والفحص صفيحة ميكروسكوبية لتقييم تأثيرات المواد الكيماوية على RBL-2H3 الصاري تحبب الخلايا: آثار التريكلوسان بدون استخدام مذيب عضوي

تحبب الخلايا البدينة، والإفراج عن وسطاء حساسية، والمهم في الحساسية، والربو، والدفاع الطفيلي. نحن هنا لشرح تقنيات ¹ لتقييم آثار المخدرات والمواد السامة على تحبب، المنهجية المستخدمة مؤخرا لإظهار تأثير مثبط قوي من وكيل مضاد للجراثيم التريكلوسان ^2.

الخلايا البدينة تلعب دورا هاما في أمراض الحساسية والمناعة ضد الطفيليات الدفاع. تنشيط مرة واحدة (مثلا عن طريق مثيرة للحساسية)، فإنها degranulate، وهي العملية التي ينتج إيماس من الوسطاء حساسية. التشكيل من تحبب الخلايا البدينة من المخدرات والمواد السامة قد يكون لها آثار إيجابية أو سلبية على صحة الإنسان. وقد تم تشريح وظيفة الخلايا البدينة بالتفصيل مع استخدام مستقعد الخلايا البدينة سرطان الدم الفئران (RBL-2H3)، وهو النموذج المقبول على نطاق واسع من الإنسان الخلايا البدينة المخاطية ^3-5. يمكن بسهولة وبشكل موثوق أن تقاس الصاري مكون الخلية الحبيبية والوسيط حساسية β-هيكسوزامينيداز، التي يتم تحريرها خطيا جنبا إلى جنب مع الهيستامين من الخلايا البدينة ^6، من خلال رد الفعل مع ركيزة الفلورة، مما أسفر عن كثافة مضان قابلة للقياس في فحص صفيحة ميكروسكوبية التي هي قابلة لل دراسات عالية الإنتاجية ^1. نشرت أصلا من قبل نعال وآخرون. ^1، ونحن قد تكيفت هذه مقايسة تحبب لفحص سالأدوية و المواد السامة والتظاهر واستخدامه هنا.

التريكلوسان هي وكيل واسع الطيف مضاد للجراثيم التي هي موجودة في كثير من المنتجات الاستهلاكية وعثر عليها لتكون المساعدات العلاجية في الإنسان مرض حساسية الجلد ^7-11، على الرغم من أن آلية هذا التأثير غير معروف. هنا علينا أن نظهر مقايسة للتأثير على التريكلوسان تحبب الخلايا البدينة. أظهرنا مؤخرا أن التريكلوسان يؤثر بقوة ظيفة الخلايا البدينة ^2. في محاولة لتجنب استخدام مذيب عضوي، يذوب التريكلوسان مباشرة إلى المخزن المؤقت مائي مع الحرارة والتحريك، وتأكيد تركيز الناتجة باستخدام القياس الطيفي للأشعة فوق البنفسجية فيس (باستخدام ε ₂₈₀ = 4،200 L / M / سم) ^12. هذا البروتوكول لديه القدرة على أن تستخدم مع مجموعة متنوعة من المواد الكيميائية لتحديد آثارها على تحبب الخلايا البدينة، وعلى نطاق أوسع، إمكاناتهم حساسية.

الخلايا البدينة وحبيبات غاية الخلايا المناعية المستجيب أن تكون بمثابة الوسطاء الرئيسيين في الربو، والحساسية، والطفيليات الدفاع والتسرطن ^13-16. يقيمون في ما يقرب من كل الأنسجة أوعية دموية ^15، حيث تخزن بشكل آمن وسطاء حساسية والتهابات في حبيبات هيولية حتى المنشط لdegranulate. تحبب هو إيماس من حبيبات غشاء محدد، مما يؤدي إلى إطلاق وسطاء الصيدلانية الفعالة مثل الهستامين، تريبتاز، و leukotrienes ^15. هذه النتائج العملية في الشروع في النوع الأول من تفاعلات فرط الحساسية التي تعتبر بالغة الأهمية في تصاعد الدفاع ضد الطفيليات وكذلك الشروع في استجابات حساسية، الربو، ومسببة للسرطان ^15.

الخلايا البدينة والخلايا القاعدية مستقبلات FcεRI، المستقبلات عالية تقارب لالغلوبولين المناعي E (إيج) ^17. التعرض لمسببات الحساسية أو مستضد يسبب تجميع عدة مستقبلات FcεRI فريق الخبراء الحكومي الدولي متجهة الى ^17، وهذا هو قس يسمى ب "يشابك" من مستقبلات القطعة Fc فريق الخبراء الحكومي الدولي متجهة الذي يبدأ عملية تحبب: سلسلة من الأحداث التيروزين الفسفرة، وتفعيل فسفوليباز C، هروب رأس المال من الكالسيوم من مخازن الداخلية، وتدفق الكالسيوم إلى داخل الخلية ^18. هذا التدفق الكالسيوم ضروري للتحبب، و، علاوة على ذلك، يشير الانصهار الحبيبية مع الغشاء قبل أن يتسببوا إيماس الحبيبية ^15. تجريبيا، وهو حامل الأيون الكالسيوم يمكن أن تستخدم لنقل الكالسيوم مباشرة عبر غشاء الخلية ^19، والذي يتجاوز أساسا عن نقل الإشارة الخطوات من قبل لتدفق الكالسيوم الخطوة ^20، والسماح لتحديد مسار هدفا بواسطة مادة سامة على أنها المنبع أو المصب الكالسيوم مما يشير ^20.

تحبب يمكن قياسها بسرعة وفعالية من خلال رصد إطلاق سراح β-هيكسوزامينيداز إلى طاف الخلية، والتي يتم تحريرها خطيا من حبيبات جنبا إلى جنب مع الهستامين ^6، ولكن أناأسهل بكثير للكشف عن رد فعل بسيط باستخدام انزيم الركيزة وقارئ صفيحة ميكروسكوبية لفحص المنتج الفلورسنت. ويستند هذا الاختبار صفيحة ميكروسكوبية، على النحو المفصل في قسم البروتوكول، بناء على وسيلة قوية ضعت أصلا من قبل نعال وآخرون. ^1، التي تقيس انشقاق الركيزة الفلورة 4-ميثيل مبيليفيريل-N-أسيتيل β-D-β-glucosaminide من قبل هيكسوزامينيداز. قمنا بتعديل مقايسة لاختبار آثار المخدرات والمواد السامة، مع تسليط الضوء التريكلوسان هنا. هذا الأسلوب الكمي موثوق تحبب، هو بديل رخيص الثمن، على سبيل المثال، تدفق طرق الكشف على أساس cytometric ^21، ولديه القدرة على تقديم نفسه بشكل جيد لفحص عالية الإنتاجية من مجموعة واسعة من الأدوية المضادة للحساسية، وكذلك جهاز المناعة أو المواد الكيميائية المسببة للحساسية. هذه النقطة الأخيرة لها أهميتها ولا سيما في ضوء لعام 2007 تقرير المجلس القومي للبحوث "اختبار السمية في القرن ^{الحادي و21:} رؤية وSTRATايجى "( http://www.nap.edu/openbook.php؟record_id=11970 )، الذي يدعو لتطوير اختبارات السموم عالية الإنتاجية التي تستخدم خلية ثقافة للحد من استخدام مكلفة من حيوانات المختبر التقليدية مثل الفئران. بروتوكول تحبب التي وضعتها نعال وآخرون. ¹ وتعديلها من قبلنا ^2، يستخدم خط الخلية RBL-2H3، الذي هو نموذج مقبولة تماما مثلي إلى الإنسان الخلايا البدينة المخاطية أو قعدات ^3-5. (ترد تفاصيل طرق لزراعة الخلايا RBL-2H3 في هاتشينسون وآخرون ^22). يمكن أن المرجح أن تتكيف هذا الاختبار إلى أي المرفقة نوع الخلايا البدينة.

التريكلوسان (TCS) هو المضادة للميكروبات واسعة الطيف التي تم استخدامها لأكثر من 30 عاما في المستشفيات، ومنتجات العناية الشخصية، والسلع الاستهلاكية ^23،24. طريقة عمل لخاصية مضادة للميكروبات TCS هو تثبيط الحيوي الدهنية حمض، من المحتمل عن طريق تثبيط enoyl-أسيلالناقل البروتين اختزال ^25،26. انها وجدت في جميع أنحاء العالم في مجموعة واسعة من المنتجات الاستهلاكية مثل هلام الاستحمام، وغسول اليد ومعجون الأسنان وغسول الفم، وفي صابون اليد بتركيزات تصل إلى 0.3٪ أو 10 ملم ^24. وقد أدى الاستخدام الواسع النطاق للTCS في المستويات التي يمكن اكتشافها في البشر ^و27-29 في الأنهار والجداول ^30. وهناك دراسة أجريت من قبل Allmyr وآخرون. أثبتت أن ²⁷ TCS وعناصره موجودة في كل من البلازما واللبن من أمهات المرضعات. الأهم من ذلك، يتم امتصاصه بسهولة TCS في الجلد ^31-37. Queckenberg وآخرون. وجد ³⁷ ~ 10٪ من امتصاص ~ 70 ملم TCS كريم في الجلد البشري في غضون 12 ساعة، مما أدى إلى تركيز كبير في الجلد، حيث تتواجد الخلايا البدينة.

