Gramicidine basée Assay fluorescence; pour déterminer le potentiel de petites molécules pour modifier les propriétés bicouche lipidique

Nous introduisons une vitesse basées sur la fluorescence de dosage qui surveille le taux de la trempe de fluorescence comme une mesure de l'activité du canal gramicidine. Les canaux de gramicidine sont utilisés comme capteurs de force moléculaire pour surveiller les changements dans les propriétés de bicouche lipidique telle que détectée par des protéines bicouche couvrant.

Beaucoup de médicaments et d'autres petites molécules utilisées pour moduler la fonction biologique sont des amphiphiles qui s'adsorbent à l'interface bicouche / solution et ainsi modifier les propriétés bicouche lipidique. Ceci est important car les protéines membranaires sont énergétiquement couplées à leur hôte en bicouche interactions hydrophobes. Les changements dans les propriétés bicouche ainsi modifier la fonction des protéines membranaires, qui offre un moyen indirect pour amphiphiles pour moduler la fonction des protéines et un mécanisme possible pour "hors cible" effets des médicaments. Nous avons déjà développé un essai électrophysiologique pour détecter des changements dans les propriétés de bicouche lipidique utilisant des canaux de gramicidine linéaires comme sondes ^3,12. Canaux gramicidine sont des mini-protéines formées par la dimérisation de deux transbilayer non-conductrice sous-unités. Ils sont sensibles aux changements dans leur environnement membranaire, ce qui les rend puissants sondes pour surveiller les changements dans les propriétés de bicouche lipidique telle que détectée par des protéines bicouche couvrant. Nous avons maintenant la preuve un dosage par fluorescence pour détecter des changements dans les propriétés bicouche en utilisant les mêmes canaux que les sondes. Le dosage est basé sur la mesure de l'évolution temporelle de la trempe de fluorescence de fluorophores chargés vésicules unilamellaires grande partie grâce à l'entrée d'un désactiveur à travers les canaux de gramicidine. Nous utilisons la fluorescence indicateur / désactiveur paire 8-aminonaphtalène-1 ,3,6-trisulfonate (ANTS) / Tl ⁺ qui a été utilisé avec succès dans d'autres dosages extinction de la fluorescence ^5,13. Tl ⁺ imprègne la bicouche lipidique lentement ⁸ mais traverse aisément la réalisation des canaux de gramicidine ^1,14. La méthode est évolutive et adaptée pour les deux études mécanistes et criblage à haut débit de petites molécules pour la bicouche de perturbations, et le potentiel "hors cible", les effets. Nous constatons que les résultats en utilisant cette méthode sont en bon accord avec les précédents résultats électrophysiologiques ^12.

1. Générer ANTS-remplie liposomes

1. Au jour 1, éliminer le solvant organique à partir des lipides.
2. Retirer du congélateur lipides et laisser s'équilibrer à température ambiante.
3. Ajouter 0,6 mL de 25 mg / ml (1,2-dierucoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine) des lipides dans une solution de chloroforme dans une fiole de 25 ml à fond rond.
4. Continuellement faire tourner la fiole pendant le séchage sous azote, jusqu'à ce que tous le chloroforme a évaporé et une fine pellicule blanche de couches de lipides toute la moitié inférieure de la fiole.
5. Sec dans un dessiccateur sous vide pendant une nuit.

1. Le jour 2, préparation de l'échantillon avec le fluorophore qui sera incorporé dans les vésicules.
2. Réhydrater dans 100 mM de NaNO _3, 25 mM ANTS (sel de Na), 10 mM d'HEPES. Utilisez HNO ₃ ou NaOH pour ajuster le pH à 7,0. Chaque molécule ANTS a 2 ⁺ Na, pour un total de 150 mM [Na ^+]. Ajouter 1,671 ml d'électrolyte pour obtenir une suspension à 10 mM de lipides.
3. Suspension de Parafilm et vortex à fond.
4. Protéger de la lumière de l'échantillon de papier aluminium et laissez-âge nuit à température ambiante.

1. Le Jour 3, faire de grandes vésicules unilamellaires et de supprimer tous les fluorophores de l'extérieur des vésicules.
2. Soniquer pendant 1 min dans un sonicateur de faible puissance.
3. Gel-dégel de l'échantillon 5-6 fois, avec à chaque fois 5 minutes sur la glace sèche et à 5 minutes de chaud (~ 50 ° C) de l'eau.
4. Extruder la suspension lipidique avec une mini-extrudeuse Avanti. Mettre en place le mini-extrudeuse avec un 0,1 um polycarbonate filtre et supports (voir le manuel extrudeuse pour les détails). Extruder la suspension avant et en arrière 21 fois de telle sorte que la suspension se termine sur la seringue opposée. Lorsque plusieurs lots sont extrudés, n'oubliez pas de charger des échantillons avec la même seringue. Lors de l'extrusion de la suspension lipidique trouble initial devrait devenir presque translucide (il sera toujours jaune due à la fluorophore ANTS). Si l'extrusion devient soudainement plus facile et moins de pression est nécessaire pour déplacer à travers le filtre, le filtre peut avoir rompu et devront être remplacés.
5. Retirer ANTS externes en exécutant la suspension extrudé sur une colonne de dessalage PD-10 en utilisant un protocole de gravité. Equilibrer la colonne avec 20-30 ml de Na-tampon (140 mM de NaNO _3, 10 mM d'HEPES, pH 7,0, n'oubliez pas d'utiliser HNO ₃ ou NaOH pour ajuster le pH). Ajouter 1,5 mL de la suspension lipidique extrudé à la colonne et laisser s'infiltrer po porter le volume total de l'échantillon à 2,5 ml par ajout de 1 mL de Na-tampon. Après le tampon est pleinement intégré dans la colonne et rien n'est fuites, éluer les liposomes avec 3 mL de Na-tampon et de recueillir l'échantillon résultant. L'ANTS résultant remplis LUV solution mère devrait contenir environ lipides 4-5 mm et apparaissent translucides blanc laiteux. Protéger l'échantillon de la lumière avec du papier.
6. Si la solution stock n'est pas utilisée immédiatement, stocker à 13 ° C pour un maximum de 7 jours. Attention: ne pas congeler ou refroidir la solution lipidique en dessous de son liquide à la température de transition cristal-phase (~ 12 ° C), car cela détruirait l'intégrité des vésicules »et le fluorophore va s'échapper.

2. Mélanger une solution de fluorescence

1. 24 heures avant d'utiliser, diluer les liposomes et incuber avec gramicidine (à 13 ° C). Équilibrage de gramicidine entre les monocouches les vésicules lipidiques 'intérieur et extérieur est un processus lent, exigeant une longue période d'incubation.
2. Bien tourbillons de l'ANTS rempli de solution stock LUV LUV comme avoir une densité> 1 g / ml et sera donc de sédiments dans les solutions.
3. Mélanger l'ANTS rempli LUV 01h20 stock dans Na-tampon. Mélanger tous les liposomes pour une utilisation en une seule journée d'expériences ensemble dans un flacon unique pour améliorer l'uniformité de l'échantillon.
4. Séparez 3 / 4 des liposomes et ajouter 260 nM pré-dilué dans le DMSO gramicidine (500 pg / mL).
5. Pour le 1 / 4, ajouter le même volume de DMSO (sans gramicidine) pour maintenir la concentration en solvant constante dans tous les échantillons.

