Method Article
Мы разработали В пробирке Малярии, ВИЧ-1, ко-инфекции моделью для изучения влияния Plasmodium тропической На ВИЧ-1 репликативного цикла в человеческой первичной моноцитарных макрофагов. Эта универсальная система может быть легко адаптирована для других первичных типов клеток восприимчивы к ВИЧ-1 инфекции.
Plasmodium тропической, возбудителя смертоносной формы малярии, и вирус иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1) являются одними из наиболее важных проблем со здоровьем во всем мире, которая отвечает за в общей сложности 4 миллиона смертей ежегодно 1. Благодаря своим обширным перекрытия в развивающихся странах, особенно в странах Африки южнее Сахары, сопутствующие инфекции, больных малярией и ВИЧ-1 являются общими, но взаимодействие между этими двумя заболеваниями плохо. Эпидемиологические отчеты показали, что малярийной инфекции временно повышает репликации ВИЧ-1 и увеличивает ВИЧ-1, вирусная нагрузка в сотрудничестве инфицированных 2,3. Потому что это виремии остается высоким в течение нескольких недель после лечения противомалярийные препараты, это явление может оказывать влияние на прогрессирование заболевания и передачи.
Клеточные механизмы иммунологической за эти наблюдения были изучены только вряд ли. Несколько в лабораторных исследованиях investigating воздействия малярии на ВИЧ-1 показали, что воздействие растворимых малярийных антигенов может увеличиться ВИЧ-1 инфекции и реактивации в клетки иммунной системы. Однако, эти исследования использовали весь клеточных экстрактов П. тропической шизонт стадии паразитов и мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК), что делает его трудно расшифровать который малярийных компонент (ы) был ответственен за наблюдаемый эффект и то, что клетки-мишени хозяин был 4,5. Недавние исследования показали, что воздействие на незрелый моноцитарных дендритные клетки малярийного пигмента hemozoin увеличить их способность переносить ВИЧ-1 в CD4 + Т-клеток, 6,7, но она уменьшилась ВИЧ-1 инфекции макрофагов 8. Чтобы пролить свет на этот сложный процесс, систематический анализ взаимодействий между паразитами малярии и ВИЧ-1 в различных соответствующих первичных человеческих клеточных популяций крайне необходимо.
Несколько методов для исследования влияния HIV-1 на фагоцитоз микроорганизмов и влияние таких патогенов на репликации ВИЧ-1 были описаны. Мы здесь представляем метод изучения влияния P. тропической-инфицированных эритроцитов на репликацию ВИЧ-1 в человеческой первичной моноцитарных макрофагов. Влияние паразита воздействия на ВИЧ-1 транскрипционных / поступательного событий контролировать с помощью одного цикла pseudotyped вирусов, в которой ген люциферазы корреспондент сменил гена Env в то время как влияние на количество вируса выпущена инфицированных макрофагов определяется путем измерения ВИЧ-1 белок капсида p24 с помощью ИФА в ячейке супернатантах.
Примечание: Эксперименты с ВИЧ-1 и Plasmodium тропической должны быть выполнены в надлежащем уровня биобезопасности лабораторий (BSL2 для паразитов и BSL3 для ВИЧ-1 и сопутствующих инфекций) и специальные меры предосторожности должны быть приняты при использовании потенциально зараженной крови человека.
1. Мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) очистки (на 8 и 9)
2. Моноциты-макрофаги производных (MDM) Дифференциация (на 8 и 9)
3. Производство и количественный ВИЧ-1 Вирусные акции
4. Культура плазмодии тропической (по 13)
4.1 Общие культуры и обслуживание паразитов
4,2 паразитов синхронизации
4,3 Plasmodium тропической-инфицированных красных кровяных телец (iRBC) очистка
5. Воздействие МДМ Plasmodium тропической
6. Инфекция с МДМ Полностью репликативной ВИЧ-1
7. Заражение МДМ с одиночной люциферазы вирусов Кодирование цикла
8. Представитель Результаты
Используя наш ко-инфекции модели, мы покажем, что exposurе П. тропической МДМ снижает их восприимчивость к ВИЧ-1 инфекции. Действительно, значительное снижение (р <0,05, 2 дисперсионного анализа, 12-й день) в выпуске вирусных частиц, измеряемая ВИЧ-1, p24 белок капсида в супернатанте, наблюдается в МДМ предварительно с паразитами (рис. 2A). Это наблюдение подтверждается в клетках, инфицированных вирусами кодирования люциферазы-ген-репортер. МДМ-инфекции с такими вирусами укрывательство или экзогенных VSV-G или ВИЧ-1 гликопротеинов приводит к достоверно (р <0,05, Стьюдента-тест) меньше люциферазы в клетках подвергаются P. тропической (рис. 2В). Стоит отметить, что VSV-G-pseudotyped вирусов дали гораздо больше активности люциферазы, чем их коллеги JRFLenv, это связано с большей эффективностью инфекции VSV-G pseudotyped частиц 15. Учитывая, что паразит экспозиции МДМ последствия обоих типов вирусов, это говорит о том, что он влияет на каком-то шаге вирусной бывший генВыражение (рис. 2В). Важно также отметить, что жизнеспособность клеток не зависит от МДМ-экспозиция iRBC (данные не представлены), что указывает на торможение наблюдается является специфическим и не за счет клетки смертности.