وقد تبين TCS سريريا لإدارة الإنسان مرض حساسية الجلد ^7-11، ولكن كانت الآلية التي TCS يخفف من أمراض حساسية الجلد غير معروف ^38. باستخدام صفيحة ميكروسكوبية الفلورسنت وdetaile مقايسةد في هذا الفيديو، ونحن في الآونة الأخيرة أظهرت أن TCS، بتركيزات منخفضة تصل إلى 2 ميكرون، يخفف من حدة بشكل ملحوظ وظيفة الخلايا البدينة وتحبب، وتوفير تفسير محتمل لهذه البيانات السريرية ^2. وبالإضافة إلى تقديم تفسيرا لهذه المعطيات السريرية، النتائج التي توصلنا إليها في بالمر وآخرون. ² تشير إلى أن TCS تستهدف الجزيئات مما يشير المصب من تدفق الكالسيوم. ونظرا لأهمية الكالسيوم في العديد من إشارات المناعية والعمليات البيولوجية الأخرى، يمكن أن يكون TCS يحتمل أن تكون الآثار السلبية على تشكيلة واسعة من العمليات البيولوجية اللازمة. في الواقع، أظهرت Udoji وآخرون. TCS ³⁹ أن يقمع الخلايا القاتلة النشاط التحللي الإنسان الطبيعي، وظيفة المناعة الفطرية هامة أخرى.

خارج إمكاناته كأداة مساعدة العلاجية لمرض حساسية الجلد (أو، على العكس، باعتبارها immunotoxicant)، قد يكون TCS أيضا اضطرابات الغدد الصماء ^40-49. وهكذا، فإن إجراءات واضحة بشأن كيفية إعداد هذه المادة الكيميائية في حل طS من الفائدة لعلماء السموم. لأن TCS هو جزيء صغير مسعور، وغالبا ما تستخدم المركبات العضوية لجعله أكثر قابلية للذوبان في الماء. في معظم الدراسات السمية حيث تم اختبار TCS، وإعداد تشارك انحلال في الماء مع المعونة من المذيبات العضوية مثل الإيثانول، الأسيتون، أو زيت ^2،50،51. ومع ذلك، في كثير من الأحيان هذه المذيبات نشطة بيولوجيا أنفسهم، وبالتالي تعقيد تفسير المادة الكيميائية اختبار البيانات ^51. في الواقع، وفقا لRufli وآخرون. ⁵² و ⁵³ آخرين، فمن المستحسن أن حلول اختبار للتجارب السمية المائية يتم إعدادها باستخدام الطرق الفيزيائية على الطرق الكيميائية، ونظرا لإمكانات المذيبات الكيماوية لخلق التحف سمية. لقد أظهرنا سابقا أن TCS يذوب في الإيثانول بنسبة 0.24٪ / الماء (المجلد / المجلد) وsonicated لمدة 30 دقيقة يخفف من حدة RBL الصاري تحبب الخلية ^2. وقد تبين الإيثانول بتركيزات أعلى من 0.24٪ إلى تثبيط الخلايا البدينة إدناءnulation ^{54،55-أمثلة} على الآثار المحتملة التباس من المذيبات العضوية على دراسات سمية.

ليس فقط هو أنه من المهم أن تنظر في تأثير المذيبات على الكائن الحي أو الخلايا المستخدمة للدراسة، ولكن أيضا من المهم لرصد تأثير المذيبات الكيميائية على اختبار نفسه. على سبيل المثال، سكاري وآخرون. وجدت أن ⁵¹ في تذويب TCS البولي ايثيلين جلايكول (التي توجد عادة في معاجين الأسنان وغسول الفم) ضعفت تأثيرات مضادة للبكتيريا ومضادة للالترسبات في النساء أنثى صحي في حين حل في الزيوت تسبب في خسارة كاملة من وظيفة. ولذلك، فإن قدرة المذيبات المختلفة لتعدل السموم والمخدرات، بما في ذلك TCS، وينبغي النظر في الآثار في تصميم مقايسة. استخدام الزيوت أو المواد المضافة نكهة قد تتداخل مع آثار TCS في مختلف المنتجات ^50،51.

في محاولة للقضاء على الحاجة إلى استخدام المذيبات العضوية، ونحن تحسينها لدينا وسيلة لتذويب TCS ² من خلال القضاء على استخدام وسيلة سول العضويةتنفيس. في هذا البروتوكول، ونحن تذوب حبيبات TCS مباشرة إلى المخزن المؤقت مائي مع الحرارة (≤ 50 ° C)، ومن ثم تحقق من تركيز هذا المخزون TCS بواسطة القياس الطيفي للأشعة فوق البنفسجية فيس. هذه التحسينات ممكنة لأن TCS قابل للذوبان في الماء تصل إلى 40 ميكرومتر ( http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf ) ولقد ثبت على مقاومة التحلل عند تسخينها إلى 50 درجة مئوية ( http:// على / oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf ) ^56،57. لدينا أيضا فائدة إضافية تتمثل في القياس الطيفي للأشعة فوق البنفسجية فيس، كما TCS وكما هو معروف لاستيعاب بقوة 280 نيوتن متر في ⁵⁸ مع معامل الانقراض المولي من 4،200 L / مول / سم ^12.

هذا البروتوكول يوفر وسيلة بسيطة، لكنها فعالة لإذابة حبيبات TCS في منطقة عازلة من دون المعونة من المذيبات العضوية، بما في ذلك تكاليف منخفضة والتحقق السريعمن التركيز، ويصف قوية الفلورسنت فحص صفيحة ميكروسكوبية لرصد الآثار الكيميائية على تحبب الخلايا البدينة.

لاحظ أن جميع صفات العازلة مدرجة في جدول في نهاية النص البروتوكول.

DAY 1:

1. إعداد الخلايا

1. خطة من 96 جيدا مخطط الإعداد لوحة، وتتمحور عينات اختبار على التخطيط من أجل تجنب آثار الحافة. تخصيص ثلاثة مكررات لكل تركيز TCS المختبرة (± المنشطات تحبب من المستضد أو حامل الأيون)، فضلا عن ثلاث مكرارت لاطلاق سراح عفوية (لا تحبب المنشطة)، والحد الأقصى الافراج عن (0.2٪ تريتون X-100 [TX] تحلل المنظفات)، وكذلك آبار محفوظة لعينات الخلفية (والتي سوف تحتوي على أي خلايا). عن كل يوم التجريبية تكرار، واختيار تخطيط عشوائية جديدة لتركيزات عينة TCS.
2. وسائل الإعلام دافئ ربل (وصفة الواردة في الجدول) والتربسين في 37 ° C حمام الماء.
3. تحقق خلايا RBL في T-25 قارورة (2-4 أيام منذ مرور آخر وأقل من 3-4 أشهر منذ كانوا إذابة) للعلامات العامة للشفاء جيدةث: الرقم الهيدروجيني المناسب المشار إليها بواسطة اللون من وسائل الإعلام، وعدم وجود الغيوم. ضع قارورة تحت المجهر الخفيفة للتأكد من أن القارورة هي خالية من التلوث وأن الخلايا تظهر صحي، متموجة بشكل صحيح، وتعلق معظمها. لاحظ أن الخلايا يجب أن يتم التحقق من خلوه من التلوث الميكوبلازما تقريبا كل ستة أسابيع ^22.

انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

4. خذ قارورة خلية RBL في نسيج الثقافة العقيمة (TC) هود. هي التي تعلق على الخلايا إلى بوتتوم القارورة. تعمل تحت غطاء محرك السيارة TC وباستخدام تقنية معقمة القياسية، وإزالة جميع وسائل الإعلام من قارورة مع ماصة معقمة؛ تبقى الخلايا تعلق على الجزء السفلي من القارورة. المقبل، شطف قارورة مع 2 مل التربسين، ثم تجاهل هذا يغسل.
5. أضف بالضبط 2 مل التربسين لتغطية الجزء السفلي من القارورة. وضعت في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق للسماح للخلايا لفصل من الجزء السفلي من القارورة.
6. بعد 5 دقائق، وضرب الجانب من القارورة مع راحة اليد المفتوحة لتخفيف الخلايا. على الفور، إضافة 18 مل سائل الإعلام RBL لغسل الخلايا قبالة قارورة وإخماد التربسين. تتخذ على الفور خليط الخلية وسائل الإعلام، التربسين من القارورة ونقل إلى جديد، معقم 50 مل أنبوب (المجموع الكلي في هذا الأنبوب هو الآن 20 مل).
7. بعد خلط بلطف ولكن بدقة، وإزالة 50 ميكرولتر من تعليق خلية من هذا الأنبوب، ونقل إلى 1.5 مل العقيمة أنبوب microcentrifuge، والتي هي نموذج لفرزها. تأخذ هذه العينة، فضلا عن 50 مل0؛ الأنبوب الذي يحتوي على خليط الخلية وسائل الإعلام، التربسين من غطاء محرك السيارة TC إلى الفوق.
8. تدور في أنبوب مل 50 في أجهزة الطرد المركزي (مع التوازن المناسب) لمدة 8 دقائق في 500 XG؛ هذه القوة خلايا الكريات بشكل فعال.
9. خلال ذلك الوقت تدور، عد الخلايا في العينة التي تم عزلها قبل الغزل. للقيام بذلك، أولا إضافة 50 ميكرولتر من التريبان الأزرق صبغ إلى 50 ميكرولتر من الخلايا في أنبوب 1.5 مل، ولكن بلطف تماما ماصة صعودا وهبوطا 5X لخلط. على الفور، ونقل 10 ميكرولتر من هذا الخليط إلى عدادة الكريات الزجاجية، وتعول الخلايا في منطقة الشبكة باتباع إرشادات الشركة المصنعة. عد لا يقل عن 100 خلايا لنتائج إحصائية معقولة.
10. مرة أخرى في هود TC، وإزالة طاف من الخلايا التي تم نسج أسفل.
11. غطاء الأنبوب الخلية، ونفض الغبار بيليه في الجزء السفلي من أنبوب لتخفيف الخلايا.
12. اضف الوسائط إلى الخلايا trypsinized لتسفر عن كثافة من 0.5 × 10 ⁶ خلية / مل، استنادا إلى عدد خلايا.
13. تخلط جيدا ولكن برفق للحفاظ على الخلايا علقت أثناء إجراء الطلاء. باستخدام Pipetman، وضع 100 خلية ميكرولتر / جيد في لوحة 96 جيدا (شقة، أسفل أسود)، في أعقاب ورقة قالب لوحة. يضاف بطريقة عشوائية كيف يتم إضافة خلايا إلى الآبار لتجنب خطأ منهجي، والمزيج بعد كل مجموعة من ثلاثة آبار. تأكد من عدم وضع الخلايا في الآبار وصفت لعينات الخلفية.
14. مرة واحدة وقد تم نقل جميع الخلايا، ووضع لوحة غطاء على طبق، ونقل إلى الحاضنة (37 درجة مئوية / 5٪ CO ₂₎ بين عشية وضحاها. تنظيف بعد تقنية معقمة القياسية.

يوم 2:

2. إعداد التريكلوسان

1. باستخدام الاسطوانة، وقياس 250 مل Tyrodes العازلة (وصفة الواردة في الجدول) إلى 500 مل دورق مخروطي سعة المسمى "TCS-المخزن المؤقت." إضافة يحرك شريط. استخدام الأواني الزجاجية، وإثارة بار، ميزان الحرارة المعينة للاستخدام مع TCS فقط.
2. في هذا الوقت أيضا، وقياس 250Tyrodes مل إلى 500 مل منفصلة دورق مخروطي، المسمى "العازلة السيطرة." استخدام الأواني الزجاجية، وإثارة بار، ميزان الحرارة التي لم يتم تخصيصها لTCS. إضافة يحرك شريط.
3. تزن خارج 0.0022 غرام من حبيبات TCS ونقل إلى "TCS-العازلة" قارورة (الذي يحتوي على 250 مل Tyrodes الاحتياطي). من أجل نقل حبيبات بكفاءة إلى دورق مخروطي سعة، استخدم 10 مل من قياس 250 مل Tyrodes ليغسل وزن القارب، والتأكد تم تحويل جميع TCS.
4. مكان "TCS-العازلة" قارورة على مزيج موقد / لوحة تحريك مغناطيسي، وتعيينه لتحريك بسرعة عالية manageably. مرة واحدة جيدا مختلطة، سوف يكون هذا السهم TCS أبعاده 30 ميكرومتر (سيتم احتساب تركيز الفعلي بعد التسخين). (هل كل خلط في غطاء الدخان الكيميائية.)
   1. في هذا الوقت أيضا، وضع "السيطرة العازلة" قارورة (لا تحتوي على TCS) على موقد مزيج الثانية / لوحة تحريك مغناطيسي، وتعيينه لاثارة بسرعة مماثلة.
5. تشغيل مصباح الأشعة فوق البنفسجية / فيس عملية الاحماء المصباح لاستخدامها لاحقا.
6. تسخين "TCS-العازلة" الحل إلى 50 درجة مئوية مع التحريك باستمرار. مرة واحدة تصل إلى درجة الحرارة، والوقت لمدة 90 دقيقة. خلال 90 دقيقة، ومواصلة رصد 50 ° C درجة الحرارة وسرعة التحريك المناسبة في كثير من الأحيان.
   1. في وقت واحد، تسخين "السيطرة العازلة" الحل (الذي هو مجرد 250 مل من العازلة Tyrodes عادي) إلى 50 درجة مئوية مع التحريك المستمر. عند بلوغ 50 درجة مئوية، لمدة 90 دقيقة مرة، وخلالها درجة الحرارة الوقت (حفظ في 50 ° C) وإثارة على حد سواء رصدها.
7. في نهاية ال 90 دقيقة، واتخاذ كل قوارير مخروطي قبالة الأطباق الساخنة ونقل إلى الفوق.
8. باستخدام وظيفة المسح الضوئي الطول الموجي على مطياف الأشعة فوق البنفسجية / فيس، لم تحدد الجهاز في 1 مل من ساخنة "السيطرة العازلة" حل قبل المسح 1 مل من محلول ساخنة "TCS-العازلة". التحقق من الشكل من الطيف، وهود سجل قيمة الامتصاصية في 280 نانومتر. لتحديد تركيز، استخدم المعادلة بير لامبرت (A ₂₈₀ = ε ℓ ₂₈₀ ج) باستخدام ε ₂₈₀ من 4200 L / مول / سم ¹² وℓ من 1 سم.
9. بعد تحديد تركيز TCS، إضافة 0.249 ز ألبومين المصل البقري (BSA) إلى 249 مل المتبقية من الحل "TCS-المخزن المؤقت"، وتخلط جيدا.
   1. في وقت واحد، إضافة 0.249 ز BSA إلى 249 مل المتبقية من "السيطرة العازلة" حل، وتخلط جيدا.

يوم 2:

3. مستضد حفز الفحص تحبب باستخدام خلايا RBL-2H3

1. قبل البدء، والتحقق من الرقم الهيدروجيني للجميع المخازن المؤقتة المستخدمة، وضمان أن تكون واضحة وليس الحرارة: وهذا يشمل Tyrodes العازلة، العازلة خلات الصوديوم، وكربونات الجلايسين العازلة (الوصفات الواردة في الجدول).
2. وسائل الاعلام RBL دافئة والتربسين في 37 ° C حمام الماء.
3. جعل BT (1 ملغ / مل0؛ BSA في Tyrodes العازلة): 0.05 G BSA + 50 مل Tyrodes العازلة (X2). وضعت في 37 ° C حمام الماء.
4. جعل 0.2٪ تريتون X-100: 3.136 مل من BT + 64 ميكرولتر من 10٪ تريتون X-100 (تركيز النهائي من تريتون X-100 0.2٪). مزيج جيد من قبل انقلاب، ولكن لا الدوامة. وضعت في 37 ° C حمام الماء.
5. بدء إعداد TCS والعازلة Tyrodes ساخنة (خطوات "2" أعلاه) ملاحظة: لا تبدأ الخطوة التالية (التعرض إيج) حتى "TCS-العازلة" و "السيطرة العازلة" حلول تصل إلى 50 درجة مئوية، ويحرك المزيج لمدة والحد الأدنى 70 الأولى من 90 دقيقة الحرارة / التحريك الوقت.
6. مرة واحدة وقد أثار كل الحلول عند 50 درجة مئوية لمدة 70 دقيقة، ويشكلون 0.1 ميكروغرام / مل المضادة للDNP الماوس إيج (سيغما) في وسائل الإعلام ربل للآبار العينة أن تكون توعية (100 ميكرولتر / جيد). ينبغي الأسهم إيج لا يكون مضى عليها أكثر من 30 يوما عند تخزينها في 4 درجات مئوية؛ تسجيل كيفية القديمة السهم. نفض الغبار لخلط، ولكن لا إيج ليس دوامة.
7. تحت غطاء محرك السيارة TC،إضافة 0.6 ميكرولتر إيج الأوراق المالية (الأسهم هو 1 ملغ / مل) إلى 6 وسائل الإعلام مل RBL في أنبوب مل 50. في الثانية أنبوب مل 50، إضافة 6 مل من وسائل الاعلام ربل عادي فقط (الذي يهدف لعينات nonsensitized).
8. تفريغ جميع وسائل الإعلام من لوحة 96 جيدا (الذي أعد في يوم 1) في بالوعة، وتقديم لوحة تحت غطاء محرك السيارة TC.
9. عشوائيا إضافة 100 ميكرولتر وسائل الإعلام / إيج الخليط إلى الآبار التي ينبغي حفز (48 آبار الكل). ليس القصد من هذا الخليط لمدة "عفوية"، "TX"، وعينات "الخلفية".
10. عشوائيا إضافة 100 ميكرولتر سائل الإعلام ربل عادي فقط إلى "TX"، "عفوية"، و "" آبار الخلفية.
11. وضع لوحة غطاء على لوحة، ثم نقل لوحة إلى 5٪ CO _2/37 درجة مئوية الحاضنة لمدة 1 ساعة.
12. خلال 1 ساعة الحضانة، اتبع الخطوات 3،13-3،24.
13. على الفوق، وإعداد التخفيفات مستضد. إضافة 0.53 ميكرولتر من 1.6 ملغ / مل الأسهم DNP-BSA + 850 ميكرولتر & #160؛ BT للحصول على تركيز المستضد من 1 ميكروغرام / مل. دوامة وعكس هذا المخزون لخلط.
14. مرة واحدة "TCS-العازلة" و "المخزن المؤقت السيطرة" تم تسخينه ثم يحرك لمدة 90 دقيقة عند 50 درجة مئوية، وعلى تواصل مع بقية التحضير لبروتوكول TCS (اذهب إلى الخطوات 2.6 - 2.8.1). بعد حل جيش صرب البوسنة في كل من حلول، تواصل أدناه.
15. البدء في إعداد المخازن المؤقتة التعرض، مع ± حج، ± TCS. أولا، من عينة مل 249 من الحل "TCS-العازلة" (التي سبق تسخينها ثم يحرك لمدة 90 دقيقة)، ونقل 50 مل إلى 50 مل أنبوب جديد المخروطية. إزالة 20 ميكرولتر من هذه قسامة مل 50 واستبدالها مع 20 ميكرولتر من 1 ميكروغرام / مل مستضد أعدت في وقت سابق لتركيز المستضد النهائي من 0.0004 ميكروغرام / مل DNP-BSA. وعكس دوامة.
    1. تسمية هذا "أنبوب 1، وارتفاع TCS / + حج / + BT." وهو يستخدم لالتخفيفات وأعلى تركيز التعرض TCS.
16. من العينة مل 249 "السيطرة العازلة" حل، ونقل 50 مل إلى 50 مل أنبوب جديد. إزالة 20 ميكرولتر من هذه قسامة 50 مل جديدة واستبدالها مع 20 ميكرولتر من 1 ميكروغرام / مل مستضد أعدت في وقت سابق لتركيز المستضد النهائي من 0.0004 ميكروغرام / مل DNP-BSA. وعكس دوامة.
    1. تسمية هذا "الأنبوب 2، لا TCS / + حج / + BT". تستخدم لالتخفيفات TCS و 0 ميكرومتر التعرض تركيز TCS.
17. الآن تأخذ بها 50 مل من محلول "TCS-العازلة" ووضعها في أنبوب 50 مل أخرى. إزالة 20 ميكرولتر من هذا الجديد قسامة 50 مل واستبدالها مع 20 ميكرولتر من عادي BT. وعكس دوامة. يتم إضافة أي مستضد.
    1. تسمية هذا "الأنبوب 3، وارتفاع TCS / لا حج / + BT." ويستخدم هذا لخلفية.
18. نقل 50 مل من "السيطرة العازلة" حل لأنبوب 50 مل أخرى. إخراج 20 ميكرولتر من هذا NE ث قسامة 50 مل واستبدالها مع 20 ميكرولتر من عادي BT. وعكس دوامة. (يتم إضافة أي AG.)
    1. تسمية هذا "أنبوب 4، لا TCS / لا حج / + BT." ويستخدم هذا لخلفية وعينات عفوية.

	BSA	TCS	مولد المضاد
أنبوب 1		عالية []
أنبوب 2		NO
أنبوب 3	/ files/ftp_upload/50671/check.jpg "العرض =" 15px "/>	عالية []	NO
أنبوب 4		NO	NO

19. حساب وتسجيل وحدات التخزين للالتخفيفات بعد تحديد تركيز الأسهم "TCS-العازلة". السعة الإجمالية لكل تركيز التخفيف يجب أن تكون 1 مل، وينبغي أن تكون مستعدة في أنبوب microcentrifuge العقيمة. استخدام P2 معايرة وP1000 Pipetman.

20. بعد 1 ساعة إيج الحضانة، واتخاذ لوحة للخروج من الحاضنة وإرم كل وسائل الاعلام الى بالوعة. (ملاحظة: إذا وتعرف المواد الكيميائية اختبار لتكون أكثر سمية من المنتجات الاستهلاكية TCS، قد يكون من الضروري التخلص من النفايات الخطرة.)
21. باستخدام Combitip، وغسل الخلايا عشوائيا في لوحة 96 جيدا مع BSA-Tyrodes العازلة (200ميكرولتر / جيد). الافراج عن غسل العازلة على الجانبين من الآبار، وليس مباشرة على الخلايا المرفقة، من أجل تجنب إزعاج الخلايا المرفقة. تكرار هذه العملية مرة ثانية.
22. لإعداد علاجات للتطبيق، وعكس دوامة التخفيفات الحق قبل بالإضافة إلى لوحة.
23. بدءا من القسم العلوي من لوحة: إضافة ثلاث مكرارت بشكل عشوائي من 200 ميكرولتر من كل الحلول المستضد (مع تركيزات الصحيح من TCS) إلى الآبار المقابلة. الاستمرار في الجزء السفلي من لوحة. أضف "السيطرة العازلة" حل زائد AG (من "الأنبوب 2" أعلاه) للجميع "يسخر" على لوحة.
24. إضافة 200 ميكرولتر من الحلول المناسبة لآبار المقابلة:
    1. إضافة 200 ميكرولتر من 0.2٪ تريتون X-100 بئرا ل"TX" المعين.
    2. المقبل، إضافة 200 ميكرولتر من أنبوب 3 إلى 3 آبار المسمى "الخلفية (BkgD) اعلى TCS" على لوحة.
    3. أخيرا، إضافة 200 ميكرولترمن أنبوب 4-6 الآبار المسمى "العفوي".
25. احتضان لوحة لمدة 1 ساعة في 37 ° C / 5٪ CO _2.
26. خلال 1 ساعة الحضانة: الحصول على دلوين من الجليد (واحد لوحة "القديمة" في الحاضنة واحدة لوحة جديدة). ذوبان الجليد 4-ميثيل مبيليفيريل-N-أسيتيل بيتا-D-glucosaminide (4-MU) في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 40 دقيقة، مع الأخذ في احباط لأنها خفيفة حساسة.
    1. مرة واحدة 4-MU يتم إذابة الأوراق المالية، ويشكلون 4-MU حل العاملة: 150 ميكرولتر الأسهم + 14.85 مل من العازلة خلات الباردة (وصفة الواردة في الجدول)؛ دوامة وعكس. نضع في 50 مل أنبوب الطرد المركزي، ملفوفة في احباط، وعلى الجليد حتى الاستخدام.
    2. باستخدام Combitip، إضافة عشوائيا 100 ميكرولتر الباردة حل العاملة 4-MU في الجزء السفلي جدا من كل بئر من جديد جرينير أسود لوحة 96 جيدا (على دلو الجليد # 2). بدء تشغيل أول بإضافة حل العاملة عشوائيا داخل الجزء العلوي من لوحة، وبشكل عشوائي داخل الجزء السفلي من لوحة، وبشكل عشوائي داخل تريتون X-100 بئر،وأخيرا عشوائيا داخل الآبار الخلفية.
    3. الخروج من مربع جديد P200 نصائح للخطوة التالية.
27. في نهاية 1 ساعة الحضانة، ووضع لوحة خلية من الحاضنة على دلو الجليد # 1، ماصة طاف صعودا وهبوطا 4-5X (بلطف، وليس إدخال فقاعات)، والذهاب حول البئر لخلط جيد ولكن ليس لمس الخلايا في حين خلط . منهجي، واخراج 25 عينة ميكرولتر من كل بئر ومكان في لوحة جديدة مع الركيزة (نفس ترتيب العينات، كما كان مقررا أصلا). ماصة صعودا وهبوطا لخلط العينة جيدا عندما تكون في البئر الجديد، دون إدخال فقاعات.
28. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية / 5٪ CO _2.
29. بعد 30 دقيقة الحضانة، إضافة عشوائيا 200 ميكرولتر من العازلة الباردة الجلايسين-كربونات لكل بئر (باستخدام Combitip) لملء الآبار يصل إلى 325 مجموع ميكرولتر. (جعل هذا بالإضافة إلى تريتون X-100 عينة الماضي، لتجنب تريتون X-100 غير المباشرة). التحقق من وجود الفقاعات قبل لوحة القراءة (كزة مع نظيفة P10 الماصةالشركة المصرية للاتصالات تلميح لموسيقى البوب ​​أي فقاعات).
30. تشغيل لوحة في قارئ لوحة مضان (اذهب إلى القسم 4).

