Gramicidin-basierte Fluoreszenz-Assay; zur Bestimmung Small Molecules Potential für das Ändern von Lipid-Doppelschicht-Eigenschaften

Wir stellen Ihnen eine schnelle Fluoreszenz-basierter Assay, dass die Rate der Fluoreszenzlöschung als Maß für Gramicidin-Kanal-Aktivität überwacht. Die Gramicidin Kanäle sind als molekulare Kraftaufnehmer verwendet, um Änderungen in Lipiddoppelschicht Eigenschaften wie spürte durch Doppelschicht Spanning Proteine ​​zu überwachen.

Viele Medikamente und andere kleine Moleküle zur Modulation biologischen Funktion sind Amphiphile, die Adsorption an der Doppelschicht / Lösung-Grenzfläche und damit Lipiddoppelschicht Eigenschaften zu verändern. Dies ist wichtig, weil Membranproteine ​​energisch an ihre Host-Doppelschicht durch hydrophobe Wechselwirkungen gekoppelt. Änderungen in Doppelschicht Eigenschaften verändern somit membrane protein-Funktion, die einen indirekten Weg für Amphiphile modulieren Protein-Funktion und einen möglichen Mechanismus für "off-target" Arzneimittelwirkungen zu Verfügung stellt. Wir haben bereits eine elektrophysiologische Assay zum Nachweis von Veränderungen in Lipiddoppelschicht Eigenschaften mittels linearer Gramicidin Kanäle als Sonden ^3,12 entwickelt. Gramicidin-Kanäle sind Mini-Proteine ​​durch die Transbilayer Dimerisierung von zwei nicht-leitenden Untereinheiten gebildet. Sie reagieren empfindlich auf Veränderungen in ihrer Membran-Umgebung, die ihnen leistungsfähige Sonden zur Überwachung von Veränderungen in Lipiddoppelschicht Eigenschaften wie spürte durch Doppelschicht Spanning Proteine ​​macht. Wir zeigen jetzt, ein Fluoreszenz-Assay zum Nachweis von Veränderungen in Doppelschicht Eigenschaften mit den gleichen Kanälen wie Sonden. Der Test basiert auf der Messung der zeitliche Verlauf der Fluoreszenzlöschung von Fluorophor-geladen große unilamellare Vesikel durch die Eingabe einer Quencher durch die Gramicidin-Kanäle auf. Wir nutzen die Fluoreszenz-Anzeige / Quencher-Paar 8-Aminonaphthalin-1 ,3,6-trisulfonat (ANTS) / Tl. ^+, Mit der bereits in anderen Fluoreszenzlöschung Assays ^5,13 verwendet Tl ⁺ durchdringt die Lipid-Doppelschicht langsam ^8, sondern geht leicht durch die Durchführung Gramicidin Kanäle ^1,14. Die Methode ist skalierbar und eignet sich sowohl für mechanistische Studien-und High-Throughput-Screening von kleinen Molekülen für Doppelschicht-stören, und das Potenzial "off-target", Effekte. Wir finden, dass die Ergebnisse mit dieser Methode in guter Übereinstimmung mit früheren elektrophysiologischen Ergebnisse ¹² sind.

1. Generieren Sie ANTS gefüllte Liposomen

1. Am Tag 1, entfernen organische Lösungsmittel aus Lipiden.
2. Entfernen Lipid aus dem Gefrierschrank und lassen Sie es auf Raumtemperatur äquilibriert.
3. Fügen Sie 0,6 ml 25 mg / mL (1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholin) Lipid in Chloroform-Lösung in einen 25 mL Rundkolben.
4. Ständig drehen der Flasche während der Trocknung unter Stickstoff, bis alle das Chloroform verdampft ist und eine dünne weiße Lipidfilm bedeckt die gesamte untere Hälfte der Flasche.
5. Dry in einem Exsikkator unter Vakuum über Nacht.

