם את חומרת העיכוב: ב5 מיקרומטר, 0.21 ± 0.04 פי של 0 רמות בקרת TCS מיקרומטר; ב10 מיקרומטר, 0.09 ± 0.05; ב 15 מיקרומטר, 0.077 ± 0.006; וב -20 מיקרומטר , 0.09 ± 0.02 (אמצעי ± סטיית תקן). למעשה, מ5 מיקרומטר וריכוזים גבוהים יותר של TCS, רמות degranulation-Induced A23187 נמצאו בסמוך לרמת שליטה ספונטנית (שבו אין A23187 קיים בכלל). בסך הכל, איור 3, בשילוב עם איור 2, מצביע על כך שהאירועים המולקולריים הממוקדים על ידי TCS הם מורד זרם סביר של סידן.

יש TCS ספקטרום ספיגת UV-Vis נציג TCS אפונה חזקה: איור 1.K ב 280 ננומטר, המאפשר קביעה קלה של _280, כמו גם מעניק את היכולת להשתמש במקדם ההכחדה הטוחנת של 4,200 ליטר / מול / ¹² ס"מ כדי לקבוע את הריכוז בפועל של TCS מומס חיץ tyrodes. הקו הצהוב מציין את השיא ב 280 ננומטר. בדוגמה זו, ערך הספיגה ב 280 ננומטר הוא .11876, אשר מצביע על ריכוז TCS של 28.28 מיקרומטר. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 2:. תגובת degranulation נציג של תאי פיטום IgE RBL רגישים חשופה ל0.0004 מיקרוגרם / מיליליטר אנטיגן DNP-BSA וTCS (0-20 מיקרומטר) ערך שחרור ספונטני (ללא נוכחות אנטיגן) מתואר עבור הפניה. הערכים מייצגים מתכוונים7; סטיית התקן של דגימות בשלושה עותקים. כפי שהוצג, הנתונים היו מנורמלים לשליטה (0 מיקרומטר TCS), והבדלים משמעותיים שנקבעו בתוכנת פריזמה עם ANOVA לכיוון אחד ואחריו מבחן post hoc של Tukey (השוואות שנעשו לתגובת 0.001 מיקרומטר TCS ממוצע). משמעות היא מיוצגת על ידי *** p <0.001. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 3:. תגובת degranulation נציג של תאי פיטום RBL מגורה עם ionophore סידן 180 ננומטר A23187 בנוכחותו של TCS (0-20 מיקרומטר) מדגם שחרור ספונטני (אין לו הווה ionophore) מתואר עבור הפניה. ערכים מייצגים סטיית תקן ממוצעת של דגימות ± בשלושה עותקים. כpresenteד, הנתונים לשליטה מנורמלים (0 מיקרומטר TCS), והבדלים משמעותיים שנקבעו בתוכנת פריזמה עם ANOVA לכיוון אחד ואחריו מבחן post hoc של Tukey (השוואות שנעשו לתגובת 0.001 מיקרומטר TCS ממוצע). משמעות היא מיוצגת על ידי *** p <0.001; ** p <0.01. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

בשנת 2004, Naal et al. ¹ פיתחה biosensor תא תורן לבדיקת תפוקה גבוהה של degranulation. זה assay חזק שיש לנו להתאים ללימודי TCS ומפורט בסרטון זה. לפני Naal et al. Assay ^1, degranulation תא תורן היה להעריך באופן שגרתי באמצעות ^59-61 β-hexosaminidase, אבל השיטות המוקדמות אלה מנוצלים fluorometers שבדגימה אחת הייתה לקרוא בכל פעם. חשוב לציין, Naal et al. הקונקורדנציה ישירה שנוצרה בין השיטה שלהם יותר התפוקה גבוהה תוך שימוש בקורא microplate והשיטה הקודמת שבו דגימות קראו אחד ב-פעמיות בfluorometer. לסיכום, Naal et al. ¹ השתפר מאוד את המהירות, כוח, פשטות והאמינות של assay על ידי התאמתו לפלטפורמת microplate תפוקה גבוהה, כמו גם על ידי שילוב של זרימת עבודה לכמה שינויים. הנה, יש לנו להתאים עוד יותר assay זה למחקר של כימיקלים בדיקה שונים, בפרט, כאן, התרופה TCS בכל מקום. את פרטי וידאו את השלבים של assay זה מאוד שימושי. בנוסף, יש לנו גם פיתחה שיטה-ללא ממס אורגני של החלת TCS במאגר מימית, ואנחנו מראים הליך פשוט, בעלות נמוכה לאימות ריכוז TCS. שיטות אלו צריכה להיות מועילה לשדה גדל ככל הנראה מרעלי triclosan. בדיון זה, אנחנו פירוט מספר שיקולים לשימוש assay degranulation זו כדי לבדוק כימיקלים אחרים גם כן.

