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Wir haben ein entwickelten In-vitro- Malaria-HIV-1-Co-Infektion Modell, um die Auswirkungen zu studieren Plasmodium falciparum Auf der HIV-1-Replikationszyklus in primären menschlichen Monozyten abgeleiteten Makrophagen. Dieses vielseitige System kann leicht an andere primäre Zelltypen anfällig für HIV-1 Infektion angepasst werden.
Plasmodium falciparum, dem Erreger der tödlichsten Form von Malaria, und Human Immunodeficiency Virus Typ-1 (HIV-1) gehören zu den wichtigsten Gesundheitsprobleme weltweit, verantwortlich für insgesamt 4 Millionen Todesfälle pro Jahr ein. Durch ihre weitgehende Überschneidungen bei der Entwicklung von Regionen, insbesondere Afrika südlich der Sahara, Co-Infektionen mit Malaria und HIV-1 sind häufig, aber das Zusammenspiel zwischen den beiden Krankheiten ist bisher wenig bekannt. Epidemiologische Berichte lassen vermuten, dass Malaria-Infektion vorübergehend erhöht HIV-1-Replikation und erhöht die HIV-1-Viruslast bei co-infizierten Individuen 2,3. Da diese Virämie bleibt hoch für einige Wochen nach der Behandlung mit Malariamittel, könnte dieses Phänomen einen Einfluss auf den Krankheitsverlauf und Übertragung.
Die zellulären immunologischen Mechanismen hinter diesen Beobachtungen wurden nur kaum untersucht. Die wenigen in-vitro-Studien InvestigBetrieb dieses Auswirkungen von Malaria auf HIV-1 haben gezeigt, dass die Exposition gegenüber löslichen Malaria-Antigene HIV-1 Infektion und Reaktivierung in Immunzellen zu erhöhen. Jedoch verwendet diese Studien Ganzzellextrakten von P. falciparum-Parasiten Schizonten und peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC), so dass es schwer zu entziffern, welche Malaria-Komponente (n) verantwortlich für die beobachteten Effekte und was die Ziel-Host-Zellen waren 4,5 war. Neuere Arbeiten haben gezeigt, dass die Exposition von unreifen Monozyten abgeleitete dendritische Zellen der Malaria Pigment Hämozoin ihre Fähigkeit, HIV-1 an CD4 + T-Zellen 6,7 ausbreitet, sondern dass sie HIV-1 Infektion von Makrophagen 8 reduziert. Um Licht in dieses komplexen Prozesses, eine systematische Analyse der Wechselwirkungen zwischen dem Malariaparasiten und HIV-1 in verschiedenen relevanten primären humanen Zellpopulationen vergossen wird dringend benötigt.
Verschiedene Techniken zur Untersuchung der Auswirkungen von HIV-1 auf die Phagozytose von Mikroorganismen und deren Wirkung auf Krankheitserreger HIV-1-Replikation sind beschrieben worden. Wir stellen hier eine Methode, um die Auswirkungen zu untersuchen P. falciparum-infizierten Erythrozyten auf die Replikation von HIV-1 in humanen primären Monozyten abgeleiteten Makrophagen. Die Auswirkungen der Parasitenexposition auf HIV-1 transkriptionalen / translationalen Ereignisse mit einzelnen Zyklus pseudotypisierte Viren, in dem ein Luciferase-Reportergen das Env-Gen ersetzt wurde überwacht, während der Effekt auf die Menge des Virus von der infizierten Makrophagen durch Messen der bestimmt wird, HIV-1 Capsid-Protein p24 mittels ELISA in Zellüberständen.
Hinweis: Experimente mit HIV-1 und Plasmodium falciparum ist in der Ausführung Biosicherheitsstufe Laboratorien durchgeführt werden (BSL2 für Parasiten und BSL3 für HIV-1 und Co-Infektionen) und besondere Vorsicht walten, wenn Sie möglicherweise infizierten menschlichen Blutes werden.
1. Periphere Blut-mononukleäre Zellen (PBMC) Reinigung (Basierend auf 8 und 9)
2. Monozyten-abgeleiteten Makrophagen (MDM) Differenzierung (Basierend auf 8 und 9)
3. Produktion und die Quantifizierung von HIV-1 viralen Stammlösungen
4. Kultur des Parasiten Plasmodium falciparum (Basierend auf 13)
4.1 Allgemeine Kultur und Pflege von Parasiten
4,2 Parasite Synchronisation
4,3 Plasmodium falciparum-infizierten roten Blutkörperchen (iRBC) Reinigung
5. Die Exposition von MDM zu Plasmodium falciparum
6. Die Infektion von MDM mit einem voll replikative HIV-1
7. Die Infektion von MDM mit Single-Cycle-Virus Luciferase
8. Repräsentative Ergebnisse
Mit unserem Co-Infektion Modell zeigen wir, dass exposure von P. falciparum zu MDM senkt ihre Anfälligkeit für HIV-1 Infektion. Tatsächlich wurde eine signifikante Abnahme (p <0,05, 2 ANOVA, Tag 12) in der Freigabestellung der viralen Partikel, wie durch HIV-1 p24 Capsid-Protein im Überstand gemessen, in MDM vorbehandelt mit Parasiten (2A) beobachtet. Diese Beobachtung wird in den Zellen durch Viren, die für eine Luciferase-Reportergen infiziert bestätigt. MDM Infektion mit solchen Viren beherbergen entweder exogene VSV-G-oder HIV-1-Glykoproteine führt zu signifikant (p <0,05, Student t-Test) weniger Luciferase-Produktion in Zellen, die P. falciparum (Abbildung 2B). Es ist bemerkenswert, dass VSV-G-pseudotypisierte Viren viel größer Luciferaseaktivität als ihre Gegenstücke JRFLenv ergab, das ist aufgrund der größeren Infektionseffizienz von VSV-G-pseudotypisierten Partikel 15. Da die Exposition gegenüber Parasiten MDM Auswirkungen beide Arten von Viren, dies deutet darauf hin, dass es einige Schritt in virale Gen ex beeinflusstpression (Abbildung 2B). Es ist auch wichtig zu erwähnen, dass die Lebensfähigkeit der Zellen nicht durch MDM Exposition iRBC (Daten nicht gezeigt) Dies weist darauf hin, dass die Hemmung beobachtet spezifisch und nicht wegen einer Zellenbelastung Mortalität ist.
Abbildung 1. A) Plate System für den MDM-Infektion mit einem voll replizierende Virus Mock:. Nicht infizierten Zellen. uRBC: Zellen, die nicht infizierten Erythrozyten. iRBC: Zellen, die Plasmodium falciparum-infizierten roten Blutkörperchen. Bal: Zellen mit NL4.3Bal env Bal / uRBC infiziert:. Zellen zu uRBC ausgesetzt und infiziert mit NL4.3Bal env Bal / iRBC:.. Zellen, die infizierte iRBC und mit NL4.3Bal env B) Plate System für den MDM-Infektion mit Single-Cycle-Luziferase-kodierende Virus Mock:. nicht infizierten Zellen. uRBC: Zellen, die nicht infizierten Erythrozyten. iRBC: Zellen auf Plasmodium falciparum-i ausgesetztnfected roten Blutkörperchen. Δenv: Zellen mit NL4.3 Luc + Env infiziert - R + JRFL:. Zellen mit NL4.3 Luc + Env infiziert - R + (JRFL env). VSV-G: Zellen mit NL4.3 Luc + Env infiziert - R + (VSV-G) Δenv / uRBC.. Zellen uRBC belichtet und infiziert mit NL4.3 Luc + Env-R + Δenv / iRBC: Zellen ausgesetzt iRBC und infiziert mit NL4.3 Luc + Env - R + JRFL / uRBC: Zellen, die uRBC und infiziert mit NL4.3 Luc + Env - R + (JRFL env).. JRFL / iRBC: Zellen, die iRBC und infiziert mit NL4.3 Luc + Env - R + (JRFL env). vsv-g/uRBC: Zellen, die uRBC und infiziert mit NL4.3 Luc + Env - R + (VSV-G) vsv-g/iRBC. Zellen iRBC belichtet und infiziert mit NL4.3 Luc + Env - R + (VSV-G).
Abbildung 2. . MDM) für 4 Stunden und ausgiebig gewaschen: A) Effekt von Plasmodium falciparum auf HIV-1 Virus-Produktion in MDM MDM wurden uRBC oder iRBC im Verhältnis 75:1 (uRBC / iRBC ausgesetzt. Die Zellen wurden mit 10 ng der NL4.3Bal env p24 für 2 h infiziert. Virale Produktion wurde mittels ELISA für HIV-1 p24 in zellfreien Überstand zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der ursprünglichen viralen Infektion überwacht. . Ein repräsentatives Experiment B) Effekt von Plasmodium falciparum auf HIV-1 virale Transkription in MDM gezeigt MDM wurden mit uRBC oder iRBC im Verhältnis 75:1 (uRBC / iRBC infiziert:. MDM). R +, NL4.3 Luc + Env - - R + (JRFL env) oder NL4.3 Luc + Env - Zellen wurden dann mit 10 ng von p24 von Single-Cycle-Virus (entweder NL4.3 Luc + Env infiziert R + (VSV- g)). Luciferase-Expression wurde in Zelllysaten 72 Stunden nach der ersten Virus-Infektion untersucht. Ein repräsentatives Experiment gezeigt.
Wir haben hier zwei verschiedene Ansätze dargestellt, um die Auswirkungen der Malaria-Parasiten auf dem HIV-1 viralen Zyklus, dh durch Analysieren einer viralen Genexpression oder Nachkommen-Virus Produktion und Replikation in Monozyten abgeleiteten Makrophagen zu analysieren. Ähnliche Ansätze für andere HIV-1-Parasiten Co-Infektionen 16 verwendet. Allerdings sind diese neuen Daten ein Schritt nach vorn bei der Untersuchung von Malaria-HIV-1-Co-Infektionen. . Tatsächlich Diou et al 8 untersuchten die Wirkung von Hämozoin, nicht lebenden Parasiten, auf HIV-1-Replikation; in Übereinstimmung mit unseren Ergebnissen beobachteten sie, dass Hämozoin selbst ausreichend, um virale Produktion von MDM zu hemmen war, und nicht MDMs.
Mit der beschriebenen Versuchsanordnung beobachteten wir, dass P. falciparum übt eine klare nachteilige Wirkung auf die HIV-1-Replikationszyklus in Makrophagen: eine signifikante Hemmung der Virusproduktion in Makrophagen Parasiten vorbelichtet beobachtet (Figure 2A) und eine spezifische Wirkung der Parasiten auf die virale Transkription wird in 2B dargestellt. Dennoch können wir nicht weglassen keine zusätzlichen Effekte des Parasiten auf das Eindringen des Virus oder Fusion (decapsidation), oder auf Post-Integration-Mechanismen wie die Proteinsynthese oder Viruspartikelzusammenlagerung und Knospung. Weiterhin ist es möglich, dass eine unterschiedliche Auswirkungen auf HIV-1-Replikation erhalten würde, wenn die Parasiten wurden entweder gleichzeitig oder nach MDM Infektion mit dem Virus zugegeben werden.