1. Am Tag 2 Vorbereitung der Probe mit dem Fluorophor, der in die Vesikel aufgenommen werden.
2. Rehydrieren in 100 mM NaNO _3, 25 mM ANTS (Na-Salz), 10 mM HEPES. Verwenden HNO ₃ oder NaOH auf pH auf 7,0 einzustellen. Jedes Molekül hat ANTS 2 Na ^+, für eine Gesamtmenge von 150 mM [Na ^+]. Add 1,671 mL des Elektrolyten zu einer 10 mM Lipidsuspension bekommen.
3. Parafilm und Vortex-Fahrwerk gründlich.
4. Schützen Probe von Licht mit einer Folie und lassen Sie es Alter über Nacht bei Raumtemperatur.

1. Am Tag 3, machen große unilamellare Vesikel und entfernen Sie alle Fluorophor von außerhalb der Vesikel.
2. Ultraschallbad für 1 min in einem Low-Power-Ultraschallgerät.
3. Frost-Tau-Probe 5-6 Mal, jedes Mal mit 5 Minuten auf Trockeneis und 5 Minuten in warmem (~ 50 ° C) Wasser.
4. Extrude die Lipidsuspension mit einem Avanti Mini-Extruder. Richten Sie die Mini-Extruder mit einer 0,1 um Polycarbonat-Filter und Filter unterstützt (siehe Extruder Handbuch für Details). Extrude die Aussetzung hin und her 21 mal so, dass die Aussetzung endet auf der gegenüberliegenden Spritze. Wenn mehrere Chargen extrudiert werden, immer daran denken, Proben mit einer Spritze zu laden. Während der Extrusion die trübe ersten Lipidsuspension werden sollte fast durchsichtig (es wird immer noch gelb wegen der ANTS Fluorophor). Wenn der Extrusion wird plötzlich leichter und weniger Druck benötigt wird, um durch den Filter zu verschieben, kann der Filter gerissen und muss ersetzt werden.
5. Entfernen Sie den äußeren ANTS, indem Sie das extrudierte Suspension über eine PD-10 Entsalzungssäule mit einem Schwerpunkt-Protokoll. Äquilibrieren Säule mit 20-30 ml Na-Puffer (140 mM NaNO _3, 10 mM HEPES, pH 7,0, denken Sie daran, HNO ₃ oder NaOH zu verwenden, um pH-Einstellung). Fügen Sie 1,5 ml der extrudierten Lipidsuspension, um die Spalte und lassen Sie es sickern in. Bringt das Gesamtvolumen der Probe auf 2,5 ml durch Zugabe von 1 mL Na-Puffer. Nachdem der Puffer ist voll in die Spalte eingearbeitet und es wird nichts ausläuft, eluieren die Liposomen mit 3 ml Na-Puffer und sammeln Sie die erhaltene Probe. Die daraus resultierende ANTS gefüllt LUV Stammlösung sollte etwa 4-5 mm Lipide enthalten und erscheinen transparent milchig weiß. Schützen Sie die Probe aus Licht, mit einer Folie.
6. Wenn die Aktie Lösung nicht sofort verwendet wird, lagern bei 13 ° C für maximal 7 Tage. Achtung: nicht einfrieren oder kühlen die Lipid-Lösung unter dem Flüssigkeit-Kristall-Phasenübergangstemperatur (~ 12 ° C), da dies die Vesikel "Integrität zu zerstören und das Fluorophor wird auslaufen.

2. Mix Fluoreszenz-Lösung

1. 24 Stunden vor dem Gebrauch zu verdünnen Liposomen und inkubieren mit Gramicidin (bei 13 ° C). Equilibrierung Gramicidin zwischen den Lipid-Vesikel "inneren und äußeren Monoschichten ist ein langsamer Prozess, der eine lange Inkubationszeit.
2. Gründlich vortexen der ANTS gefüllten LUV Stammlösung als LUVs einer Dichte von> 1 g / mL haben und wird daher Sediment in den Lösungen.
3. Mix der ANTS gefüllten LUV Lager 1:20 in Na-Puffer. Mischen Sie alle Liposomen für den Einsatz an einem Tag von Experimenten in einem einzigen Kolben auf Probe Einheitlichkeit zu verbessern.
4. Separate aus 3 / 4 der Liposomen und fügen 260 nm Gramicidin in DMSO vorverdünnt (500 ug / mL).
5. Um die restlichen 1 / 4 add das gleiche Volumen an DMSO (ohne Gramicidin) zu halten das Lösungsmittel Konzentration konstant in allen Proben.