3. Mise en place de l'instrument de fluorescence

1. Nous utilisons une Applied Photophysics SX.20 stopped-flow spectrofluorimètre avec contrôle de température pour mesurer le taux d'extinction de la fluorescence.
2. Tournez les instruments sur une heure à l'avance pour permettre l'échauffement. Les composants sont: ordinateur, unité de contrôle électronique, au bain-marie (à la fois froide et chauffage), l'alimentation de la lampe et réservoir d'azote.
3. Mettre en place les conditions d'enregistrement en utilisant le logiciel Pro-Data SX.
4. Régler la longueur d'onde d'excitation à 352 nm monochromateur et ouvertures largeur de fente pour une excitation à 1 / 1.
5. Utilisez un λ = 455 nm filtre passe-haut pour enregistrer l'émission.
6. Utilisez le "maintien en pression" réglage, qui permet à l'instrument pour maintenir la pression d'azote lors de l'enregistrement et empêche ainsi les oscillations de pression (et les artefacts d'enregistrement) pendant les premières millisecondes.
7. Réglez "Time "à 1 s et« Points »pour 5000.
8. Utilisez la boîte de répéter et d'ajuster le nombre de répétitions, nous utilisons normalement 9 et 13 répétitions pour le tampon et fonctionne quencher, respectivement.
9. Bain-marie de température doit être réglée à 25 ° C, la température doit être contrôlée dans le logiciel SX.
10. Réglez le volume du disque à 120 uL, ce qui signifie que chaque fois que l'instrument fonctionne un échantillon, il se mélange 60 pi de chacun des deux seringues. Avec cette configuration instrumentale, un volume 120 pi donne un temps mort de ≈ 1,2 ms.
11. Régler la haute tension (gain) sur le détecteur de fluorescence pour la sortie de l'ANTS-liposome pour être autour de 8. Pour un mélange norme expérimentale du gain devrait être de 400 à 420 V. Certains médicaments sont fluorescentes, de telle sorte qu'ils peuvent saturer le signal de fluorescence. Dans ces cas, le gain / tension doit être diminué.
12. Toujours charger l'échantillon fluorescent dans la seringue de gauche et de tampon / désactiveur dans la seringue droite. Assurez-vous de bien vortex tous les échantillons contenant des liposomes avant le chargement, et être conscient que la LUV avec le temps va s'installer dans la seringue.

4. Faire une expérience

1. Préparer un échantillon de fourmis chargées LUV soit avec un solvant ou composé, et charger dans le spectrofluorimètre avec soit Na-tampon ou Tl-désactiveur (50 mM TlNO _3, 94 mM de NaNO _3, 10 mM d'HEPES à pH 7,0).
2. Utiliser 1,5 mL dilué ANTS-LUV solution, avec ou sans gramicidine, préparé la veille.
3. Ajouter le composé à la concentration désirée ou le solvant pour les contrôles. Gardez la concentration en solvant à un minimum et constante à travers tous les échantillons. Les concentrations devront être ajustées avec toute nouvelle (nom inconnu) composé à atteindre les résultats souhaités dose-réponse gamme. Incuber pendant 10 min à 25 ° C dans l'obscurité.
4. Vortex, le LUV échantillon et la charge dans la seringue à gauche. Chargez le Na-tampon ou Tl-désactiveur dans la seringue droite.
5. Bien éliminer les bulles d'air des deux échantillons en poussant les seringues avant en arrière.
6. Assurez-vous que les seringues sont chargés aussi avant de fermer les vannes. Charge inégale se traduira par de pré-mélange de solutions avant qu'ils n'atteignent la chambre d'enregistrement.
7. Pour l'échantillon de toute première fois, enregistrer la fluorescence avec Na-tampon, répéter 4 fois, régler la haute tension (gain) que nécessaire, et répétez 5 fois.
8. Pour les échantillons restants, fiche 9 répète avec Na-tampon.
9. Remplacer le Na-tampon avec l'extincteur et Tl-record de 13 répétitions.
10. Rincer à l'eau et continuer avec l'échantillon suivant. Comme les contrôles que nous utilisons des échantillons avec: pas de gramicidine et de solvant, pas de gramicidine et avec la concentration en composés au maximum, à la fois avec la gramicidine et de solvant.