يوم 2:

4. فلوري تعليمات قارئ لوحة وتحليل البيانات

1. فتح Gen5 البرنامج، والباب مفتوح التجربة.
2. بدوره على قارئ لوحة وإدراج لوحة (الزاوية اليسرى العليا هو A1).
3. بروتوكول إجراء قراءة لمجموعة قراءات مخصصة. لا تضيف أي شيء عن العينات، يعيد، وما إلى ذلك، من أجل جمع البيانات مضان الخام من كل بئر.
4. تحت عنوان "اقرأ" اختيار "مضان"، "نقطة النهاية"، "سرعة عادية"، "كسب 40"، "الإثارة 360/40"، "الانبعاثات 460/40"، موقف للبصريات: أعلى 50٪. أعلى البصرية الأوفست: 7Mم. لا اهتزاز، لا تأخير، لا حركية، لا مراقبة جيدا، ودرجة الحرارة: حاضنة قبالة.
5. اختيار أسفل أسود مسطح، لوحة 96 جيدا (96 جرينير جيدا، مسطحة القاع).
6. التعامل مع تخطيط لوحة: بروتوكول تخطيط لوحة. إعداد العينات دون الإشارة يكرر، التخفيفات، الخ
7. لوحة قراءة.
8. حفظ الملف: انقر على "إكسل" زر، والذي سيقوم بتصدير ملف البيانات إلى Excel. القيام بذلك لوحة تخطيط وللمصفوفة. حفظ الملف على الكمبيوتر وعلى محرك أقراص USB.
9. في Excel، طرح متوسط ​​القراءة الخلفية من كل عينة، بما في ذلك تريتون X-100 بئر.
10. حساب٪ تحبب النسبي بقسمة كل قيمة (بالفعل بعد أن كان طرح الخلفية) من متوسط ​​تريتون X-100 قيمة، ثم ضرب من قبل 100 لجعله مئوية.
11. متوسط ​​كل ثلاث مكرارت، وحساب الانحراف المعياري. بيانات الرسم البياني في إكسل كما تعني القيم ± الانحراف المعياري. لاختبار إحصائي، ننتقل الآن إلى برنامج بريزم بواسطة GraphPad.

يوم 2:

5. حفز حامل الأيون الفحص تحبب باستخدام خلايا RBL-2H3

1. اتبع بروتوكول ل "إعداد الخلايا" (القسم 1، يوم 1) و "إعداد التريكلوسان" (القسم 2، يوم 2)، وفقا للتعليمات المذكورة أعلاه. يظهر المثال تخطيط لوحة لتحفيز حامل الأيون أدناه.

انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

2. قبل البدء، والتحقق من الرقم الهيدروجيني للجميع المخازن المؤقتة المستخدمة، وضمان أن تكون واضحة وليس الغائم. Tyrodes، العازلة خلات الصوديوم، وكربونات الجلايسين العازلة (الوصفات الواردة في الجدول).
3. إعداد واحد أنبوب مخروطي 50 مل من BT بإضافة 0.05 ز BSA إلى 50 مل tyrodes العازلة وقبل vortexing لتخلط جيدا. احتضان في 37 ° C حمام الماء.
4. جعل 0.2٪ تريتون X-100 مع 0.0032٪ DMSO (الكالسيوم تركيز مركبة حامل الأيون النهائي) وذلك بإضافة 96 ميكرولتر من 10٪ تريتون X-100-4،704 مل BT. تخلط جيدا. المقبل، واخراج 0.155 ميكرولتر من هذا الحل وتجاهل. الآن إضافة مرة أخرى في 0.155 ميكرولتر من 100٪ DMSO.
5. إعداد المخزون مم 5 (2.5 ملغ / مل) من A23187 حامل الأيون من مسحوق عن طريق إضافة 400 ميكرولتر من الطازجة 100٪ DMSO في قارورة حامل الأيون وvortexing للخلط. مرة واحدة في الحل،نقل إلى أنبوب مخروطي 1.5 مل، محتويات السجل وتاريخ اليوم وانتهاء (3 أشهر من التحضير عند تخزينها بشكل صحيح عند درجة حرارة -20 درجة مئوية).
   1. بدلا من ذلك، إذا باستخدام الأسهم المجمدة اليوم، ذوبان الجليد على الجليد، والتحقق من أن ملي A23187 حامل الأيون 5 هو مختلط بشكل جيد وواضح. دوامة، ونفض الغبار، وعكس هذا السهم قبل استخدام. تاريخ سجل لإعداد ولوط # A23187 من هذا.
6. مرة واحدة "TCS-العازلة" و "المخزن المؤقت السيطرة" تم تسخينه ثم يحرك لمدة 90 دقيقة، وتستمر بقية استعدادا لTCS بروتوكول (اذهب إلى الخطوات 2.6-2.8.1). بعد BSA هو تمتزج جيدا في كل من حلول، متابعة الخطوات المتبقية البروتوكول.
7. من العينة مل 249 من الحل "TCS-المخزن المؤقت"، ونقل 50 مل إلى 50 مل أنبوب جديد المخروطية. إزالة 1.8 ميكرولتر من قسامة مل 50 وإضافة 1.8 ميكرولتر من 5 ملم الأسهم حامل الأيون. دوامة 3X لمدة 8 ثوانى وعكس 3X. تركيز حامل الأيون النهائي هو 180 نانومتر. لاحظ أن هذا التركيز من A23187 سوف تختلف تبعا لقوة الأوراق المالية، وأوصى A23187 حامل الأيون الاستجابة للجرعة لتحديد تركيز A23187 الذي يتسبب مستوى تحبب تقريبا الإفراج القصوى 20٪، والتي تم تحديدها على أنها noncytotoxic إلى RBL-2H3 الخلايا عن طريق فحص السمية الخلوية (انظر ^2).
   1. تسمية هذا "أنبوب 1، وارتفاع TCS / + حامل الأيون / + BT." مستعملة للالتخفيفات وأعلى تركيز التعرض TCS.
8. من العينة مل 249 "السيطرة العازلة" حل، ونقل 50 مل إلى 50 مل أنبوب جديد المخروطية. واخراج 1.8 ميكرولتر من قسامة مل 50 وإضافة إلى الوراء في 1.8 ميكرولتر من 5 ملم الأسهم حامل الأيون. دوامة 3X لمدة 8 ثوانى وعكس 3X. تركيز حامل الأيون النهائي هو 180 نانومتر.
   1. تسمية هذا "الأنبوب 2، لا TCS / + حامل الأيون / + BT." ويستخدم هذا لالتخفيفات و 0 ميكرومتر تركيزات TCS.
9. من العينة مل 249 من R 20؛ TCS-العازلة "حل، ونقل 50 مل إلى 50 مل أنبوب جديد المخروطية. واخراج 1.8 ميكرولتر من جديد 50 مل قسامة وإضافة 1.8 ميكرولتر من 100٪ DMSO. عدم إضافة أية حامل الأيون؛ دوامة 3X لمدة 8 ثوانى وعكس 3X.
   1. تسمية هذا "الأنبوب 3، وارتفاع TCS / لا حامل الأيون / + BT / + DMSO"، وتستخدم للخلفية.
10. من العينة مل 249 "السيطرة العازلة" حل، ونقل 50 مل إلى 50 مل أنبوب جديد المخروطية. واخراج 1.8 ميكرولتر من جديد 50 مل قسامة وإضافة 1.8 ميكرولتر من 100٪ DMSO. دوامة 3X لمدة 8 ثوانى وعكس 3X. يتم إضافة أي حامل الأيون.
    1. تسمية هذا "أنبوب 4، لا TCS / لا حامل الأيون / + BT / + DMSO"، وتستخدم للحصول على عينات الإفراج عفوية.

	BSA	TCS	حامل الأيون	وأضاف 100٪ DMSO
أنبوب 1	"SRC =" / files/ftp_upload/50671/check.jpg "العرض =" 15px "/>	عالية []		NO
أنبوب 2		NO		NO
أنبوب 3		عالية []	NO
أنبوب 4		NO	NO	إيك علامة "FO: محتوى العرض =" .1 في "SRC =" / files/ftp_upload/50671/check.jpg "العرض =" 15px "/>

11. حساب وتسجيل وحدات التخزين للالتخفيفات بعد تحديد تركيز الأسهم "TCS-العازلة". استخدام P2 معايرة وP1000 Pipetman. السعة الإجمالية لكل تركيز التخفيف يجب أن تكون 1 مل، ويجب أن يكون مستعدا في أنبوب microcentrifuge العقيمة:

12. تأخذ الخلايا مطلي أمس للخروج من الحاضنة، وفارغة وسائل الإعلام في بالوعة. باستخدام Combitip، وغسل الخلايا عشوائيا في لوحة 96 جيدا مع BT (200 ميكرولتر / جيد). تكرار غسل مرة ثانية.
13. لإعداد علاجات للتطبيق، وعكس دوامة التخفيفات الحق قبل بالإضافة إلى لوحة. بدءا من القسم العلوي من لوحة: إضافة ثلاث مكرارت بشكل عشوائي من 200 ميكرولتر كل من التركيز الصحيح من TCS إلى corresponding جيدا. الاستمرار في الجزء السفلي من لوحة. أضف "السيطرة العازلة" حل زائد A23187 (من "الأنبوب 2" أعلاه) للجميع "يسخر" على لوحة.
14. إضافة 200 ميكرولتر من الحلول المناسبة لآبار المقابلة:
    1. إضافة 200 ميكرولتر من 0.2٪ تريتون X-100 بئرا ل"TX" المعين.
    2. المقبل، إضافة 200 ميكرولتر من أنبوب 3 إلى 3 آبار المسمى "الخلفية (BkgD) اعلى TCS" على لوحة.
    3. أخيرا، إضافة 200 ميكرولتر من أنبوب 4 إلى ستة آبار المسمى "العفوي".
15. احتضان لوحة لمدة 1 ساعة في 37 ° C / 5٪ CO _2.
16. خلال 1 ساعة الحضانة: الحصول على دلوين من الجليد (واحد لوحة "القديمة" في الحاضنة واحدة لوحة جديدة). ذوبان الجليد 4-ميثيل مبيليفيريل-N-أسيتيل بيتا-D-glucosaminide (4-MU) في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 40 دقيقة، مع الأخذ في احباط لأنها خفيفة حساسة.
    1. مرة واحدة 4-MU يتم إذابة الأوراق المالية، ويشكلون 4-MU العمل solutiعلى: 150 ميكرولتر الأسهم + 14.85 مل من العازلة خلات الباردة (وصفة الواردة في الجدول)؛ دوامة وعكس. نضع في 50 مل أنبوب الطرد المركزي، ملفوفة في احباط، وعلى الجليد حتى الاستخدام.
    2. باستخدام Combitip، إضافة عشوائيا 100 ميكرولتر الباردة حل العاملة 4-MU في الجزء السفلي جدا من كل بئر من جديد جرينير أسود لوحة 96 جيدا (على دلو الجليد # 2): تبدأ أولا بإضافة حل العاملة عشوائيا داخل الجزء العلوي من لوحة، وبشكل عشوائي داخل الجزء السفلي من لوحة، وبشكل عشوائي داخل تريتون X-100 بئرا، وأخيرا عشوائيا داخل الآبار الخلفية.
    3. الخروج من مربع جديد P200 نصائح للخطوة التالية.
17. في نهاية 1 ساعة الحضانة، ووضع لوحة خلية من الحاضنة على دلو الجليد # 1، ماصة طاف صعودا وهبوطا 4-5X (بلطف، وليس إدخال فقاعات)، والذهاب حول البئر لخلط جيد ولكن ليس لمس الخلايا في حين خلط . منهجي، واخراج 25 عينة ميكرولتر من كل بئر ومكان في لوحة جديدة مع الركيزة (نفس ترتيب SAmples، كما كان مقررا أصلا). ماصة صعودا وهبوطا لخلط العينة جيدا عندما تكون في البئر الجديد، دون إدخال فقاعات.
18. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية / 5٪ CO _2.
19. بعد 30 دقيقة الحضانة، إضافة عشوائيا 200 ميكرولتر العازلة الباردة الجلايسين-كربونات لكل بئر (باستخدام Combitip) لملء الآبار يصل إلى 325 مجموع ميكرولتر (جعل هذا بالإضافة إلى تريتون X-100 عينة الماضي، لتجنب تريتون X-100 غير المباشرة). التحقق من وجود الفقاعات قبل لوحة القراءة (كزة مع نظيفة P10 ماصة لموسيقى البوب ​​أي فقاعات).
20. تشغيل لوحة في قارئ لوحة مضان (اتبع كافة الخطوات في القسم 4).

عند تسخينها إلى 50 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة، وطيف الامتصاص للأشعة فوق البنفسجية فيس TCS لتنتج، منحنى قوي السلس بين ~ 260 و 300 نانومتر، مع ذروة عند 280 نانومتر، كما هو مبين في الشكل 1. القياس الطيفي للأشعة فوق البنفسجية فيس هو، بالتالي، أداة هامة التي يمكن استخدامها لحساب تركيز، لأن معامل الامتصاص المولي نشرت في 280 نانومتر هو 4،200 L / مول / سم ^12. لقد وجدنا أن TCS لا تسقط من حل خلال الإطار الزمني للتجربة تحبب كامل، في أعقاب 50 ° C التدفئة (لا تظهر البيانات).

بعد استخدام هذا الأسلوب التدفئة إلى حل TCS مباشرة إلى المخزن المؤقت مائي، درسنا تأثير TCS على تحبب الخلايا البدينة باستخدام مقايسة مضان القائم الذي تم الأمثل من نعال وآخرون. ¹ هذا الاختبار يسجل مستوى β-هيكسوزامينيداز صدر من الصاري الخلايا بعد الحضانة لمدة ساعة عن طريق الكشف عن منتج الركيزة الفلورة. سواء حفز لdegranulate من قبل إدارة التخطيط الوطني-BSA مستضد (الشكل 2) أو حامل الأيون الكالسيوم A23187 (الشكل 3)، ويمكن للمرء أن يرى بوضوح أن TCS يؤدي إلى تثبيط جرعة استجابة كبيرة من الإفراج عن β-هيكسوزامينيداز (أي تحبب).

الرقم 2 هو ممثل النتائج التي تم الحصول عليها للخلايا RBL إيج-توعيتهم، والتي حضنت لمدة 1 ساعة في "TCS-المخزن المؤقت" أو "عازلة السيطرة،" ويتعرض لجرعة المستضد DNP-BSA من 0.0004 ميكروغرام / مل. هذا تركيز DNP-BSA أثارت بمتوسط ​​استجابة تحبب المطلقة من 22.5٪ ± 0.1 (يعني ± الانحراف المعياري) في غياب TCS. بدأت تثبيط ذات دلالة إحصائية من تحبب في 5 ميكرومتر، حيث كانت مستويات تحبب 0.79 أضعاف ± 0.05 (يعني ± SD) من 0 مستويات الرقابة TCS ميكرومتر. كما يزيد تركيز TCS، وهناك تأثير مثبط أكبر من TCS، والتي تبين وجود علاقة قوية الاستجابة للجرعة. TCS، في 20 ميكرومتر، almosر يلغي تماما استجابة تحبب، إلى مستويات متساوية تقريبا إلى تحبب عفوية (حيث لا المستضد موجودا). وبشكل عام، يظهر هذا الرقم تثبيط قوية من متعددي مستضد حفز تحبب الخلايا البدينة بسبب المتحقق من تركيز TCS، من دون استخدام المذيبات العضوية.

في الشكل (3)، وكان يستخدم الكالسيوم حامل الأيون A23187 كوسيلة للتحقيق في آلية TCS التي يسببها الملطف للتحبب الخلايا البدينة في ربل. يستخدم A23187 باعتبارها المنشطات بديلة لأنه يتجاوز يشابك FcεRI وغيرها من الأحداث يشير المنبع من تدفق الكالسيوم، ولكن لا يزال يسبب تحبب. وحضنت الخلايا البدينة RBL لمدة 1 ساعة في "TCS-المخزن المؤقت" أو "عازلة السيطرة" التي تحتوي على جرعة الكالسيوم حامل الأيون من 180 نانومتر. في غياب TCS، وهذا تركيز A23187 أثارت بمعدل استجابة تحبب المطلقة من 25.1٪ ± 4.7 (يعني ± الانحراف المعياري). وكان تثبيط تحببوجدت مع اقل من 1 ميكرومتر TCS (0.63 ± 0.11 [يعني ± SD]). كما يزيد من تركيز TCS، حتى لا شدة تثبيط: في 5 ميكرومتر، 0.21 ± 0.04 أضعاف من مستويات الرقابة TCS 0 ميكرومتر؛ في 10 ميكرون، 0.09 ± 0.05، وفي 15 ميكرومتر، 0.077 ± 0.006، وعلى 20 ميكرومتر ، 0.09 ± 0.02 (وسائل ± SD). في الواقع، من 5 ميكرومتر وتركيزات أعلى من TCS، تم العثور على مستويات تحبب A23187 التي يسببها ليكون بالقرب من مستوى التحكم التلقائي (حيث لا A23187 موجودا على الإطلاق). وعموما، الشكل (3)، في تركيبة مع الشكل 2، يشير إلى أن الأحداث الجزيئية التي تستهدفها TCS هي المصب المحتملة لتدفق الكالسيوم.