3. Einrichten des Fluoreszenz-Instrument

1. Wir verwenden einen Angewandte Photophysik SX.20 stopped-flow Spektrofluorometer mit Temperaturregelung, die Rate der Fluoreszenzlöschung zu messen.
2. Schalten Sie die Instrumente auf eine Stunde vor der Zeit, für aufwärmen können. Die Komponenten sind: Computer, elektronische Steuerung, Wasserbad (beide Kühler und Heizer), Lampe Stromversorgung und Stickstoff-Tank.
3. Richten Sie die Aufnahmebedingungen mit dem Pro-Data SX-Software.
4. Setzen Sie den Monochromator Anregungswellenlänge auf 352 nm und Spaltbreite Öffnungen für die Anregung zu 1 / 1.
5. Verwenden Sie ein λ = 455 nm High-Pass-Filter, um die Emission aufzunehmen.
6. Verwenden Sie den "Druck Hold"-Einstellung, die das Instrument ermöglicht es, die Stickstoff-Druck während der Aufnahme zu halten und verhindert somit Druckschwankungen (und Aufzeichnung Artefakte) während der ersten paar Millisekunden.
7. Set "Time "bis 1 s und" Points "bis 5000.
8. Verwenden Sie das wiederholen Box und stellen Sie die Anzahl der Wiederholungen, die wir normalerweise verwenden 9 und 13 Wiederholungen für Puffer-und Quencher läuft, bzw..
9. Wasserbadtemperatur auf 25 ° C eingestellt werden, die Temperatur sollte in der SX-Software überwacht werden.
10. Legen Sie das Laufwerk Volumen bis 120 ul, was bedeutet, dass jedes Mal, wenn das Gerät eine Probe läuft, mischt er 60 &mgr; l von jeder der zwei Spritzen. Mit dieser instrumentalen Setup, gibt einen 120 ul Volumen einer Totzeit von ≈ 1,2 ms.
11. Passen Sie die Hochspannung (Gewinn) aus dem Fluoreszenz-Detektor für die Ameisen-Liposom-Ausgang auf rund 8 sein. Für einen Standard-experimentelle Mischung der Gewinn sollte 400-420 V. Einige Medikamente sind fluoreszierend, so dass sie sich das Fluoreszenzsignal zu sättigen. In diesen Fällen sollten die Gewinn / Spannung verringert werden.
12. Legen Sie immer das fluoreszierende Probe in der linken Spritze und Puffer / Löscher in die richtige Spritze. Stellen Sie sicher, gründlich vortexen alle Proben mit Liposomen vor dem Laden, und sich bewusst sein, dass die LUVs mit der Zeit wird in die Spritze zu begleichen.

4. Ein Experiment

1. Bereiten Sie eine Probe von ANTS-geladen LUVs entweder mit Lösungsmittel oder Verbindung, und laden Sie in die Spektrofluorometer entweder zusammen mit Na-Puffer oder Tl-Löscher (50 mM TlNO _3, 94 mm NaNO _3, 10 mM HEPES bei pH 7,0).
2. Verwenden Sie 1,5 ml verdünnt ANTS-LUV-Lösung, mit oder ohne Gramicidin, vorbereitet vom Vortag.
3. Fügen Sie die Verbindung in der gewünschten Konzentration oder das Lösungsmittel für die Kontrollen. Halten Sie die Lösemittelkonzentration auf ein Minimum und konstant über alle Proben. Die Konzentrationen müssen bei jedem neuen (unbekannten) Verbindung eingestellt werden, um die gewünschte Dosis-Wirkungs-Bereich zu erreichen. Inkubieren für 10 min bei 25 ° C im Dunkeln.
4. Vortex die LUV Probe und Last in der linken Spritze. Laden Sie die Na-Puffer oder Tl-Löscher in die richtige Spritze.
5. Gründlich entfernen Luftblasen aus beiden Proben, indem Sie die Spritzen hin und her.
6. Achten Sie darauf, beide Spritzen gleichermaßen vor dem Schließen der Ventile geladen. Ungleiche Belastung wird in der Vor-Mischen von Lösungen führen, bevor sie die Aufnahme Kammer zu erreichen.
7. Zum ersten Probe, Aufzeichnung der Fluoreszenz mit Na-Puffer, 4-mal wiederholen, stellen Sie die Hochspannung (Gewinn) wie nötig, und wiederholen Sie 5 mal.
8. Für die restlichen Proben, Record 9 wiederholt mit Na-Puffer.
9. Ersetzen Sie den Na-Puffer mit dem Tl-Quencher und Datensatz 13 Wiederholungen.
10. Mit Wasser abspülen und weiter mit der nächsten Probe. Als Kontrollen verwenden wir Proben mit: no Gramicidin und mit Lösungsmittel, keine Gramicidin und mit der maximalen Konzentration der Verbindung, sowohl mit Gramicidin und Lösungsmittel.