Unsere in vitro Co-Infektion Modell ist ein leistungsstarkes Tool, um detaillierte Untersuchungen von HIV-1 / P. durchführen falciparum Wechselwirkungen in der Wirtszelle. Zum Beispiel sind die Kombination dieser Versuchsanordnung mit anderen Techniken, wie quantitative Echtzeit-PCR, die gezielt quantifizieren können spezifische Schritte in dem viralen Retrotranskription und viralen Genoms Integration in das Genom der Wirtszelle, durchaus möglich und sollte weiter zu ergeben Insights in die Mechanismen in Co-Infektionen beteiligt. Darüber hinaus spezifische Tests auswerten frühen Schritte des viralen Zyklus (virale Fusion, decapsidation, Quantifizierung Eintrag) können auf diese grundlegende Protokoll angewendet werden, um weiter zu analysieren die Wirkung auf die virale Replikation. Diese Änderungen zeigen, wie flexibel dieses Protokoll in Bezug auf HIV-1-Quantifizierung und Nachweis: ja, auch Standard-HIV-1-Reverse-Transkriptase-Quantifizierungsassayverfahren mit Tritium-markierten Nukleotiden denkbar ersetzen die ELISA für HIV-1 p24. Zusätzlich zu MDM, erwarten wir unser System anpassungsfähig sein, um anderen Zelltypen, die für HIV-1-Malaria-Wechselwirkungen, wie zB Monozyten und dendritischen Zellen. Die Tatsache, dass MDM adhärente Zellen sind, erleichtert ihre Handhabung, erlaubt eine einfache Auswaschen iRBC, die nicht in getroffen worden, oder die in Kontakt mit MDM sind, ohne Eliminierung keine Makrophagen. Ein solcher Vorteil wäre nicht zu dendritischen Zellen und Monozyten, die in Suspension kultiviert werden gelten, was bisher die sichbereitung von uRBC und kostenlos iRBC mit solchen Zellen, und wir sind derzeit Lösung dieses Problems. Unser System könnte auch nützlich sein, komplexere Interaktionen wie die Auswirkungen von Plasmodium-exponierten Monozyten abgeleiteten Zellen auf der HIV-1 viralen Zyklus in anderen Immunzellen wie CD4-positive T-Zellen in Co-Kultivierung von studieren. Schließlich könnte unser Protokoll geeignet sein für Experimente Blick auf die Wirkung von P. falciparum iRBCs auf HIV-1-Reaktivierung in PBMC für die HIV-1 infizierten Personen.
Ethik-und Verlustrechnung
Humane PBMC wurden aus dem Blut gesunder Spender gewonnen, in Übereinstimmung mit den Leitlinien der Bioethik-Ausschuss des Centre Hospitalier de l'Université Laval Research Center. Eine schriftliche Einverständniserklärung wurde von allen Blutspendern gewonnen.
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Diese Arbeit wurde von der kanadischen Institutes of Health Research durch einen Katalysator Co-Infektionen und Komorbiditäten Zuschuss unterstützt. Menschliche Erythrozyten wurden durch das Centre Hospitalier de l'Université Laval Blutbank zur Verfügung gestellt.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Name des Reagenzes | Firma | Katalog-Nummer | Kommentare |
RPMI 1640 | Multicell | 350-000-CL | |
PBS-Endotoxin-frei | Sigma | D8662 | |
FBS | Wisent | 080-150 | Bei 56 ° C für 30 min hitzeinaktiviert |
Accutase | eBiosciences | 00-4555-56 | |
Albumax II | Gibco | 11021-037 | Gelöst in RPMI 1640, filtersterilisiert |
Lymphozyten-Separationsmedium | Multicell | 305 bis 010-CL | |
Weiße Platten-Luminometer | Promega | Z3291 | |
CS Macs Trennung columms | Miltenyi Biotech | 130-041-305 | |
VarioMacs Abscheider | Miltenyi Biotech | 130-090-282 | |
Penicillin / Streptomycin-Lösung | Wisent | 450 bis 201-EL | |
D-Sorbit | Sigma-Aldrich | S1876 | |
Zellenabstreifer (25 cm) | Sarstedt | 83,1830 | |
24-Well-Zellkulturplatten | BD Falcon | 353047 | |
150 x 20 mm Kulturschale | Sarstedt | 83.1803.003 | |
M-CSF | Genscript | Z02001 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
Humanes Serum AB + | Tal Biomedizinische | HP1022 | |
HBSS | Wisent | 311 bis 505-CL | |
Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
Hypoxanthin | Sigma-Aldrich | H9636 | |
NaHCO 3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Luciferase Assay System | Promega | E1500 | |
Menschliche rote Blutkörperchen | Gewonnen aus CHUL Blutbank gereinigt. |
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