الشكل 1: الممثل TCS أشعة فوق البنفسجية فيس الطيف الامتصاصية TCS لديه البازلاء قويةك في 280 نانومتر، مما يسمح بسهولة تحديد من A _280، وكذلك إتاحة القدرة على استخدام معامل الانقراض المولي من 4،200 L / مول / سم ¹² لتحديد تركيز الفعلي للTCS الذائبة في tyrodes العازلة. الخط الأصفر يشير إلى ذروة عند 280 نانومتر. في هذا المثال، قيمة الامتصاصية في 280 نانومتر هو 0.11876، مما يدل على تركيز TCS من 28.28 ميكرومتر. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

وصفت استجابة تحبب ممثل ال IgE-توعية الخلايا البدينة RBL تتعرض ل0.0004 ميكروغرام / مل BSA-DNP مستضد وTCS (0-20 ميكرومتر) قيمة الإفراج عفوية (لا مستضد الوقت الحاضر) للرجوع اليها: الشكل 2. تمثل القيم يعني7؛ الانحراف المعياري لعينات ثلاث نسخ. كما وردت، تم تطبيع البيانات لمراقبة (0 ميكرومتر TCS)، وكانوا مصممين فروق ذات دلالة إحصائية في مجال البرمجيات بريزم مع ANOVA في اتجاه واحد يليه آخر مخصص لاختبار توكي (مقارنات إلى 0.001 ميكرومتر TCS متوسط ​​الاستجابة). ويمثل أهمية التي كتبها *** P <0.001. انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

الشكل (3): استجابة تحبب الخلايا البدينة ممثل RBL حفز مع 180 نيوتن متر A23187 حامل الأيون الكالسيوم في وجود TCS (0-20 ميكرون) عينة الإفراج عفوية (لا حامل الأيون الوقت الحاضر) وصفت لتكون مرجعا. القيم تمثل يعني ± الانحراف المعياري لعينات ثلاث نسخ. كما presenteد، يتم تطبيع البيانات لمراقبة (0 ميكرومتر TCS)، وكانوا مصممين فروق ذات دلالة إحصائية في مجال البرمجيات بريزم مع ANOVA في اتجاه واحد يليه آخر مخصص لاختبار توكي (مقارنات إلى 0.001 ميكرومتر TCS متوسط ​​الاستجابة). ويمثل أهمية التي كتبها *** P <0.001؛ ** P <0.01. انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

في عام 2004، نعال وآخرون. ¹ وضع جهاز الاستشعار البيولوجي الخلايا البدينة للاختبار عالية الإنتاجية من تحبب. وهو فحص القوية التي تكيفنا للدراسات TCS لدينا ومفصلة في هذا الفيديو. قبل نعال وآخرون. ¹ الفحص، تحبب الخلايا البدينة قد تم تقييمها بشكل روتيني عبر β-هيكسوزامينيداز ^59-61، ولكن هذه الأساليب في وقت مبكر تستخدم fluorometers الذي كان يقرأ عينة واحدة في وقت واحد. الأهم من ذلك، نعال وآخرون. التوافق المباشرة المقامة بين أكثر طريقتهم الإنتاجية العالية وذلك باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية وطريقة في وقت سابق التي كانت تقرأ عينات-AT-A لمرة واحدة في التألق. وخلاصة القول، نعال وآخرون. ¹ إلى تحسن كبير في السرعة والقوة والبساطة والموثوقية للمقايسة من قبل تكييفه مع منصة صفيحة ميكروسكوبية عالية الإنتاجية، وكذلك من خلال دمج عدة تغييرات على سير العمل. هنا، لدينا المزيد من تكييفها هذا الاختبار لدراسة المواد الكيميائية اختبار مختلف، على وجه الخصوص، هناوTCS المخدرات في كل مكان. تفاصيل الفيديو الخطوات من هذا الاختبار مفيد جدا. بالإضافة إلى ذلك، وضعنا أيضا وسيلة خالية من المذيبات العضوية للتطبيق TCS في المخزن مائي، ونحن نبين ذلك، إجراء بسيط منخفضة التكلفة للتحقق من تركيز TCS. وينبغي لهذه الأساليب أن تكون مفيدة إلى الميدان تزايد على ما يبدو من التريكلوسان علم السموم. في هذه المناقشة، ونحن من التفصيل اعتبارات عدة لاستخدام هذا الاختبار تحبب لاختبار المواد الكيميائية الأخرى كذلك.

وقد أعد TCS مباشرة إلى المخزن المؤقت مائي بدون مساعدة من المذيبات العضوية، وتم التحقق تركيز من قبل القياس الطيفي للأشعة فوق البنفسجية فيس (الشكل 1)، وبعد ذلك تم فحص تأثير TCS (<30 ميكرومتر) على تحبب الخلايا البدينة (الشكلان 2 و 3) ، وذلك باستخدام مقايسة صفيحة ميكروسكوبية مضان للكشف عن وجود β-هيكسوزامينيداز، علامة بديلة للتحبب. لقد وجدنا أن TCS هي قادرة على تخفيف كبير في الإفراج عن β-hexosaminidase من الخلايا البدينة RBL عندما يذوب في تركيز منخفض من الإيثانول (0.24٪ المجلد / المجلد) ² أو، كما هو مبين هنا، مباشرة إلى المخزن المؤقت مائي. بواسطة التخلي عن المذيبات العضوية، ونحن نرى في الواقع أكثر وضوحا الملطف في مستضد التي يسببها تحبب بالمقارنة دراساتنا في الذي تم حله في TCS 0.24٪ من الإيثانول (المجلد / المجلد). على سبيل المثال، لدينا هنا أظهرت> تخفيض 50٪ في تحبب مستضد التي يسببها (0.46 ± 0.07 أضعاف)، والتي هي أكبر بكثير من ~ تخفيض 25٪ أبلغنا عن 10 ميكرومتر TCS يذوب في الإيثانول بنسبة 0.24٪ (0.76 أضعاف ± 0.02) ^2. وفي نفس السياق، قررنا لخلايا A23187 حفز ذلك، بنسبة 5 ميكرومتر، TCS يمنع تحبب إلى مستويات الإفراج عفوية، وكان لم يثبت هذا التأثير حتى 10 ميكرومتر في TCS لدينا في وقت سابق، الإيثانول باستخدام والدراسة ^2. هناك نوعان من الأسباب المحتملة لهذا التناقض: إما 0.24٪ السيارة الايثانول ² خفف القدرة TCS لمنع سل نشطة الصاريكان ل تحبب، أو TCS كنا باستخدام أقل تركيزا مما كان متوقعا (نظرا لأن تركيزات لم يتم التحقق من قبل القياس الطيفي للأشعة فوق البنفسجية فيس في دراسة سابقة ^2). وفيما يتعلق الهدف الجزيئي لتثبيط TCS للتحبب الخلايا البدينة، فمن المحتمل حدوث في مكان ما في تتالي نقل الإشارة المصب من تدفق الكالسيوم ^2. كنا الكالسيوم حامل الأيون A23187 كمنشط تحبب لتجاوز الأحداث يشير في وقت مبكر، وتأثير TCS للالمثبطة لا تزال قائمة، مشيرا إلى أن المستهدف لTCS تثبيط في مسار تحبب ليس من المرجح يقع المنبع من تدفق الكالسيوم. لقد أظهرنا سابقا أن الإزعاج غشاء من هذه الخلايا ومنعها أيضا بسبب العلاج TCS، مما يشير إلى احتمال وجود هدف مشترك المسار ^2.

وقد وجدت الدراسات السابقة الطيف الامتصاصية من TCS وجود أقصى ذروة عند 280 نانومتر، وجرى تقييم لمعامل الامتصاص المولي لتكون 4200 L / مول / سم عند هذا wavelenGTH (في قيم درجة الحموضة أقل من PK _أ) ^12. وقد تبين أن تسخين TCS لا يؤدي إلى تدهور الحرارية ^57، وأظهرت دراسة أخرى من النجاح في حل TCS في الماء في حين يجري تسخينها إلى 50 درجة مئوية دون المعونة من المذيبات العضوية ^56. عندما يتم استخدام أي مادة كيميائية اختبار جديد، ذوبانه في المخزن المؤقت مائي، بطبيعة الحال، يجب أن تدرس بعناية. لقد وجدنا أيضا أنه عندما تسخين TCS، شكل قراءات الطيفية لا يتأثر ما إذا كان يتم تسخينها عن 40-90 دقيقة (لا تظهر البيانات)، وهذا يشير إلى وجود نقص في تدهور TCS عند تسخينها لفترة أطول من الوقت. نلاحظ، مع ذلك، أن حل TCS أكبر في 90 دقيقة من 40 دقيقة. لقد أكد أيضا أن TCS لا تسقط من حل للمدة التجربة تحبب (لا تظهر البيانات).

تم اختيار مستضد DNP-BSA وتركيزات الكالسيوم حامل الأيون المستخدمة في هذه الدراسة على أساس من مستضد وحامل الأيون جرعة المقايسات استجابة، وهووقد تم اختيار د لانتزاع مستويات معتدلة تحبب للأرقام ممثل 2 و 3. ويمكن رؤية مثال على مستضد جرعة فحص استجابة في الشكل 1A لدينا ² العمل السابق. عند تحديد تركيز المستضد أو حامل الأيون لاستخدامها في التجربة الخاصة بك، فمن المهم أن ندرك أن التجارب الاستجابة للجرعة المنشطة تحتاج إلى القيام به بشكل دوري، وعادة ما لا يقل عن مرة كل شهرين، منذ خلايا RBL-2H3 بعض الأحيان وظيفة بنسب مختلفة. تركيز يمكن أن ينتج نسبة تحبب المطلوب يمكن أن تختلف تبعا لعمر الخلايا وعلى إعداد مستضد / حامل الأيون. أيضا، كما رأينا مع الزرنيخ غير العضوي ^22، يمكن أن النسب المئوية تحبب المطلقة (مستويات المستضد المستخدمة) تؤثر على مستويات من آثار سمية على تحبب ربل، سمية ذلك يجب أن تتم بين الجرعة والاستجابة في عدة تركيزات مستضد / حامل الأيون مختلفة. ومن المهم أيضا أن تنظر في بغية دراسته واقراره النهائيntration من مركبة DMSO عندما تحفيز تحبب مع حامل الأيون، منذ يتأثر تحبب من قبل DMSO ^62. لقد تم العثور على تركيزات DMSO المستخدمة في هذا البروتوكول لا تؤثر تحبب، قراءات الخلفية، أو 0.2٪ تريتون X-100 القيم ^2.