5. Analysieren von Daten

1. Übertragen Sie die Ergebnisse der Analyse-Computer. Lesen Sie alle Daten in MATLAB zur Analyse. Für jede Probe in all den Puffer und Quencher wiederholt zu lesen, ohne die ersten vier in jedem Fall, wie die Vermischung Artefakte enthalten. Ausgehend von einem Laufwerk Volumen von 120 ul dauert es ein bisschen weniger als vier Schüsse ganz klar aus der vorherigen Mischung aus der Stopped-Flow-Schlauch.
2. Der Puffer wiederholt sich für alle Proben sollten sehr ähnlich sein. Wenn es eine deutliche Verschiebung in der Fluoreszenz-Signal, das auf der Konzentration der Verbindung hängt, dann ist die Verbindung selbst kann fluoreszierenden und kann es notwendig sein, zuerst subtrahieren diese zusätzliche Fluoreszenzsignal vor der Normalisierung der Proben.
3. Manuell über die Spuren zu gehen und zu entfernen "schlechte" wiederholt: wiederholt mit Spikes oder Abweichungen von multi-Exponentialität durch Mischen Artefakte und / oder Blasen.
4. Normalisieren der Quencher wiederholt, um die durchschnittliche Startwert des Puffers wiederholt sich für jede Probe. Kombinieren Mittelwerte aller Proben in einem Diagramm zur Visualisierung.
5. Traces ohne Gramicidin aufgezeichnet sollten alle ähnlich und zeigen fast keine Fluoreszenzlöschung, es kann eine langsame Reduktion der Fluoreszenz-Signal durch Leckage von Tl ⁺ langsam durch die Vesikel-Doppelschicht 8 sein. Wenn die Probe ohne Gramicidin und kein Modifikator zeigt deutliche Abschreckung, dann die Bläschen haben sich verschlechtert und sollte nicht weiter verwendet werden. Wenn die Proben ohne Gramicidin aber mit dem Modifikator signifikante Abschrecken zeigen, dann ist die Modifier stört die Vesikel-Doppelschicht in einem solchen Ausmaß, dass sie das Fluorophor oder Quencher der Doppelschicht Kreuz ermöglicht.
6. Wenn die Verbindung ändert Lipiddoppelschicht Eigenschaften, wie spürte von Gramicidin-Kanäle wird die Fluoreszenz Zeitverlauf sichtbar verändert werden.
7. Für jede Probe eine gestreckte Exponentialfunktion zB ⁴⁾ ist die erste 2-100 ms der normierten Fluoreszenzlöschung Kurve der einzelnen Wiederholungen und die Rate fit ⁴berechnet auf 2 ms. Mittelwerte und Standardabweichungen sind für eine gegebene Probe von allen den einzelnen Wiederholungen berechnet.
8. Schließlich bestimmen die relative Änderung in Abschreckgeschwindigkeit durch die Normalisierung auf den nächsten Kontrollprobe in der Zeit, dass Gramicidin und kein Modifier hat.