TCS הוכן ישירות לחיץ מימי ללא סיוע של ממסים אורגניים, הריכוז אומת על ידי ספקטרופוטומטריה UV-Vis (איור 1), ולאחר מכן את ההשפעה של TCS (<30 מיקרומטר) נבדקה על degranulation תא פיטום (איורים 2 ו -3) , באמצעות assay microplate הקרינה כדי לזהות הנוכחות של, סמן הפונדקאי β-hexosaminidase לdegranulation. מצאנו כי TCS הוא מסוגל לדכא את שחרורו של β-hexosa באופן משמעותיminidase מתאי פיטום RBL כאשר מומסים בריכוז נמוך של אתנול (0.24% כרך / כרך) או ^2, כמתואר כאן, ישירות לתוך המאגר מימית. על ידי ויתור ממס אורגני, אנו רואים ממש בולטים יותר ריסון באנטיגן-Induced degranulation לעומת המחקרים שלנו שבו TCS פורק ב 0.24% אתנול (כרך / כרך). לדוגמה, הנה יש לנו הפגנו ירידה> 50% בdegranulation-Induced אנטיגן (0.46 פי ± 0.07), שהוא גדול בהרבה מהירידה של 25% ~ שדיווחנו על 10 מיקרומטר TCS מומס ב0.24% אתנול (0.76 פי ± 0.02) ^2. באותה הרוח, קבענו לתאים A23187-מגורה ש, על ידי 5 מיקרומטר, TCS מעכב degranulation לרמות שחרור ספונטניים; השפעה זו לא הפגינה עד 10 מיקרומטר TCS בנו קודם לכן, אתנול ניצול-, המחקר ^2. ישנן שתי סיבות אפשריות לפער זה: או 0.24% אתנול רכב ² פוחת יכולתו של TCS לעכב cel התורן הפעילdegranulation L, או TCS שהשתמשנו היה פחות מרוכז מצפוי (מאז ריכוזים לא אומתו על ידי ספקטרופוטומטריה UV-Vis במחקר הקודם ^2). לגבי היעד המולקולרי לעיכוב של TCS של degranulation תא תורן, סביר להניח שמתרחש אי שם במורד מפל העברת האותות של סידן זרם ^2. אנחנו השתמשנו סיד ionophore A23187 כמעורר degranulation לעקוף אירועי איתות מוקדמים, וההשפעה המעכבת של TCS התעקשה, מצביע על כך שהיעד לעיכוב TCS במסלול degranulation אינו סביר הממוקם במעלה הזרם של זרימת סידן. יש לנו הראינו בעבר כי עלעול קרום של תאים אלה גם מדוכא עקב טיפול TCS, המצביע על האפשרות של יעד מסלול משותף ^2.

מחקרים קודמים מצאו את ספקטרום הספיגה של TCS יש שיא מרבי ב 280 ננומטר ומקדם קליטה טוחנת הוערך להיות 4200 ליטר / מול / ס"מ בwavelen זהGTH (בערכי ה-pH מתחת PK) ^12. הוכח שחימום TCS לא מוביל לזילות תרמית ^57, ומחקר אחר הראה הצלחה בהמסת TCS במים בעת היותו מחומם ל 50 מעלות צלזיוס, ללא סיוע של ⁵⁶ ממס אורגני. כאשר נעשה שימוש בכל חומר כימי בדיקה חדשה, מסיסותו בחיץ המימית, כמובן, יש לשקול בזהירות. יש לנו גם מצאנו כי, כאשר חימום TCS, את הצורה של readout הרפאים אינה מושפעת אם הוא מחומם ל40-90 דקות (מידע לא מוצג): זה מצביע על חוסר השפלה של TCS כאשר מחוממים לתקופה ארוכה יותר של זמן. שים לב, עם זאת, כי פירוק TCS הוא גדול יותר מאשר ב 90 דקות 40 דקות. יש לנו גם אישר כי TCS אינו נופל מפתרון לתקופת ניסוי degranulation (מידע לא מוצג).

אנטיגן DNP-BSA וריכוזי ionophore סידן השתמש במחקר זה נבחרו על בסיס מבחני ואנטיגן תגובת ionophore במינון,ד נבחרו כדי לעורר רמות degranulation מתונות לדמויות המייצגות 2 ו -3. דוגמה של assay תגובת מינון האנטיגן שניתן לראות באיור 1 א ^'2 של העבודה הקודמת שלנו. בעת קביעת ריכוז אנטיגן או ionophore לשמש בניסוי שלך, חשוב להיות מודע לכך שניסויים בתגובה ממריץ מינון צריכים להיעשות מעת לעת, בדרך כלל לפחות אחת לחודשיים, שכן תאי RBL-2H3 לפעמים לתפקד variably. הריכוז שמניב אחוז degranulation הרצוי יכול להשתנות בהתאם לגילם של התאים, ועל הכנת אנטיגן / ionophore. כמו כן, כפי שראינו עם אורגני arsenite ^22, אחוזי degranulation המוחלטים (רמות של אנטיגן משמשות) יכולים להשפיע על הרמות של אפקטי toxicant על ​​degranulation RBL, כך toxicant מינון תשובות צריכים להיעשות בכמה ריכוזים אנטיגן / ionophore שונים. כמו כן, חשוב לשקול את conce הסופיntration של רכב DMSO כאשר גירוי degranulation עם ionophore, מאז degranulation מושפע DMSO ^62. מצאנו ריכוזי DMSO שימוש בפרוטוקול זה אינו משפיעים degranulation, קריאת רקע, או 0.2% טריטון X-100 ערכים ^2.

בנוסף לאנטיגן multivalent DNP-BSA וionophore סיד A23187, קיימים מספר שיטות אחרות של גירוי RBL-2H3. אחת השיטות הללו היא גירוי באמצעות חשיפה למתחם 48/80 יחד עם ⁶³ קוורצטין. נוסף הוא crosslinking של קולטני IgE-כרוך עם IgG אנטי-IgE, כפי שנבדקנו בעבר יחד עם TCS חשיפה ^2. שיטות גירוי רבות אחרות קיימות, וכל אחת מהשיטות האלה מטפלת בהיבט אחר של מכניסטית degranulation תא תורן. קורא הצלחת assay זה יכול להיות מותאם לשימוש עם רבים מגירוי חלופי אלה, הרחבת השירות שלה עוד יותר.

יש פרוטוקול degranulation זו יש הפוטנציאל לשמש במגוון רחב של צ'הMICALS. במחקר על כל חומר כימי בדיקה באמצעות assay זה, בקרות יש להפעיל את הדברים הבאים: (1) השפעה כימית מבחן על רקע (אין תאים) קריאות; (2) השפעה הכימית על degranulation הספונטני (תאים עם לא IgE , אין אנטיגן, לא ionophore), (3) השפעה הכימית על Triton-X-100 של תאי lysed ערכים (אין אנטיגן, לא ionophore). יכולות להיות עבדו בדיקות אלו בקלות לפריסת הצלחת. בעבר, מצאנו TCS משפיע על אף אחד משלושת הפרמטרים האלה ^2. בנוסף, יש להפעיל מבחנים כדי לקבוע שהבדיקה כימית לא יפריע לתגובת β-hexosaminidase אנזים / מצע עצמו בתא ללא הכנה, כמתואר בS1 דמותו של סעיף נתונים משלים של פאלמר ואח' נספח. ² מצאנו כי TCS אינו מפריע ליכולת של β-hexosaminidase לדבוק מצע fluorogenic 4-MU ^2. השפעות של כל ממסים המשמשים גם יש לקחת בחשבוןבכל ניסויי בקרה אלה. לדוגמה, אנו מאשרים כי DMSO, הממס לionophore, אין כל השפעה על Triton-X-100 לדוגמא רמות הקרינה (מידע לא מוצג). אנחנו גם לציין שאנחנו בחרנו את כל הפלסטיק ששמשו במחקר זה על שלא מכיל את משבש אנדוקריני ביספנול A, למרבה הצער, אם כי, כל הפלסטיק כיום בשוק מכיל כנראה לעשות קצת שיבוש פעילות ההורמונלית, אשר עלול לבלבל ⁶⁴ נתונים.