Рисунок 1. А) плиты схему МДМ-инфекции вирус полностью репликативной Мок. Неинфицированных клеток. УрБК: клетки подвергаются неинфицированных эритроцитов. iRBC: клетки подвергаются Plasmodium тропической-инфицированных красных кровяных телец. Баль: клетки, инфицированные NL4.3Bal окр Бал / УрБК. Клетки подвергаются УрБК и инфицированных NL4.3Bal окр Бал / iRBC.. Клетки подвергаются iRBC и инфицированных с NL4.3Bal окр б) плиты схему МДМ-инфекции один цикл люциферазы кодировки вирусов Мок. неинфицированных клеток. УрБК: клетки подвергаются неинфицированных эритроцитов. iRBC: клетки подвергаются Plasmodium тропической-яnfected красных кровяных телец. Δenv: клетки, инфицированные NL4.3 Люк + Env - R + JRFL. Клетки, инфицированные NL4.3 Люк + Env - R + (JRFL ENV). VSV-G: клетки, инфицированные NL4.3 Люк + Env - R + (VSV-G) Δenv / УрБК.. клетки подвергаются УрБК и инфицированных NL4.3 Люк + Env-R + Δenv / iRBC: клетки подвергаются iRBC и инфицированных NL4.3 Люк + Env - R + JRFL / УрБК: клетки подвергаются УрБК и инфицированных NL4.3 Люк + Env - R + (JRFL ENV).. JRFL / iRBC: клетки подвергаются iRBC и инфицированных NL4.3 Люк + Env - R + (JRFL ENV). vsv-g/uRBC: клетки подвергаются УрБК и инфицированных NL4.3 Люк + Env - R + (VSV-G) vsv-g/iRBC. клетки подвергаются iRBC и инфицированных NL4.3 Люк + Env - R + (VSV-г).
Рисунок 2. .) Влияние Plasmodium тропической на ВИЧ-1 вирусной продукции в МДМ МДМ подвергались УрБК или iRBC в соотношении 75:1 (УрБК / iRBC: MDM) в течение 4 часов и широко мыть. Клетки были заражены 10ng из NL4.3Bal окр p24 в течение 2 часов. Вирусный производство контролировалось с помощью ИФА на ВИЧ-1, p24 в бесклеточной надосадочной в различные моменты времени после первоначального вирусной инфекции. Представитель эксперимент показал B) Влияние Plasmodium тропической на ВИЧ-1 вирусной транскрипции в МДМ МДМ были инфицированы УрБК или iRBC в соотношении 75:1 (УрБК / iRBC.. MDM). Затем клетки, инфицированные 10ng р24 одного цикла вируса (или NL4.3 Люк + Env - R +, NL4.3 Люк + Env - R + (JRFL ENV) или NL4.3 Люк + Env - R + (VSV- г)). Люциферазы выражении оценивалась в клеточных лизатов 72 часа после заражения вирусом. Представитель эксперимента.
Мы продемонстрировали здесь два различных подхода к анализу влияния малярии на ВИЧ-1 цикла вируса, то есть на основе анализа или экспрессии вирусных генов или потомство производства вирусов и репликации в моноцитарных макрофагов. Аналогичные подходы были использованы для других ВИЧ-1-паразит со-инфекции 16. Однако, эти новые данные являются шагом вперед в исследовании малярии ВИЧ-1, со-инфекции. . Действительно, Diou и др. 8 изучали влияние hemozoin, а не живых паразитов, по репликации ВИЧ-1, в согласии с нашими результатами, они отметили, что hemozoin сама, достаточном для ингибирования вирусной производство МДМ, а не MDMs.