6. Repräsentative Ergebnisse

Abbildung 1: Die Grundlagen der Fluoreszenz löschen-basierter Assay, um Änderungen in Lipiddoppelschicht Eigenschaften erkennen Oben links:. Ein Zoom-in auf einem einzigen Lipidvesikel mit Ameisen und NaNO ₃ auf der Innenseite und NaNO ₃ plus TlNO ₃ auf der Außenseite. Oben rechts: Die Fluoreszenz-Signal aufgezeichnet Verwendung (Formular oben nach unten) ANTS-Vesikel ohne Quencher, mit Löscher, mit Quencher und pre-dotiert mit 87, 260 und 780 nm Gramicidin. Unten: Schematische Darstellung der Stopped-Flow-Mischkammer.

Abbildung 2: A-Bildschirm aus dem Pro-Data SX-Software, welche die verschiedenen Panels in der Beschreibung des Versuchsaufbaus verwiesen erschossen.

Abbildung 3:. Multiple wiederholen Bestimmungen des Fluoreszenzsignals von ANTS-geladen LUVs mit Na-Puffer Die ersten vier Wiederholungen sind grundsätzlich ausgeschlossen, da sie Mischen Artefakte enthalten. Der Schlauch verbindet die Probe Spritzen der Mischzelle haben ein definiertes Volumen, also die ersten paar Wiederholungen geben uns eine Lesart dessen, was vorher in den Schlauch: Wasser für Repeat 1 und 2, eine Kombination von Wasser und Probe zu wiederholen 3, meist Probe wiederholen 4, und nur Probe für die verbleibenden Wiederholungen.

Abbildung 4:. Multiple wiederholen Bestimmungen des Fluoreszenzsignals von ANTS-geladen LUVs mit Na-Puffer und mit Tl-Quencher Die ersten vier Wiederholungen wurden von beiden Bedingungen wurden entfernt. Zusätzlich für die Tl-Quencher Messungen wiederholen 8 muss durch Artefakte, wahrscheinlich Luftblasen entfernt werden.

. Abbildung 5: Wirkung von Capsaicin (Cap) an den zeitlichen Verlauf der ANTS Fluoreszenzlöschung (A) Normalisierte Fluoreszenzsignal über 1 s, bezeichnen graue Punkte Ergebnisse aus allen Wiederholungen (n> 5 pro Bedingung); roten Linien bezeichnen den Mittelwert aller Wiederholungen. (B) Die ersten 100 ms, bezeichnen graue Punkte ergibt sich aus einer einzigen Wiederholung für jede Bedingung, roten Linien sind exponentielle passt (von 2 bis 100 ms) gestreckt, um die Wiederholungen. Die gestrichelte blaue Linie zeigt die 2 ms markieren, zu welchem ​​Zeitpunkt die Rate der Abschreckung bestimmt wird. In beiden A und B die obere Kurve zeigt die Ergebnisse in der Abwesenheit von Tl ^+, der nächsten zwei Spuren zeigen die Ergebnisse in der Abwesenheit von gA, mit Tl ⁺ ± Cap; die vier unteren Spuren zeigen die Ergebnisse mit 260 nM gA und Tl ^+, wo Die Zahlen bedeuten [Cap] in uM. Die Preise der Abschreckung für 0, 10, 30 und 90 uM Cap, als durch die Geschwindigkeit der eine gestreckte Exponentialfunktion bestimmt, 36 ± 6, 69 ± 6, 85 ± 8 und 247 ± 27 (Mittelwert ± Standardabweichung, n> 8) bzw..