במקרה בו נדרש פתרון בעיות, כמה היבטים אפשריים של פרוטוקול זה צריכים להיבדק. לדוגמה, זה יכול להיות ש( 1) רמות שחרור ספונטניות הן גבוהות מדי (יותר מ ~ 7% מערכי תמוגה), (2) מנה תגובה עם או ממריץ ו / או כימי בדיקה לא הוא ציין, או (3) ריכוז TCS בפתרון הוא נמוך מדי (נמוך מ -20 מיקרומטר). במקרה הראשון, ברמה גבוהה ספונטנית יכולה להיות אינדיקציה של התאים להיות בתרבות ארוכה מדי או להיות מזוהמת עם Mycoplasma, ולכן, לנסות ניסויים אלה עם תאי RBL-2H3 שהיו בתרבות שבין 2-20 שבועות, ולבדוק באופן קבוע עבור Mycoplasma. אם תגובת מינון ממריץ לא הוא ציין, הריכוז המומס הממריץ עשוי להיות נמוך מדי, ומניות צריכה להיות נוצר מחדש. כדוגמה, ionophore סידן בדרך כלל מסופק כסרט דק, כדי לבנות מחדש עם DMSO, הדורש תשומת לב קפדנית והרבה vortexing. בנוסף, מניית ionophore חדשה עם מספר מאוד שונה יכולה להיות שונה עוצמה פשוט בגלל שונות הרבה להרבה, ולכן תגובת degranulation מינון מומלצת עם כל מנית ionophore החדש שרכשה. כמו כן, ראוי לציין כי חוסר לכאורה של אפקט עם בדיקה כימית נתון יכול להיות סימן לכך שכימיקל זה עשוי לדרוש תקופת דגירה ארוכה יותר על מנת לגרום להשפעה. אם אתה לא משיג את תשואה גבוהה TCS בפתרון, לבדוק שהטמפרטורה נשארה קבוע (50 ° C ± 5) בעוד שהגרגרים הם מתמוססים לתוך המאגר. Tהוא לא צריך מדחום לגעת בתחתית הבקבוק, עמדה שתגרום לאומדן יתר של הטמפרטורה של הפתרון. כמו כן, יש לוודא שקיים ערבוב נמרץ קבוע ושהספירה לאחור 90 דקות הוא לא התחילה עד שהטמפרטורה הגיעה ראשונה 50 ° C.

שולחן לפתרון בעיות.

כמו בכל ניסוי רעלים / פרמקולוגיה, כימי בדיקה לא חייב להיות גלוי רעיל בריכוזים שנבדקו. אנו ממליצים להשתמש בשיטות בדיקה שעבור שניהם אפופטוזיס ונימק, בנפרד או משולב (כגון עם מבחני clonogenic), כמו גם בדיקות לניזק כללי לקרום הפלזמה (כגון דליפת דהידרוגנז חומצת החלב). TCS, בריכוזים המוצגים במחקר זה, אינו רעיל לתאים לתאי RBL-2H3 ^2. שים לב במיוחד לדאגה עם מחקרי ionophore הוא שionophore תוספת ionophore רכב(DMSO הסביר), בתוספת כימית בדיקה, בתוספת כל ממסים אורגניים המשמשים, יכול להיות שעלול להיות רעיל לתאים לחלוט, אשר חייב להיות מבוקר בקפידה, כפי שנעשה בפאלמר et al. ²

הפרוטוקול שלנו להכנת פתרונות TCS ללא שימוש בממס אורגני יהיה שימושי לבדיקה טוקסיקולוגית נוספת של חומר כימי בכל מקום זה, ללא הפרעות של חפצי ממס, שיקול חשוב במיוחד בטוקסיקולוגיה המימית. שיטות אלה גם מאפשרות אימות של הריכוז של TCS בפתרון וכימות של ההשפעות שכימיקלים, כגון TCS, יש להם על degranulation תא תורן. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להעריך את ההשפעות של מגוון רחב של חומרים כימיים על degranulation תא התורן, כגון האנדוקרינית חשד לשבש כימיקלים ^55, ובאופן פוטנציאלי יכול להיות מדורגים עד להקרנת תפוקה גבוהה. בנוסף, סוגי תאי פיטום אחרים עשויים לשמש בassay זה בעבודה בעתיד.

יש לנו מה למסור.

LMW וRHK נתמכים על ידי בית הספר למוסמכים של UMaine של מדע והנדסה (GSBSE) ביו רפואית; RHK נתמכה גם על ידי החקלאית מיין ותחנת ניסוי יער. מימון נוסף מסופק על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה כללי (NIH P20-GM103423), מיין והחקלאי תחנת ניסוי יער (גרנט מספר ME08004-10, פצ"ר), אוניברסיטת ADVANCE מיין Rising Tide מרכז (NSF גרנט # 1,008,498) , ומענק מחקר Starter בפרמקולוגיה / טוקסיקולוגיה מן היסוד PhRMA (פצ"ר). אנו מודים בני הזוג. דוד Holowka וברברה ביירד לאנטיגן ותאים. אנו אסירי תודה לחינה Hashmi, אלחנדרו ולז, ואנדרו Abovian לעזרה עם ציוד והזמנות. זה מיין חקלאי & יער מספר פרסום תחנת ניסוי 3311.