Грамицидин основе флуоресценции Пробирной; для определения малых молекул Потенциал Изменение свойств липидного бислоя

Введем быстрой флуоресценции основе анализа, который контролирует скорость тушения флуоресценции в качестве меры активности канала грамицидина. Грамицидин каналы используются как молекулярные датчики силы, чтобы следить за изменениями в липидных свойства бислоя как воспринимается бислоя охватывающих белков.

Многие лекарства и другие небольшие молекулы, используемые для модуляции биологические функции амфифилов которые адсорбируются на двухслойных / решения интерфейсом и тем самым изменять свойства липидного бислоя. Это важно, потому мембранных белков являются энергетически связаны с принимающей бислоя путем гидрофобных взаимодействий. Изменения в двухслойных свойства таким образом изменить мембранный белок, функция, которая предоставляет косвенные пути для амфифилов модулировать функцию белка и возможный механизм "вне целевой" эффектов препарата. Ранее мы уже разработаны электрофизиологические тест для обнаружения изменений в липидных свойства бислоя с использованием линейных каналов грамицидина в качестве зондов ^3,12. Грамицидин каналы мини-белков образована transbilayer димеризации двух непроводящих субъединиц. Они чувствительны к изменениям в их мембраны окружающей среды, что делает их мощным датчиков для мониторинга изменений в свойства липидного бислоя как воспринимается бислоя охватывающих белков. Теперь мы продемонстрируем флуоресценции тест для обнаружения изменений в двухслойных свойства, используя те же каналы в качестве зондов. Анализ основан на измерении времени ходе тушения флуоресценции от флуорофора загружены большие пузырьки однослойных из-за вступления утоления по каналам грамицидина. Мы используем флуоресценции индикатор / утоления пару 8-aminonaphthalene-1 ,3,6-trisulfonate (муравьи) / Tl ^{+, которая} была успешно использована в других анализах тушение флуоресценции ^5,13. Tl ⁺ пронизывает липидный бислой медленно ^8, но легко проходит через проведение грамицидина каналов ^1,14. Метод является масштабируемым и подходит как для механистических исследований и высокопроизводительного скрининга малых молекул для двухслойных-возмущающих и потенциальных "вне целевой", эффекты. Мы считаем, что результаты использования этого метода находятся в хорошем согласии с предыдущими результатами электрофизиологических ^12.

1. Создание ANTS заполненные Липосомы

1. На 1-й день, удаление органического растворителя из липидов.
2. Удалить липидного из морозильника и позвольте ему равновесие до комнатной температуры.
3. Добавить 0,6 мл 25 мг / мл (1,2-dierucoyl-Sn-глицеро-3-фосфохолин) липидов в хлороформе решение 25 мл круглодонную колбу.
4. Постоянно вращайте колбу при высыхании в атмосфере азота, пока все хлороформ испарилась и тонкой белой пленки липидного слоя всей нижней части колбы.
5. Сушить в эксикаторе под вакуумом в течение ночи.

1. На 2-й день, готовят образца с флуорофора, которые будут включены в пузырьки.
2. Увлажняет в 100 мМ NaNO _3, 25 мМ ANTS (натриевая соль), 10 мМ HEPES. Используйте HNO ₃ или NaOH для регулировки рН до 7,0. Каждая молекула имеет ANTS 2 Na ^+, в общей сложности 150 мМ [Na ^+]. Добавить 1,671 мл электролита, чтобы получить 10 подвески липидного мМ.
3. Парафильмом и вихревые подвески тщательно.
4. Защита образца от света фольгой и дайте ему лет при комнатной температуре в течение ночи.

1. На 3-й день, делать крупные однослойные везикулы и удалить все флуорофора извне пузырьков.
2. Разрушать ультразвуком в течение 1 мин в маломощных sonicator.
3. Замораживания и оттаивания образцов в 5-6 раз, каждый раз с 5 минут на сухом льду и 5 минут в теплой (~ 50 ° C) воду.
4. Extrude липидного подвески использованием Avanti мини-экструдера. Настройка мини-экструдер с 0,1 мкм поликарбоната фильтр и фильтр поддерживает (см. экструдера в руководстве по эксплуатации). Extrude подвеску и обратно 21 раз, что приостановка заканчивается на противоположном шприц. Когда несколько партий являются прессованные, всегда помнить, чтобы загрузить образцы с тем же шприцем. Во время экструзии облачно исходной суспензии липидных должна стать почти прозрачной (это все равно будет желтым из-за флуорофора муравьи). Если экструзии вдруг становится легче и меньше давление необходимо пройти через фильтр, фильтр может иметь разрыв и будут нуждаться в замене.
5. Удалить внешние ANTS, запустив экструдированного надстройка над PD-10 обессоливания колонки, используя гравитацию протокола. Равновесия колонка с 20-30 мл Na-буфера (140 мМ NaNO _3, 10 мМ HEPES, рН 7,0, не забывайте использовать HNO ₃ или NaOH для регулировки рН). Добавить 1,5 мл экструдированного подвески липидного в колонну и пусть она просочится дюйма Принесите общий объем образца 2,5 мл, добавляя 1 мл Na-буфера. После буфер полностью включены в колонку и ничего не утечка, элюировать липосом с 3 мл Na-буфера и собирать в результате выборки. В результате ANTS заполнены LUV маточный раствор должен содержать около 4-5 мМ липиды и появляются полупрозрачные молочно-белым. Защитить от света образца с фольгой.
6. Если исходный раствор не используется сразу, хранить при 13 ° С в течение максимум 7 дней. Предупреждение: не замораживать или охлаждать липидного решение ниже своего жидкого состояния в кристально-температура фазового перехода (~ 12 ° C), так как это разрушит целостность пузырьков и флуорофор будет просачиваться.

2. Смешайте флуоресценции Решение

1. За 24 часов до использования, развести липосомы и инкубировать с грамицидина (при 13 ° С). Уравновешивание грамицидина между внутренней и внешней монослоев липидные пузырьки "представляет собой длительный процесс, требующий длительной инкубации.
2. Тщательно вихрь ANTS заполненные LUV маточного раствора, как БУВ имеют плотность> 1 г / мл, а, следовательно, осадка в растворах.
3. Смешать МУРАВЬИ заполненные LUV фондовом 1:20 в Na-буфера. Смешайте все липосом для использования в течение одного дня экспериментов вместе в одной колбе для повышения однородности образца.
4. Отдельные из 3 / 4 от липосомы и добавить 260 нм грамицидина предварительно разводят в ДМСО (500 мкг / мл).
5. Для сохранение 1 / 4 добавить такой же объем ДМСО (без грамицидин), чтобы сохранить постоянную концентрацию растворителя во всех образцах.

3. Настройка флуоресценции Инструмент

1. Мы используем прикладной Фотофизика SX.20 остановил поток spectrofluorometer с контролем температуры для измерения скорости тушения флуоресценции.
2. Включите инструментов на час раньше времени, чтобы учесть согреться. Компоненты: компьютер, электронный блок управления, водяной бане (как холодильник и нагреватель), поставку мощности лампы и азота танк.
3. Настройка записи условий с использованием Pro-Data SX программного обеспечения.
4. Установите длину волны монохроматора возбуждения до 352 нм и отверстия шириной щели возбуждения на 1 / 1.
5. Используйте λ = 455 нм фильтр высоких частот для записи выбросов.
6. Используйте "Давление Hold" настройки, что позволяет инструменту для поддержания давления азота во время записи и таким образом предотвращает колебания давления (и регистрируя артефакты) в течение первых нескольких миллисекунд.
7. Установить "Tiмне "до 1 с и" Точки "до 5000.
8. Используйте повторить коробке и регулировать количество повторов, как правило, мы используем 9 и 13 повторов для утоления буфера и работает, соответственно.
9. Водо-температура ванны должна быть установлена ​​до 25 ° С, температура должна контролироваться в SX программного обеспечения.
10. Установите диск объемом до 120 мкл, а это означает, что каждый раз прибор работает образца, он смешивается с 60 мкл каждого из двух шприцев. С помощью этой инструментальной установки, 120 мкл объема дает мертвое время ≈ 1,2 мс.
11. Отрегулируйте высокого напряжения (прибыль) от детектор флуоресценции для вывода ANTS-липосомы, чтобы быть около 8. Для стандартной экспериментальной смеси усиления должна быть 400-420 В. Некоторые лекарства люминесцентные, например, что они могут насыщать сигнала флуоресценции. В этих случаях прибыль / напряжение должно быть уменьшено.
12. Всегда загружайте флуоресцентные пробы в левой шприц и буфер / утоления в правой шприц. Убедитесь в том, чтобы тщательно вихрь всех образцов, содержащих липосомы перед загрузкой, и знать, что БУВ со временем осядет в шприце.

4. Делая Эксперимент

1. Подготовка образца ANTS загружены БУВ либо с растворителем или соединение, и загрузить в spectrofluorometer вместе с Na-либо буфера или Tl-гаситель (50 мМ TlNO _3, 94 мМ NaNO _3, 10 мМ HEPES при рН 7,0).
2. Используйте 1,5 мл разбавленного ANTS-LUV решение, с или без грамицидина, подготовленные накануне.
3. Добавить соединение в нужной концентрации или растворителем для контроля. Хранить растворитель концентрации до минимума и постоянной для всех образцов. Концентрации должны быть скорректированы с любой новой (неизвестной) соединения для достижения желаемого доза-реакция диапазона. Инкубируйте в течение 10 мин при 25 ° С в темноте.
4. Vortex LUV образца и загрузить в левом шприце. Нагрузка Na-буфера или Tl-гаситель в правой шприц.
5. Тщательно удалить пузырьки воздуха из обоих образцов, нажав шприцы туда и обратно.
6. Убедитесь, что оба шприцы нагружены одинаково до закрытия клапанов. Неравный загрузки приведет к предварительного смешивания растворов, не дожив до записи камеры.
7. В самый первый образец, запись флуоресценции с Na-буфера, повторите 4 раза, регулировать высокое напряжение (прибыль) по мере необходимости, и повторите 5 раз.
8. Для остальных образцов, запись 9 повторяется с Na-буфера.
9. Замените Na-буфера с TI-утоления и записи 13 повторов.
10. Промыть водой и продолжить следующей пробы. В качестве контроля мы используем образцы: нет грамицидина и с растворителем, не грамицидина и с максимальной концентрацией соединения, как с грамицидина и растворителя.

5. Анализ данных

1. Передача результатов анализа компьютера. Читать все данные в MATLAB для анализа. Для каждого образца, читайте во всех буфера и утоления повторяется, за исключением первых четырех в каждом конкретном случае, так как те содержат смешение артефактов. Предполагая, диск объемом 120 мкл, которое требуется немного меньше, чем четыре выстрела, чтобы полностью очистить предыдущие смесь из остановил поток труб.
2. Буфера повторяется для всех проб должны быть очень похожи. Если есть существенный сдвиг в сигнал флуоресценции, которая зависит от концентрации соединения, то соединение само по себе может быть флуоресцентные и это может быть необходимо сначала вычесть этот дополнительный сигнал флуоресценции до нормализации образцов.
3. Вручную пройти следы и удалять "плохие" повторяет: повторяет содержащие шипами или отклонения от нескольких экспоненциальности за счет смешивания артефакты и / или пузырей.
4. Нормализация утоления повторяет среднем начальное значение буфера повторяется для каждого образца. Комбинат средние всех образцов на одном графике для визуализации.
5. Следы, записанных с грамицидина не все должны быть похожи и показывают почти не тушение флуоресценции; может быть медленным сокращением сигнала флуоресценции из-за медленной утечке Tl ⁺ через везикулы бислоя 8. Если образец, не грамицидина и ключ не показывает значительных закалки, то пузырьки ухудшились и не должны использоваться в дальнейшем. Если образцы без каких-либо грамицидина, но с модификатором свидетельствуют о значительных закалки, то модификатор возмущает пузырьки бислоя до такой степени, что она позволяет флуорофора или утоления пересечь бислоя.
6. Если соединение изменяет свойства липидного бислоя, как воспринимается каналов грамицидина, флуоресценция конечно время будет заметно изменилась.
7. Для каждого образца растягивается экспоненциальной например, ⁴⁾ годен к первому 2-100 мс нормированной кривой флуоресценции тушение отдельных повторов и скорость ⁴исчисленная исходя из 2 мс. Средние и стандартные отклонения рассчитываются для данного образца от всех отдельных повторяется.
8. Наконец, определить относительное изменение утолить ставку на нормализацию до ближайшего контрольного образца во времени, которое грамицидина и никаких модификаторов.

6. Представитель Результаты

Рисунок 1: Основы флуоресценции утолить основе анализа для выявления изменений в липидный бислой свойства Вверху слева:. Зум-ин на одном пузырьке липидного с муравьями плюс NaNO ₃ на внутренней и NaNO ₃ плюс TlNO ₃ на улице. Вверху справа: сигнал флуоресценции записанные с использованием (форма сверху вниз) ANTS заполненные пузырьки без утоления, с гасителем, с гасителем и предварительно легированных грамицидин 87, 260 и 780 нм. Внизу: Схематическое изображение остановил поток смесительной камеры.

Рисунок 2: скриншот из Pro-Data SX программного обеспечения иллюстрирующие различные панели, указанные в описании экспериментальной установки.

Рисунок 3:. Несколько определений повторения сигнала флуоресценции от муравьев загружены БУВ с Na-буфера первые четыре повторяется, всегда исключаются, так как они содержат смешение артефактов. Трубы подключения образца шприцев смешивания ячейки имеют определенный объем, поэтому первые несколько повторяет даст нам чтение того, что было ранее в трубку: вода для повтора 1 и 2, определенное сочетание воды и образцы для повторных 3, главным образом образец для повторного 4, и просто образец для остальных повторяется.

Рисунок 4:. Несколько определений повторения сигнала флуоресценции от муравьев загружены БУВ с Na-буфера и с TI-утоления первых четырех повторяет были удалены из обеих условиях. Кроме того, для Tl-утоления измерений, повторите 8 должна быть удалена из-за артефакты, скорее всего, пузырьки воздуха.

. Рисунок 5: Влияние капсаицина (Cap) от времени ход ANTS тушение флуоресценции (А) нормализованный сигнал флуоресценции за 1 с, серый точками обозначены результаты все повторяется (п> 5 в состояние); красные линии обозначают среднее значение всех повторяется. (В) первые 100 мс, серый точками обозначены результаты одного повторить для каждого условия, красные линии растягиваются экспоненциальной подходит (2 - 100 мс) для тех, повторяется. Шероховатой синяя линия обозначает 2 мс марки, время, за которое скорость тушения определяется. В обоих и В верхней линия показывает результаты в отсутствие Tl ^+, в ближайшие два следы показать результаты в отсутствие Г.А., с Tl ⁺ ± Cap; четыре нижних следы показывают результаты с 260 Нм Г.А. и Tl ^+, где цифрами обозначены [Cap] в мкМ. Ставки для тушения 0, 10, 30 и 90 мкМ Cap, как это определено скорость растягивается экспоненциальной, находятся 36 ± 6, 69 ± 6, 85 ± 8 и 247 ± 27 (среднее значение ± SD, п> 8) , соответственно.

Мы показали, быстрой флуоресценции основе анализа для определения бислоя изменения потенциала препаратов и других мелких амфифилов. Соединения, которые изменяют свойства бислоя, скорее всего, изменит мембранный белок функции в косвенной, неспецифический образом, возможно, способствует "вне целевой" эффектов препарата. Анализ эксплуатирует мощности грамицидина каналов в качестве зондов для изменения свойств двухслойных ^12, которые почувствовали на двухслойных охватывающей белков. Результаты получены с использованием флуоресценции основе анализа хорошо согласуются с результатами одноканальный экспериментов дА ^12, указывая, что этот метод может быть использован для механистических исследований, а также для библиотек скрининга соединений. Использование нынешней конфигурации анализа мы можем проверить десятки соединений день, что один-к-два порядка более высокую пропускную способность, чем возможно с помощью одноканального подход. Есть никаких фундаментальных ограничение скорости шаги в флуоресценции основе анализа, а это означает, что она может быть расширена для работы в истинно высокой пропускной режим. Это можно менять электролит в анализе решений и / или использовать различные липидного состава для БУВ. Стоит отметить, что некоторые липидные композиции может отделить при сушке, требующих быстрого растворителя систем обмена вместо сушки / гидратации шаги ^7.

Остается неясным, есть ли причинно-следственная связь между повышением липофильности препарата приводит и увеличение истощение в разработке лекарств ^10,11,17 и, если да, то что основной механизм (ы)? Тем не менее, так как мембранные белки, как правило, регулируется изменением их мембраны среды ^2, было бы разумным для проверки амфифильных наркотики и ведет изменить соответствующие свойства липидный слой и, если да, то какой концентрации? Амфифила адсорбции липидного бислоя будет истощать водной фазе, поэтому соответствующие концентрации свободной концентрации в водной фазе, которая может быть на несколько порядков меньше, чем номинальная концентрация в системе, например, ^6,9,16. Если молекулы с пожеланиями (биологического) эффекты возникают при концентрациях, где она изменяет бислоя свойства, становится важно проводить различие между "неспецифические", бислой-опосредованной изменения мембранного функции белка, в отличие от прямых эффектов, связанных с (высоким сродством ) привязка к одному или нескольким белкам цели. Зная бислоя модифицирующие склонность наркотиков свинца, обнаружили с помощью обычного высокопроизводительного скрининга, поэтому, вероятно, будет важным для решения относительно его дальнейшего развития.

Любой амфифила в какой-то концентрации изменить некоторые бислоя собственности. Ключевые соображения поэтому стали: в какой концентрации, и изменения в двухслойных свойства воспринимается (двухслойной охватывающей) мембранных белков? Здесь мы используем возможность грамицидина для формирования каналов transbilayer димеризации ^15. Это делает их полезными зонды для энергичных связь между липидного бислоя и двухслойных встраиваемый белки, и для изучения ли малые молекулы изменяют бислоя свойства, которые почувствовали на мембранных белков. Анализ является быстрым, надежным и масштабируемым, и поэтому подходит как для биофизических исследований и для скрининга библиотек соединений на наркотики с потенциальными бислой-возмущающих эффектов.

За дополнительной информацией о анализа, проверки эффективности анализа, и по сравнению с одноканальным электрофизиологии увидеть ^12.

Мы благодарим Майкла Дж. Бруно, Радда Русинова и Джон Т. мешок за многочисленные стимулирующие дискуссии. Финансовая поддержка со стороны NIH, R01GM021342 и ARRA дополнения R01GM021342-35S1, и Иосия Мэйси, младший Фонд OSA; Tri-я CMB программа НИ и Iris L. и Леверетта С. Вудворт научный медицинский стипендий и грантов NIH MSTP GM07739 для РК.