Wir haben eine schnelle Fluoreszenz-basierter Assay für die Bestimmung der Doppelschicht Änderung Potential von Medikamenten und anderen kleinen Amphiphile demonstriert. Verbindungen, die Doppelschicht Eigenschaften zu verändern dürften membrane protein-Funktion in eine indirekte, unspezifische Art und Weise verändern, möglicherweise einen Beitrag zur "off-target" Arzneimittelwirkungen. Der Test nutzt die Leistung von Gramicidin Kanäle als Sonden für die Veränderungen in Doppelschicht Eigenschaften ^12, die durch Transmembrandomänen Proteine ​​erfasst werden. Die Ergebnisse unter Verwendung der Fluoreszenz-basierter Assay sind in guter Übereinstimmung mit den Ergebnissen von Single-Channel-gA Experimente ^12, darauf hinweist, dass diese Methode für mechanistische Studien können sowie für das Screening von Substanzbibliotheken eingesetzt werden. Mit der vorliegenden Konfiguration des Tests können wir Dutzende von Verbindungen pro Tag, das Eins-zu-zwei Größenordnungen höheren Durchsatz als möglich ist, mit dem Single-Channel-Ansatz zu testen. Es gibt keine fundamentalen geschwindigkeitsbestimmenden Schritte in der Fluoreszenz-basierter Assay, was bedeutet, dass es erweitert werden kann, um in echter High-Throughput-Modus ausgeführt werden. Es ist möglich, den Test der Elektrolyt-Lösungen variieren und / oder die Verwendung verschiedener Lipid-Zusammensetzung für die LUVs ". Es ist erwähnenswert, dass einige Lipidzusammensetzungen trennen kann, wenn sie getrocknet, erfordert rasche Lösungsmittelaustausch Systeme statt Trocknung / Hydratation Schritte ^7.

Es bleibt unklar, ob es einen kausalen Zusammenhang zwischen steigender Lipophilie der Droge führt und zunehmende Fluktuation in der Medikamentenentwicklung ^10,11,17, und wenn ja, was sind die zugrunde liegenden Mechanismus (s)? Dennoch, da Membranproteine ​​durch Veränderungen in ihrer Membran-Umgebung ² geregelt werden neigen, wäre es klug, zu testen, ob amphiphilen Drogen und führt einschlägigen Lipiddoppelschicht Eigenschaften zu verändern, und wenn ja, in welcher Konzentration? Amphiphile Adsorption an die Lipid-Doppelschicht wird zum Abbau der wässrigen Phase, so dass die entsprechenden Konzentration ist die freie Konzentration in der wässrigen Phase, die um Größenordnungen kleiner als die nominale Konzentration im System, zB ^6,9,16 werden kann. Wenn ein Molekül ist erwünscht (biologischen) Wirkungen bei Konzentrationen auftreten, wo es Doppelschicht Eigenschaften verändert, ist es wichtig wird, um zwischen den "non-specific" zu unterscheiden, Doppelschicht-vermittelte Veränderungen in membrane protein-Funktion, auf direkte Effekte durch (hohe Affinität gegenüber ) Bindung an eine oder mehrere Zielproteine. Die Kenntnis der Doppelschicht-modifizierende Neigung eines Medikaments führen, über herkömmliche High-Throughput-Screening entdeckt wurde, ist daher wahrscheinlich für Entscheidungen in Bezug auf seine weitere Entwicklung wichtig.

Jede amphiphile irgendwann Konzentration verändern einige Doppelschicht Eigentum. Wichtige Überlegungen daher zu werden: in welcher Konzentration, und sind die Änderungen in Doppelschicht Eigenschaften spürte durch (Transmembrandomänen) Membranproteine? Hier nutzen wir die Fähigkeit von Gramicidin, um Kanäle nach Transbilayer Dimerisierung ¹⁵ bilden. Das macht sie als Sonden für die energetische Kopplung zwischen Lipid-Doppelschichten und Doppelschicht-embedded-Proteine ​​und für die Erkundung, ob kleine Moleküle Doppelschicht Eigenschaften, die durch Membranproteine ​​abgetastet werden zu ändern. Der Test ist schnell, zuverlässig und skalierbar und eignet sich daher sowohl für biophysikalische Studien und für das Screening von Substanzbibliotheken für Medikamente mit potenziellen Doppelschicht-Störwirkung.

Für weitere Informationen über den Test, Überprüfung des Tests die Wirksamkeit, und Vergleich mit dem Single-Channel-Elektrophysiologie sehen ^12.

Wir danken Michael J. Bruno, Radda Rusinova und Jon T. Sack für viele anregende Diskussionen. Finanzielle Unterstützung von NIH, R01GM021342 und ARRA ergänzen R01GM021342-35S1 und die Josiah Macy, Jr. Foundation OSA, die Tri-I CMB-Programm für HII, und die Iris L. und Leverett S. Woodworth Medical Scientist Fellowship und NIH MSTP gewähren GM07739 für RK.