그램이시딘 기반의 형광 분석, 지질 이중층의 속성을 수정하는 작은 분자 잠재 결정

우리는 그램이시딘 채널 활동의 조치로 형광 담금질의 속도를 모니터링 빠른 형광 기반의 분석을 소개합니다. 그램이시딘 채널 지질 이중층 속성의 변화로 이중층 스패닝 단백질에 의해 감지를 모니터링하는 분자 힘 변환기로 사용됩니다.

생물 학적 기능을 조절하는 데 사용되는 많은 약물 및 다른 작은 분자는 이중층 / 솔루션 인터페이스에서, 따라서 adsorb은 지질 이중층의 속성을 변경되는 amphiphiles 있습니다. 막 단백질은 소수성 상호 작용을 정력적으로 자신의 호스트 이중층에 결합되기 때문에 이것은 중요합니다. 이중층 등록 정보에 변경 따라서 단백질 기능 및 "오프 대상"약물 효과에 대한 가능한 메커니즘을 조절하는 amphiphiles에 대한 간접적인 방법을 제공 막 단백질 기능을 변경할 수 있습니다. 우리는 이전에 프로브 ^3,12과 같은 선형 그램이시딘 채널을 사용하여 지질 이중층 등록 정보에서 변경을 검출 electrophysiological 분석을 개발했습니다. 그램이시딘 채널은 두 아닌 수행 subunits의 transbilayer dimerization에 의해 형성 미니 단백질입니다. 그들은 지질 이중층 등록 정보 모니터링 변화를위한 강력한 프로브과 같이 이중층 스패닝 단백질에 의해 감지하게 자신의 멤브레인 환경의 변화에​​ 민감합니다. 우리는 지금 프로브와 같은 채널을 사용하여 이중층 속성의 변화를 검출 형광 분석을 보여줍니다. 분석은 그램이시딘 채널을 통해 끄는의 항목으로 인해 형광단 - 로드된 대형 unilamellar vesicles에서 형광의 담금질의 시간 코스를 측정을 기반으로합니다. 우리는 형광 표시 / 빛 따위를 끄는 쌍을 사용하여 8 aminonaphthalene - 1 ,3,6 - trisulfonate (개미) / TL ⁺ 성공적으로 다른 형광 담금질의 assays ^5,13에서 사용되었는지. TL ^{+ 천천히 8} 지질 이중층을 permeates하지만 그램이시딘 채널 ^1,14를 실시를 통해 쉽게 전달합니다. 방법은 기계론의 연구와 이중층 - perturbing하고, 잠재적인 "오프 대상"효과에 대한 작은 분자의 높은 처리량 검사를 모두 확장하고 적합합니다. 우리는이 방법을 사용하여 결과를 이전 electrophysiological 결과 ¹² 좋은 계약에다는 것을 찾을 수 있습니다.

1. 개미 채워진 Liposomes를 생성

1. 1 일에, lipids에서 용매 유기를 제거합니다.
2. 냉동실에서 지방질을 제거하고 실내 온도 평형하자.
3. 25 MG / ML의 0.6 ML (1,2 - dierucoyl - SN - glycero - 3 - phosphocholine) 25 ML 라운드 바텀 플라스크에 클로로포름 용액에 지방질을 추가합니다.
4. 모든 클로로포름이 증발 및 지질 코팅 술병의 전체 아래쪽의 얇은 흰색 필름 때까지, 질소 하에서 건조하는 동안 지속적으로 휴대용 술병을 돌린다.
5. 하룻밤 진공 아래 dessicator에서 건조.

1. 일 2, vesicles에 통합 될 형광단와 샘플을 준비합니다.
2. 100 MM 나노 _3, 25 MM 개미 (나 소금), 10 MM HEPES에 Rehydrate. 7.0 산도를 조정하는 HNO ₃ NaOH를 사용합니다. 각각의 개미 분자 150 MM 총 2 나 ^+를 가지고 [나 ^+]. 10 MM의 지질 정지를 얻을 전해액의 1.671 ML을 추가합니다.
3. 철저하게 Parafilm 및 와동 정지.
4. 호일로 빛을에서 샘플을 보호하고 하룻밤 실온에서 나이를 보자.