5. Analyse des données

1. Transfert des résultats à l'ordinateur d'analyse. Lire toutes les données dans MATLAB pour l'analyse. Pour chaque échantillon, lue dans toutes les tampons et répète quencher, excluant les quatre premiers dans chaque cas, comme ceux contenant des artefacts de mélange. En supposant un volume d'entraînement de 120 uL cela prend un peu moins de quatre coups de complètement vider le mélange précédent de la tubulure stopped-flow.
2. Les répétitions de tampon pour tous les échantillons devraient être très similaires. S'il ya un changement important dans le signal de fluorescence, qui dépend de la concentration en composés, puis le composé lui-même peut être fluorescent et il peut être nécessaire d'abord de soustraire ce signal supplémentaire fluorescence avant la normalisation des échantillons.
3. Manuellement passer par les traces et de supprimer le «mauvais» répète: répète contenant des pointes ou des écarts par rapport aux multi-exponentiel en raison d'artefacts de mélange et / ou des bulles.
4. Normaliser les répétitions désactiveur à la valeur moyenne de départ de la mémoire tampon se répète pour chaque échantillon. Combinez les moyennes de tous les échantillons dans un graphique pour la visualisation.
5. Traces enregistrées sans gramicidine devraient tous être semblables et montrent presque aucune extinction de la fluorescence; il peut y avoir une réduction lente du signal de fluorescence due à la lenteur des fuites de Tl ⁺ à travers la bicouche des vésicules 8. Si l'échantillon sans gramicidine et aucun modificateur montre trempe importantes, puis les vésicules se sont détériorées et ne doivent pas être utilisés plus loin. Si les échantillons ne présentant aucune gramicidine, mais avec le modificateur montrent trempe significatif, alors le modificateur perturbe la bicouche des vésicules à un point tel qu'il permet le fluorophore ou désactiveur de traverser la bicouche.
6. Si le composé altère les propriétés bicouche lipidique, telle que détectée par les canaux de gramicidine, le cours du temps de fluorescence sera visiblement altérée.
7. Pour chaque échantillon, une exponentielle étirée par exemple ⁴⁾ est apte à la première de 200 à 100 ms de la courbe de la trempe de fluorescence normalisée de l'individu répète et le taux ⁴calculé à 2 ms. Moyennes et écarts-types sont calculés pour un échantillon donné de tous les répétitions individuelles.
8. Enfin, déterminer la variation relative des taux d'étancher en normalisant à l'échantillon de contrôle le plus proche dans le temps qui a gramicidine et aucun modificateur.

6. Les résultats représentatifs

Figure 1: L'essentiel de la fluorescence étancher basé test pour détecter les changements dans les propriétés de bicouche lipidique haut à gauche:. Un zoom sur une vésicule lipidique unique avec l'ANTS, plus NaNO ₃ à l'intérieur et NaNO ₃ plus TlNO ₃ à l'extérieur. En haut à droite: Le signal de fluorescence enregistrées à l'aide (sous forme de haut en bas) ANTS-remplie vésicules sans quencher, avec quencher, avec extincteur et pré-dopé avec 87, 260 et 780 nm gramicidine. En bas: Représentation schématique de la chambre de mélange stopped-flow.

Figure 2: Une photo d'écran du logiciel Pro-Data SX illustrant les différents panneaux référencé dans la description du dispositif expérimental.

Figure 3:. Déterminations répétées multiples du signal de fluorescence des fourmis-chargé LUV avec Na-buffer Les quatre premières répétitions sont toujours exclus, car ils contiennent des artefacts de mélange. La tubulure reliant les seringues échantillon à la cellule de mélange ont un volume défini, donc le répète quelques premières va nous donner une lecture de ce qui était auparavant dans le tube: l'eau pour la répétition de 1 et 2, une combinaison d'eau et de l'échantillon pour répéter 3, la plupart de l'échantillon pour répéter 4, et seulement de l'échantillon pour les répétitions restantes.

Figure 4:. Déterminations répétées multiples du signal de fluorescence des fourmis-chargé LUV avec Na-tampon et TL-désactiveur Les quatre premières répétitions ont été retirés de ces deux conditions. De plus, pour les mesures Tl-quencher, répétez 8 doit être retiré en raison d'artefacts, des bulles d'air le plus probable.

. Figure 5: Effet de la capsaïcine (PAC) sur le cours du temps de la trempe de fluorescence ANTS (A) normalisé signal de fluorescence plus de 1 s, des points gris dénotent les résultats de toutes les répétitions (n> 5 par condition); lignes rouges indiquent la moyenne de tous répète. (B) La première tranche de 100 ms, des points gris dénotent les résultats d'une répétition unique pour chaque condition; lignes rouges sont étirés s'adapte exponentielle (2 - 100 ms) à ceux répète. La ligne pointillée bleue représente la marque de 2 ms, l'heure à laquelle le taux d'extinction est déterminé. Dans les deux A et B et la trace du haut montre des résultats en l'absence de Tl ^+; les deux prochaines traces montrent des résultats en l'absence de GA, avec Tl ⁺ Cap ±; les quatre traces inférieures montrent des résultats avec 260 nM de gA et Tl ^+, où les chiffres dénotent [Cap] en uM. Le taux de la trempe de Cap uM 0, 10, 30 et 90, tel que déterminé par le taux d'une exponentielle étirée, sont de 36 ± 6, 69 ± 6, 85 ± 8 et 247 ± 27 (moyenne ± SD, n> 8) , respectivement.