بالإضافة إلى مستضد متعددي DNP-BSA وحامل الأيون الكالسيوم A23187، توجد عدة طرق أخرى لتحفيز RBL-2H3. واحد من هذه الأساليب هو التحفيز عن طريق التعرض لمركب 48/80 جنبا إلى جنب مع كيرسيتين ^63. آخر هو يشابك من المستقبلات إيج محددة مع مضاد للإيج مفتش، كما اختبرنا سابقا جنبا إلى جنب مع TCS التعرض ^2. توجد العديد من وسائل التحفيز الأخرى، ولكل من هذه الأساليب يتناول جانبا الآلية مختلفة من تحبب الخلايا البدينة. ويمكن تكييف هذه لوحة فحص قارئ للاستخدام مع العديد من هذه التحفيز والتشجيع البديلة، مواصلة توسيع فائدتها.

هذا البروتوكول تحبب لديه القدرة على أن تستخدم مع مجموعة واسعة من تشيmicals. في دراسة أي مادة كيميائية الاختبار باستخدام هذا الاختبار، يجب تشغيل الضوابط ما يلي: (1) تأثير المادة الكيميائية اختبار على خلفية (أي خلايا) قراءات، (2) تأثير المادة الكيميائية على تحبب عفوية (الخلايا مع عدم وجود فريق الخبراء الحكومي الدولي ، لا مستضد، لا حامل الأيون)، (3) تأثير المادة الكيميائية على تريتون-X-100 قيم الخلايا هي lysed (لا مستضد، لا حامل الأيون). هذه الاختبارات يمكن عمل بسهولة في تخطيط لوحة. سابقا، وجدنا TCS يؤثر أي من هذه المعلمات الثلاث ^2. بالإضافة إلى ذلك، يجب تشغيل الاختبارات لتحديد أن هذه المادة الكيميائية الاختبار لا تتداخل مع β-هيكسوزامينيداز انزيم / الركيزة رد فعل نفسها في إعداد خالية من الخلايا، كما هو موضح في الشكل S1 من الملحق (أ) مقطع البيانات التكميلية من بالمر وآخرون. ² وجدنا أن TCS لا تتداخل مع قدرة β-هيكسوزامينيداز ليلتصق الركيزة الفلورة 4-MU ^2. ويجب أيضا النظر آثار أي المذيبات المستخدمةفي كل هذه التجارب السيطرة. على سبيل المثال، أن أكدت أن DMSO، المذيب للحامل الأيون، ليس له تأثير على-X-100 تريتون مستويات مضان العينة (لا تظهر البيانات). ونلاحظ أيضا أن اخترنا جميع المواد البلاستيكية المستخدمة في هذه الدراسة لعدم اختلال وظائف الغدد الصماء التي تحتوي على ثنائي الفينول أ، ولسوء الحظ، على الرغم من كل البلاستيك الموجودة حاليا في السوق ربما لا تحتوي على بعض الغدد الصماء النشاط المخل، والتي يحتمل أن نخلط البيانات ^64.

في حال استكشاف الأخطاء وإصلاحها مطلوب، ينبغي إعادة النظر في العديد من الجوانب المحتملة لهذا البروتوكول. على سبيل المثال، قد يكون ذلك (1) مستويات الإفراج عفوية مرتفعة جدا (أكبر من ~ 7٪ من القيم تحلل)، (2) لا وحظ وجود استجابة جرعة منشطة إما مع و / أو الكيميائية اختبار، أو (3) تركيز TCS في حل منخفض جدا (أقل من 20 ميكرون). في الحالة الأولى، يمكن لمستوى عفوية عالية يكون مؤشرا لخلايا يجري في ثقافة طويلة جدا أو تلوثها مع الميكوبلازما، وبالتالي، في محاولة هذه التجارب مع الخلايا RBL-2H3 التي كانت في الثقافة بين 2-20 أسابيع، واختبار بانتظام لالميكوبلازما. إن لم يكن لوحظ الاستجابة للجرعة المنشطة، قد يكون تركيز المنشطات المذاب منخفضة جدا، والأرصدة ينبغي مجدد. كمثال، حامل الأيون الكالسيوم يتم توفيرها عادة كفيلم رقيقة، ليعاد تشكيل مع DMSO، والتي تتطلب عناية فائقة والكثير vortexing ل. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن الأسهم الجديدة حامل الأيون مع عدد الكثير مختلفة لديها قوة مختلفة ويرجع ذلك ببساطة إلى الكثير إلى الكثير الاختلاف، وبالتالي، فمن المستحسن الاستجابة للجرعة تحبب مع كل حامل الأيون الأسهم المشتراة حديثا. ومن الجدير بالذكر أيضا أن النقص الواضح في تأثير بمادة كيميائية اختبار معين يمكن أن يكون دليلا على أن هذه المادة الكيميائية قد تحتاج إلى فترة حضانة أطول من أجل يسبب تأثير. إذا كنت لا تحقيق العائد المرتفع TCS في الحل، والتحقق من أن درجة الحرارة قد ظلت ثابتة (50 درجة مئوية ± 5) في حين أن حبيبات والذوبان في المخزن المؤقت. Tكان ميزان الحرارة لا ينبغي أبدا تلمس الجزء السفلي من القارورة، وهو موقف من شأنه أن يؤدي إلى المبالغة في تقدير درجة الحرارة من الحل. أيضا، تأكد من وجود اثارة قوية ثابتة وأن 90 دقيقة العد التنازلي لم يتم بدء تشغيل حتى وصلت لأول مرة درجة الحرارة 50 درجة مئوية.

جدول لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها.

كما هو الحال في أي تجربة علم السموم / علم الأدوية، يجب أن لا يكون الاختبار الكيميائية السامة بشكل علني في تركيزات المختبرة. ونحن نوصي باستخدام الأساليب التي اختبار لكلا موت الخلايا المبرمج ونخر، إما بشكل فردي أو مجتمعة (مثل مع المقايسات مولد الرمع)، فضلا عن اختبارات عن الضرر العام إلى غشاء البلازما (مثل اللاكتات نازعة تسرب). TCS، بتركيزات هو مبين في هذه الدراسة، ليست السامة للخلايا إلى خلايا RBL-2H3 ^2. ملاحظة مهمة وخاصة للقلق مع حامل الأيون الدراسات هو أن حامل الأيون زائد حامل الأيون السيارة(مرجح DMSO)، بالإضافة إلى اختبار كيميائي، بالإضافة إلى أي المذيبات العضوية المستخدمة، يمكن أن يكون المشروب يحتمل أن تكون سامة للخلايا، والتي يجب أن تسيطر عليها بعناية، كما فعلت في بالمر وآخرون. ²

سوف بروتوكول لدينا لإعداد حلول TCS دون استخدام مذيب عضوي تكون مفيدة لإجراء مزيد من التجارب السمية لهذه المادة الكيميائية في كل مكان، ومن دون تدخل من التحف المذيبات، وهو اعتبار مهم لا سيما في علم السموم المائية. كما تسمح هذه الأساليب للتحقق من تركيز TCS في حل والتحديد الكمي للآثار أن المواد الكيميائية، مثل TCS، ويكون على تحبب الخلايا البدينة. هذا البروتوكول يمكن استخدامها لتقييم آثار طائفة واسعة من المواد الكيميائية على تحبب الخلايا البدينة، مثل الغدد الصماء يشتبه المواد الكيميائية المعطلة ^55، ويحتمل أن يتم توسيع نطاقها لفحص إنتاجية عالية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام غيرها من أنواع الخلايا البدينة في هذا الاختبار في العمل في المستقبل.

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

معتمدة LMW وRHK من قبل مدرسة UMaine الدراسات العليا للعلوم والهندسة (GSBSE) الطبية الحيوية؛ كان مدعوما أيضا من قبل RHK مين الزراعية وتجربة محطة غابة. وقدمت تمويلا إضافيا من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة (NIH P20-GM103423)، ومين الزراعية وتجربة محطة غابة (جرانت عدد ME08004-10، الفريق الاستشاري المشترك)، وجامعة ولاية ماين ADVANCE ارتفاع المد مركز (NSF المنح # 1008498) ، وبحوث كاتب المنحة الصيدلة / علم السموم من مؤسسة فارما (JAG). نشكر الدكاترة. ديفيد Holowka وباربرا بيرد للمستضد والخلايا. ونحن ممتنون لهينا الهاشمي، اليخاندرو فيليز، وأندرو Abovian للمساعدة بالمعدات وأوامر. هذا هو مين الزراعية والغابات تجربة محطة المنشور رقم 3311.