1. 3 일에, 대형 unilamellar vesicles를 만들어 vesicles 외부에서 모두 형광단를 제거합니다.
2. 저전력 sonicator 1 분 Sonicate.
3. 동결 - 해동 샘플 5-6 시간, 드라이 아이스에 5 분, 따뜻한 (~ 50 ° C) 물에 5 분마다.
4. 아반티 미니 압출기를 사용하여 지질 현탁액을 돌출. 0.1 μm의 폴리 카보 네이트 필터 및 필터 지원 (자세한 내용은 압출기 설명서를 참조) 미니 압출기를 설정합니다. 앞뒤 정지가 반대 주사기에 끝이 같은 21 번 정학을 돌출. 여러 배치가 압출 때, 항상 같은 주사기로 샘플을로드해야합니다. 압출 동안 흐린 초기 지질 서스펜션은 (아직 인해 개미의 형광단에 노란색됩니다) 거의 반투명 될 것입니다. 압출 갑자기 쉽게되고 낮은 압력이 필터를 통해 이동하는 데 필요한 경우, 필터는 파열있을 수 및 교체해야합니다.
5. 중력 프로토콜을 사용 PD - 10 탈염 칼럼을 통해 압출 정지를 실행하여 외부 개미를 제거합니다. 나 - 버퍼의 20-30 ML와 열 평형 (140 MM 나노 _3, 10 MM HEPES, pH를 7.0, 산도를 조정하는 HNO ₃ NaOH를 사용해야합니다.) 그 결과 해당 컬럼에 대한 압출 지질 정지의 1.5 ML를 추가하고 1 ML 나 버퍼를 추가하여 2.5 ML 샘플의 전체 볼륨을 가지고 인치 침투하자. 버퍼가 완전히 열에 통합되고 아무것도 밖으로 누출되지 않습니다 후에 나 - 버퍼 3 ML과 liposomes을 elute 및 결과 샘플을 수집합니다. 채워진 결과 개미 주식 솔루션 4-5 MM의 lipids에 대한 포함하고 반투명 유백 색의 흰색 나타납니다 LUV. 호일과 빛의에서 샘플을 보호합니다.
6. 13 주식 솔루션은 즉시 사용하지 않을 경우, 저장 ° 칠일의 최대 C. 경고 : 고정 또는 크리스탈 상 전이 온도 (~ 12 ° C),이 vesicles '무결성을 파괴하고 형광단가 누출되므로 액체 아래 지질 솔루션을 냉각하지 않습니다.

2. 믹스 형광 솔루션

1. 24 시간 전에 사용 liposomes를 희석하여 (13 ° C에서) 그램이시딘와 부화. 지질 vesicles '내부와 외부 monolayers 사이 그램이시딘의 평균은 긴 부화가 필요 느린 과정이다.
2. 철저하게 와동 LUVs가 밀도> 1 G / ML이 같은 재고 솔루션을 LUV 개미 가득한 것이고, 따라서 침전 솔루션 인치
3. 믹스 개미 - 채워진 나 버퍼의 재고 1시 20분를 LUV. 샘플 균일성 향상을위한 하나의 플라스크에서 함께 실험 중 하나가 하루에 사용하는 모든 liposomes를 섞습니다.
4. liposomes 3 / 4 밖으로 분리하고 260 nm의 그램이시딘 DMSO에 미리 희석을 (500 μg / ML)을 추가합니다.
5. 하기 위해 1 / 4 모든 샘플의 용매 농도가 일정하게 유지하는 DMSO의 동일한 음량을 (그램이시딘없이) 추가 남아 있습니다.

3. 형광 악기 설정

1. 우리는 형광 담금질의 속도를 측정하기 위해 온도 제어 응용 Photophysics SX.20 중지 흐름 spectrofluorometer를 사용합니다.
2. 따뜻한 최대 허용 미리 시간에 악기를 켭니다. 구성 요소는 다음과 같습니다 컴퓨터, 전자 제어 장치, 물 욕조 (쿨러 및 히터 모두), 램프 전원 공급 장치 및 질소 탱크.
3. 프로 데이터 SX 소프트웨어를 사용하여 녹음 조건을 설정합니다.
4. 여기 일분의 일 수있는 단색의 여기 파장 352 nm의 및 슬릿 폭 apertures로 설정합니다.
5. 방출을 기록하기 = 455 nm의 높은 패스 필터 λ를 사용하십시오.
6. 녹음 중에 질소 압력을 유지하기 위해 악기를 가능하게하기 때문에 처음 몇 밀리초 동안 압력 oscillations (및 녹화 유물)를 방지 "압력 대기"설정을 사용합니다.
7. "티 세트나에게 5000 포인트 ""1 S하고. "
8. 반복 상자를 사용하여 반복의 수를 조정, 일반적으로 우리가 각각 버퍼와 끄는 프로그램 실행 9 13 반복을 사용합니다.
9. 물 목욕 온도가 25로 설정되어야 ° C; 온도 SX 소프트웨어에서 모니터해야합니다.
10. 때마다 악기, 샘플을 실행 그것이 두 개의 주사기 각 60 μL를 혼합 즉, 120 μL에 드라이브 볼륨을 설정합니다. 이 기기 설치와 함께, 120 μL 볼륨 ≈ 1.2 MS의 죽은 시간을 제공합니다.
11. 8 시경으로 개미 - 리포좀의 출력에 대한 형광 검출기에 고전압 (게인)을 조정합니다. 표준 실험 혼합물에 대한 이득은 400-420해야 V. 마약은 형광 그들이 형광 신호를 포화 수와 같은 수 있습니다. 이러한 경우에는 게인 / 전압은 감소한다.
12. 항상 오른쪽 주사기의 왼쪽 주사기 및 버퍼 / 끄는에 형광 샘플을로드합니다. 철저하게 와동에 있는지 확인합니다 모든 로딩하기 전에 liposomes가 포함된 샘플, 시간과 LUVs가 주사기에 정착됩니다 점에 유의하십시오.

4. 실험을하는

1. 와 개미 - 로드된 LUVs의 샘플을 준비 나 버퍼 또는 TL - 끄는 (50 MM TlNO _3, 94 MM 나노 _3, 산도 7.0 10 MM HEPES) 중 하나와 함께 spectrofluorometer에 용매 또는 화합물, 그리고 부하 ​​중 하나.
2. 1.5 ML 희석 사용 또는 그램이시딘없이 솔루션을 개미가 - LUV 전날 준비.
3. 원하는 농도의 화합물 또는 컨트롤에 대한 용매를 추가합니다. 모든 샘플에 걸쳐 최소 및 상수에 용매 농도를 유지. 농도 원하는 복용량 - 반응 범위를 달성하기 위해 새로운 (알 수 없음) 화합물로 조정해야합니다. 25 10 분 품어 ° C를 어둠에 약해.
4. 와동이 샘플을 LUV하고 왼쪽 주사기로로드합니다. 오른쪽 주사기로 나 버퍼 또는 TL - 끄는를로드합니다.
5. 철저하게 앞뒤로 주사기를 밀어 두 샘플에서 기포를 제거합니다.
6. 두 주사기가 밸브를 닫기 전에 마찬가지로로드되어 있는지 확인하십시오. 그들은 기록 챔버에 도달하기 전에 등한 로딩이 솔루션 미리 혼합 발생합니다.
7. 처음 샘플 들어, 나 버퍼로 형광을 기록 4 번 반복 필요한 높은 전압 (게인)을 조정하고, 5 번 반복합니다.
8. 나 - 버퍼 나머지 샘플, 기록 구 반복하십시오.
9. TL - 끄는 및 기록 13 반복과 나 버퍼를 교체하십시오.
10. 물로 씻어 다음 예제를 계속합니다. 용매와도 그램이시딘하고, 최대 화합물 농도와 노 그램이시딘과를 그램이시딘 및 용매 모두 : 우리가 샘플을 사용하지 컨트롤로.

5. 분석 데이터

1. 분석 컴퓨터에 결과를 전송합니다. 분석을위한 MATLAB으로 모든 데이터를 읽습니다. 이들은 혼합 유물을 포함하는 각 샘플의 경우, 각각의 경우에 처음 네 제외한 모든 버퍼와 끄는 반복에 참조하십시오. 그것이 완전히 정지 흐름 튜브에서 이전 혼합물을 취소하고 좀 덜보다 4 샷을 소요 120 μL의 드라이브 볼륨을 가정.
2. 모든 샘플에 대한 버퍼 반복은 매우 유사합니다. 화합물 농도에 따라 형광 신호에 상당한 변화가있다면 다음 화합물 자체는 형광 수 있으며 먼저 샘플을 정규화하기 전에 여분의 형광 신호를 뺄 필요가있을 수도 있습니다.
3. 수동으로 흔적을 통해 이동하여 "나쁜"반복 제거 : 혼합 유물 및 / 또는 거품에 의한 다중 exponentiality에서 스파이크 또는 편차를 포함하는 반복합니다.
4. 각 샘플에 대한 버퍼 반복의 평균 시작 값으로 끄는 반복을 정상화. 시각화를 하나의 그래프로 모든 샘플의 평균을 결합합니다.
5. 노 그램이시딘로 기록된 흔적은 유사하고 거의 형광 담금질을 보여주지해야한다 TL의 누출을 늦추기 위해 ⁺ vesicles 이중층 8 의한 형광 신호의 속도 감소가있을 수 있습니다. 노 그램이시딘없이 수정자와 함께 샘플 상당한 담금질가 표시되면 다음 vesicles이 악화하고 더 이상 사용할 수 없습니다. 노 그램이시딘로하지만 수정자와 샘플이 중요한 담금질을 보여주면, 수정자는 형광단이나 빛 따위를 끄는가 이중층를 건너 수 있습니다 그러한 정도로 vesicles의 이중층을 perturbs.
6. 화합물은 지질 이중층의 속성을 바꿀지도 모르겠어 경우로 그램이시딘 채널에 의해 감지, 형광 시간 과정은 가시 변경됩니다.
7. 각 샘플의 경우, 뻗어 지수 예 ⁴⁾ 각 반복의 표준 형광 담금질 곡선의 첫 번째 2-100 MS와 속도에 맞는 ⁴이 MS에서 계산. 평균 및 표준 편차는 모두 각각의 반복에서 주어진 시료에 대해 계산됩니다.
8. 마지막으로, 그램이시딘없이 수정자를 가지고 시간에 가장 가까운 제어 샘플을 정규화하여 담금질 속도의 상대적인 변화를 결정합니다.

6. 대표 결과

그림 1 : 형광 담금질 기반 분석의 요점은 지질 이중층 특성의 변화를 감지하기 위해 왼쪽 상단 :. 확대의 내부와 밖에서 나노 _{3 +} TlNO ₃ 개미 플러스 나노 ₃ 단일 지질 소포에. 오른쪽 상단 : 끄는 및 87, 260 및 780 나노미터 그램이시딘으로 미리 도핑된와 끄는 함께 끄는없이 (위에서 아래 양식) 개미 - 채워진 vesicles를 사용하여 기록 형광 신호. 하단 : 정지 흐름 혼합 챔버의 도식 표현.

그림 2 : 실험 설정의 설명에 언급된 다양한 패널을 보여주는 프로 데이터 SX 소프트웨어의 스크린 샷을.

그림 3 :.들이 혼합 유물을 포함하는 등 나 버퍼와 개미 -로드 LUVs에서 형광 신호의 여러 반복 결정은 처음 네 반복은 항상 제외됩니다. 혼합 세포에 샘플 주사기를 연결하는 튜브는 정의된 볼륨을 가지고, 따라서 처음 몇 반복은 우리에게 튜브 이전에 있었는지의 독서를 줄 것이다 : 물을 반복 1과 2를 반복합니다 3 물 샘플의 일부 조합에 대한 나머지 반복을위한 반복 4 단 샘플에 대한 대부분 샘플.

그림 4 :. 나 버퍼과 TL - 끄는와 개미 -로드 LUVs에서 형광 신호의 여러 반복 결정은 처음 네 반복이 두 조건에서 삭제되었습니다. 또한, TL - 끄는 측정, 유물, 가능성이 가장 높은 기포로 인해 제거 8 요구를 반복합니다.

. 그림 5 : 개미 형광 담금질의 시간 코스에 capsaicin (CAP)의 효과 (1) S 이상의 표준화 형광 신호, 회색 점들은 모든 반복 (N> 5 조건 당)의 결과를 나타내는, 빨간색 라인은 모두의 평균을 나타냅니다 반복합니다. (B) 처음 100 MS는 회색 점들은 각 조건에 대한 단일 반복의 결과를 나타내는, 빨간색 라인은 지수 맞는 (2-100 MS) 늘어 이들 반복을합니다. stippled 파란색 라인은 2 MS 마크 담금질의 속도가 결정됩니다되는 시간을 나타냅니다. A와 B 모두에서 최고의 추적 TL이없는 결과를 보여줍니다 ^+; 다음 두 자취는 TL과 함께, GA의 부재에서 결과를 표시 ⁺ ± 모자, 네 개의 낮은 흔적은 260 nm의 GA 및 TL ^+, 어디로 결과를 표시 번호 μm의의 [모자]를 상징. 로 늘어 지수의 속도에 의해 결정 0, 10, 30 90 μm의 모자, 위해 담금질의 가격 36아르 ± 6, 69 ± 6, 85 ± 8 247 ± 27 (± SD, N> 8을 의미) 각각.

우리는 마약과 기타 소형 amphiphiles의 이중층 수정 가능성을 판단하는 빠른 형광 기반의 분석을 증명하고있다. 이중층의 속성을 수정 화합물 가능성이 "오프 대상"약물 효과에 기여, 간접, 특이 현상이 방식으로 막 단백질 기능을 변경할 수있다. 분석은 이중층 - 스패닝 단백질에 의해 감지 아르 이중층 등록 정보의 변경 ¹² 프로브로 그램이시딘 채널의 전원을 이용. 형광 기반의 분석을 사용하여 얻어진 결과는이 방법이 아니라 심사 화합물 라이브러리와 같은 기계론의 연구에 사용될 수 있다고 나타내는 단일 채널 GA 실험 ¹² 결과와 좋은 계약에 있습니다. 우리가 단일 채널 접근법을 사용 가능한 크기보다 높은 처리량의 1 - 2 주문입니다 화합물 수십 일을 테스트할 수 분석의 현재 구성을 사용합니다. 더 근본이 없습니다 속도 - 제한 그것이 진정한 높은 처리량 모드에서 실행하도록 확장될 수 있습니다 즉, 형광 기반의 분석 단계가 있습니다. 분석의 전해질 솔루션을 다양 및 / 또는 LUVs '에 대해 다른 지질 성분을 사용하여 가능합니다. 그것은 가치가 건조하면 일부 지질 성분이 보습과 같이 ⁷ / 건조 대신 빠른 용매 교환 시스템을 필요로하는, 분리할 수 있다고 지적합니다.

그것은 그렇다면 기본 메커니즘 (들)은 무엇입니까, 약물 리드의 lipophilicity 증가 및 약물 개발 ^10,11,17의 마찰을 증가 사이에 인과 관계가 있는지 명확하지 일까? 그럼에도 불구하고, 멤브레인 단백질들이 막 ^환경이 변화에 의해 규제되는 경향이 있기 때문에, 어떤 농도에서, 그렇다면, amphiphilic 마약과 마약 리드는 관련 지질 이중층의 속성을 변경할 수 있는지 여부를 테스트하려면 신중한하고까요? 지질 이중층에 Amphiphile 흡착 따라서 관련 농도가 시스템에서 명목 농도 예 : ^6,9,16 미만 크기의 주문 수있는 수성 단계에 무료 농도이며, 수성 단계를 고갈됩니다. 분자가 원하는의 경우는 이중층 속성을 바꿀지도 모르겠어 어디에 (생물) 효과는 농도에서 발생하는, 그것은 '불특정'를 구분하는 중요 해지고, 막 단백질 기능에 이중층 - 중재 변경 등에 의한 직접 효과 (높은 친화력 반대 ) 하나 이상의 타겟 단백질에 바인딩. 종래의 높은 처리량 검사를 통해 발견된 약물 리드의 이중층 - 수정 성향을, 아는 것은 그러므로 그 발전에 관한 결정을위한 중요한 가능성이 높습니다.

모든 amphiphile 어떤 농도에 어떤 이중층 속성을 변경합니다. 어떤 농도에서, 그리고 이중층 등록 정보의 변경 (이중층 - 스팬)에 의해 막 단백질을 감지 위치 : 주요 고려 사항 따라서가? 여기 transbilayer의 dimerization ^{15 일까지} 채널을 형성 그램이시딘의 능력을 이용. 이것은 그들 지질 bilayers과 이중층 - 임베디드 단백질 사이의 정력적인 결합에 유용 프로브하게, 그리고 작은 분자는 막 단백질에 의해 감지 아르 이중층 속성을 변경할 수 있는지 여부를 탐험하십시오. 분석은 빠르고, 안정적이고 확장성, 그리고 두 biophysical 연구 그러므로 적합하고 잠재적인 이중층 - perturbing 효과 의약품에 대한 화합물 라이브러리를 검사하십시오.

분석, 분석의 효과의 검증 및 단일 채널 전기 생리학과 비교에 대한 자세한 내용은 ¹² 참조하십시오.

우리는 많은 자극 토론 마이클 J. 브루노, Radda Rusinova와 존 T. 색 감사합니다. NIH, R01GM021342와 아라 보완 R01GM021342 - 35S1, 그리고 OSA에 요시야 메이시, 주니어 재단에서 재정 지원, 트라이 - I HII위한 CMB 프로그램, 그리고 아이리스 L. 및 리버렛 S. 워스 의료 과학 원정대와 NIH MSTP 부여 RK위한 GM07739.