Nous avons démontré un rapide test basées sur la fluorescence pour déterminer le potentiel de modifier bicouche de médicaments et d'autres petites amphiphiles. Les composés qui modifient les propriétés bicouche sont susceptibles d'altérer la fonction des protéines membranaires dans une indirecte, de manière non spécifique, qui peut contribuer à "hors cible" effets des médicaments. Le test exploite la puissance des canaux gramicidine tant que sondes pour des changements de propriétés bicouche ¹² qui sont perçues par bicouche transmembranaire des protéines. Les résultats obtenus en utilisant le test basées sur la fluorescence sont en bon accord avec les résultats d'expériences gA mono-canal ^12, ce qui indique que cette méthode peut être utilisée pour des études mécanistiques ainsi que pour les bibliothèques de composés de dépistage. Utilisation de la configuration actuelle de l'essai, nous pouvons tester des dizaines de composés d'une journée, ce qui est de un à deux ordres de grandeur que le débit plus élevé possible en utilisant le canal unique approche. Il n'y a pas fondamentale étapes limitantes dans le test basées sur la fluorescence, ce qui signifie qu'il peut être étendu à courir dans le vrai haut-débit en mode. Il est possible de faire varier le dosage des solutions d'électrolytes et / ou d'utiliser la composition lipidique différente pour le LUV ». Il est à noter que certaines compositions lipidiques peut séparer une fois séchés, nécessitant rapidement des systèmes d'échange de solvant au lieu du séchage / hydratation étapes ^7.

On ignore encore s'il ya une relation causale entre l'augmentation de la lipophilie des pistes de médicaments et l'augmentation de l'attrition dans le développement de médicaments ^10,11,17 et, si oui, quels sont les mécanismes sous-jacents (s)? Néanmoins, parce que les protéines membranaires ont tendance à être réglementée par des changements dans leur environnement membranaire ^2, il serait prudent de vérifier si les médicaments amphiphiles et mène des médicaments modifient les propriétés pertinentes bicouche lipidique, et si oui, à quelles concentrations? Amphiphile adsorption à la bicouche lipidique sera appauvrissent la phase aqueuse, donc la concentration pertinente est la concentration libre dans la phase aqueuse qui peut être des ordres de grandeur inférieure à la concentration nominale dans le système, par exemple, ^6,9,16. Si une molécule désirée (biologiques) les effets se produisent à des concentrations où il modifie les propriétés bicouche, il devient important de distinguer entre les «non spécifiques», bicouche médiée par des changements dans la fonction des protéines membranaires, par opposition aux effets directs dus à (à haute affinité ) se liant à une ou plusieurs protéines cibles. Connaissant la propension bicouche modificateur d'une avance de drogue, découverts via conventionnels criblage à haut débit, est donc susceptible d'être important pour les décisions concernant son développement futur.

Toute amphiphile va à une certaine concentration modifier une propriété quelconque bicouche. Les principales considérations deviennent donc: à quelle concentration, et sont les changements dans les propriétés bicouche détectée par (bicouche-spanning) des protéines membranaires? Ici, nous exploiter la capacité de gramicidine pour former des canaux par dimérisation transbilayer ^15. Cela fait d'eux des sondes utiles pour le couplage énergétique entre les bicouches lipidiques et des protéines bicouche-intégrés, et pour explorer si petites molécules modifient les propriétés bicouche qui sont perçues par les protéines membranaires. Le test est rapide, fiable et évolutive, et donc adapté à la fois les études biophysiques et pour le dépistage des bibliothèques de composés pour les médicaments à fort potentiel de perturber bicouche-effets.

Pour plus d'informations sur le dosage, la vérification de l'efficacité du test, et la comparaison avec l'électrophysiologie monocanal voir ^12.

Nous tenons à remercier Michael J. Bruno, Radda Rusinova et Jon T. Sack pour de nombreuses discussions stimulantes. Le soutien financier du NIH, et de l'ARRA R01GM021342 complément R01GM021342-35S1, et la Josiah Macy Jr. Foundation pour l'OSA, le Tri-I Programme des OHC pour HII et L. Les Iris et Leverett S. Woodworth Scientifique médical bourses et subventions du NIH MSTP GM07739 pour RK.