Использование описанного экспериментального макета, мы обнаружили, что P. тропической оказывает четкое негативное воздействие на ВИЧ-1 репликативного цикла в макрофагах: значительное снижение вирусной производства наблюдается в макрофагах предварительно подвергается паразиты (FigurE 2A) и конкретного воздействия паразита на вирусную транскрипцию показано на рисунке 2Б. Тем не менее, мы не можем оставить какие-либо дополнительные эффекты паразита на проникновении вируса в клетку или синтеза (decapsidation), либо на пост-интеграционных механизмов, таких, как синтез белка или вирусной частицей и сборка почкования. Кроме того, не исключено, что различное влияние на репликации ВИЧ-1 может быть получено, если паразиты были добавлены или одновременно или после инфекции МДМ-вирусом.
Наши в пробирке ко-инфекции модель представляет собой мощный инструмент для выполнения детальных исследований ВИЧ-1 / P. тропической взаимодействия в клетке-хозяине. Например, комбинация этой экспериментальной схемы с другими методами, таких как количественный ПЦР в реальном времени, которая может определять и количественно конкретные шаги в вирусной retrotranscription и вирусных интеграции генома в геном клетки-хозяина, вполне осуществимы и должны дать дальнейшие ИНСИghts в механизмы, участвующие в совместной инфекции. Кроме того, конкретные тесты для оценки ранних стадиях цикла вируса (вирусная синтеза, decapsidation начального количественного) могут быть применены к этой основной протокол для дальнейшего анализа влияния на репликацию вируса. Эти изменения показывают, насколько гибкой этот протокол в отношении ВИЧ-1 и количественного охвата: в самом деле, даже стандартные ВИЧ-1 обратная транскриптаза анализов количественного использованием меченных тритием нуклеотидов вполне может заменить ИФА на ВИЧ-1, p24. В дополнение к МДМ, мы ожидаем, что наша система была адаптирована к другим типам клеток отношение к ВИЧ-1, малярии взаимодействия, такие как моноциты и дендритные клетки. Тот факт, что МДМ являются приверженцем клеток способствует их манипуляции, что позволяет легко вымывания iRBC, которые не были приняты, или которые находятся в контакте с МДМ, не устраняя любую макрофагов. Такое преимущество не будет применяться к дендритные клетки и моноциты, которые культивируются в виде суспензии, усложняя себеторных из УрБК и свободный iRBC с такими клетками, и мы в настоящее время решения этого вопроса. Наша система также может быть полезна для изучения более сложных взаимодействий, таких как последствия Plasmodium, подвергшихся воздействию моноцитарных клеток на ВИЧ-1 цикла вируса в другие клетки иммунной системы, такие как CD4-положительные Т-клетки совместно культуры экспериментов. Наконец, наш протокол может быть подходящим для экспериментов смотря на влияние П. тропической iRBCs на ВИЧ-1, реактивация в МКПК для ВИЧ-1-инфицированных лиц.
Этика заявление
МКПК человека были получены из крови здоровых доноров, в соответствии с руководящими принципами Комитета по биоэтике больничного центра де l'Université Laval исследовательский центр. Письменное согласие было получено от всех доноров крови.
Нет конфликта интересов объявлены.
Эта работа выполнена при финансовой поддержке Канадского института исследований в области здравоохранения через Catalyst Co-инфекции и сопутствующих заболеваний гранта. Эритроцитов человека были предоставлены больничного центра де l'Université Laval банк крови.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Название реагента | Компания | Номер по каталогу | Комментарии |
RPMI 1640 | Multicell | 350-000-CL | |
PBS-эндотоксина бесплатно | Сигма | D8662 | |
FBS | Зубр | 080-150 | Тепло-инактивируется при 56 ° C в течение 30 минут |
Accutase | eBiosciences | 00-4555-56 | |
Albumax II | Гибко | 11021-037 | Растворенный в RPMI 1640, фильтр-стерилизованное |
Лимфоцитов среднего отделение | Multicell | 305-010-CL | |
Белые пластины люминометра | Promega | Z3291 | |
CS Маки разделение columms | Miltenyi Biotech | 130-041-305 | |
VarioMacs сепаратор | Miltenyi Biotech | 130-090-282 | |
Пенициллина / стрептомицина решение | Зубр | 450-201-EL | |
D-сорбита | Sigma-Aldrich | S1876 | |
Сотовые скребком (25 см) | Sarstedt | 83,1830 | |
24-луночных культуре клеток | BD Сокол | 353047 | |
150 х 20 мм культуры блюдо | Sarstedt | 83.1803.003 | |
M-CSF | Genscript | Z02001 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
Сыворотка крови человека AB + | Долина биомедицинских | HP1022 | |
HBSS | Зубр | 311-505-CL | |
Гентамицин | Sigma-Aldrich | G1397 | |
Гипоксантин | Sigma-Aldrich | H9636 | |
NaHCO 3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Анализ системы люциферазы | Promega | E1500 | |
Эритроциты человека | Полученный очищенный от Чул банк крови. |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены