Cultura de Laboratório e de Campo de Larvas de Lapa Chinelo ( Crepidula fornicata

O artigo apresenta métodos para cultura larval do gastrópode Crepidula fornicata em um sistema de pequeno volume em escala laboratorial e em um sistema de mesocosmo ambiente-água do mar que pode ser implantado no campo.

O molusco gastrópode calipso, Crepidula fornicata, tem sido amplamente utilizado para estudos de biologia, fisiologia e ecologia do desenvolvimento larval. Larvas de veliger chocadas desta espécie foram coletadas por sifonagem em uma peneira após liberação natural por adultos, distribuídas na cultura a uma densidade de 200/L e alimentadas com Isochrysis galbana (cepa T-ISO) a 1 x 10⁵ células/mL. O crescimento da concha e a aquisição de competência para metamorfose foram documentados para larvas irmãs criadas em culturas ventiladas de 800 mL projetadas para equilíbrio ao ar ambiente ou a misturas de gases atmosféricos definidas. Contrastando com essas condições de cultura de laboratório; Dados de crescimento e competência também foram coletados para larvas criadas em um mesocosmo de água do mar ambiente de 15 L localizado em uma população de campo de adultos reprodutivos. As taxas de crescimento e o tempo de competência metamórfica nas culturas de laboratório foram semelhantes aos relatados em estudos publicados anteriormente. As larvas criadas no mesocosmo do campo cresceram muito mais rápido e se metamorfosearam mais cedo do que o relatado em qualquer estudo de laboratório. Juntos, esses métodos são adequados para explorar o desenvolvimento larval sob condições controladas predeterminadas em laboratório, bem como em condições naturais no campo.

A lapa deslizante, Crepidula fornicata (Gastropoda: Calyptraeidae), está bem representada na literatura de pesquisa atual e histórica devido à sua utilidade como modelo de desenvolvimento e por causa de seus impactos generalizados como espécie invasora. Ele serviu como um exemplo fundamental do desenvolvimento espiraliano na era clássica da embriologia experimental¹ e experimentou um renascimento de interesse com a aplicação de ferramentas modernas de imagem e genômica para dissecar os mecanismos do desenvolvimento inicial dos lofotrocozoários ^2,3. No outro extremo de sua história de vida, outras investigações se concentraram nos impactos das populações adultas desse engenheiro de ecossistemas em ambientes marinhos costeiros temperados muito distantes de sua distribuição original no leste da América do Norte ^4,5. Entre embrião e adulto, as larvas veliger desta espécie têm sido objeto de numerosos estudos sobre desenvolvimento larval e ecologia, especialmente de fatores que influenciam o crescimento e a aquisição de competência para metamorfose, as pistas internas e externas que medeiam o assentamento larval e os efeitos da experiência larval no desempenho juvenil 6,7,8,9,10,11 . Estudos recentes têm revelado a resiliência de larvas e juvenis de C. fornicata à acidificação oceânica, mais uma via para o uso produtivo desse animal^{em pesquisa 12,13,14,15,16}.

Uma vantagem de C. fornicata para estudos de biologia larval marinha é que é relativamente fácil crescer em laboratório em água do mar natural ou artificial em uma dieta unialgal do flagelado Isochrysis galbana. Os métodos de cultura foram detalhados pelo autor em uma publicação impressa anterior focada em métodos¹⁷. As razões para a presente contribuição são duplas. Primeiro, as manobras físicas de rotina envolvidas no estabelecimento e cuidado de culturas são conceitualmente muito simples, mas difíceis de executar corretamente sem demonstração prática ou em vídeo. Em segundo lugar, são descritas duas variações dos métodos de cultura descritos anteriormente, especialmente adequados para estudos de laboratório e de campo de respostas a estressores ambientais, como acidificação dos oceanos, eutrofização e esgotamento de oxigênio. O primeiro deles é um sistema de cultura de baixo volume (800 mL) adequado para manipulação de pH e oxigênio dissolvido na água do mar por meio de pequenos volumes de gases borbulhantes, e o segundo é um sistema de mesocosmo de maior volume (15 L) que pode ser colocado no campo e que permite a livre troca de água do mar ambiente.

1. Manobras de rotina para estabelecimento e manutenção de culturas larvais de C. fornicata

NOTA: Este método começa com um galão (3,8 L) de água do mar contendo C. fornicata adulto que acabou de liberar larvas de veliger chocadas. Os adultos podem ser coletados em campo ou obtidos de um fornecedor fornecido na Tabela de Materiais. Os adultos são hermafroditas protândricos que vivem em pilhas de acasalamento com fêmeas sésseis chocando na parte inferior da pilha. Não quebre as pilhas de adultos. A sazonalidade da reprodução e os métodos de condicionamento de adultos para desova fora da estação foram descritos anteriormente¹⁷. As larvas são melhor coletadas dentro de 2-3 h após a liberação, quando são fortemente geonegativas e se concentram perto da superfície do frasco.

1. Faça uma peneira cortando o fundo de um copo de plástico descartável de três cantos de 400 mL e colando em um painel de malha de náilon de 236 μm. Para este fim e especialmente para a construção do mesocosmo (abaixo), use uma cola hot melt formulada para uma boa adesão ao polietileno.
2. Remova a aeração do frasco adulto e deixe-o repousar por 15-20 min para que os detritos se depositem e as larvas possam nadar facilmente até a superfície.
3. Sifão as larvas através de um pequeno comprimento (15-20 cm) de um tubo de vidro de 5 mm afixado na extremidade de um tubo de aquário de plástico macio de 60-80 cm de comprimento para o peneiro preparado como acima, suspenso num copo de vidro de 600 ml, de modo a que o excesso de água do mar transborde o copo de vidro enquanto as larvas são retidas no passador. Mantenha o fundo da peneira debaixo d'água e evite encalhar larvas.
4. Levante brevemente a peneira do béquer e use uma garrafa de esguicho de água do mar filtrada (FSW) para enxaguar as larvas em uma tigela de vidro de FSW de tamanho conveniente para manipular sob um microscópio de dissecação de baixa potência.
   NOTA: As larvas de C. fornicata prosperam em água do mar natural filtrada perto de 30 ppt de salinidade ou água do mar artificial do oceano instantâneo com até 32 ppt. salinidade, a 20-25 ° C^17,18. A filtração a < 1 μm é suficiente para eliminar os protistas epizoóticos incrustantes que podem causar problemas nas culturas de laboratório.
5. Transfira manualmente e conte o número desejado de larvas em um frasco de cultura usando uma pipeta Pasteur. Para melhores resultados, use 1 larva/5 mL de volume de cultura para C. fornicata. Conte as larvas e evite a tentação de estimar números.
6. Alimente as larvas com a ração desejada de microalgas quando a cultura for iniciada e a cada dois dias substitua as microalgas quando a água da cultura for substituída.
   NOTA: Uma dieta de 1 x 10⁵ células / mL Isochrysis galbana (cepa T-ISO) é uma boa dieta padrão que produz taxas de crescimento laboratorial quase máximas. A ração alimentar e os métodos para a cultura de T-ISO são fornecidos em uma publicação anterior¹⁷.
7. Mude a água da cultura a cada dois dias, despejando o conteúdo da cultura em uma peneira dentro de um copo, como na etapa 1.3 acima. Levante a peneira e use uma garrafa de esguicho de FSW para enxaguar as larvas em um frasco de cultura de FSW fresco com novos alimentos.
   NOTA: A melhor prática é segregar qualquer vidraria usada para cultura larval e evitar qualquer contato dessa vidraria com fixadores, sais de metais pesados solúveis ou detergentes. A limpeza de rotina é melhor feita com uma pasta de bicarbonato de sódio (NaHCO₃) e uma esponja de náilon, enquanto os depósitos minerais podem ser removidos com uma lavagem ácida suave em vinagre branco ou HCl diluído.

2. Construção de culturas ventiladas para larvas de C. fornicata

NOTA: O frasco de vidro recomendado (Tabela de Materiais) tem uma tampa de polipropileno, que é inerte à água do mar e tem a espessura certa para a fixação das entradas da farpa da tubulação para um fluxo de gás de ventilação.

1. Faça dois furos de 5 mm na tampa de cada frasco de cultura (incluindo o revestimento interno da tampa), cada um a cerca de 1,5 cm da borda e oposto um ao outro. (Uma broca de maquinista imperial de 13/64 polegadas ou # 7 ASME também fará um furo de folga apropriado).
2. Instale um adaptador de tubo de nylon rosqueado de 1/8 de polegada x 10-32 em cada orifício, usando uma porca de nylon 10-32, com a farpa do tubo na superfície externa da tampa.
3. Aplique um pouco de selante de aquário de borracha de silicone na abertura da parte interna rosqueada de um dos adaptadores de tubo e empurre um tubo de polietileno de 20 cm de comprimento de 2 mm (diâmetro externo) através da abertura por dentro, de modo que se projete alguns mm além da abertura externa da farpa do tubo.
4. A tubulação agora terá um pequeno tampão de selante de aquário na extremidade que se projeta através da farpa da tubulação, mas a tubulação transparente será visível logo após a extremidade da farpa. Deixe o selante curar e, em seguida, apare a extremidade saliente do tubo de polietileno para que fique nivelado com a extremidade da farpa do tubo.
5. Encha o frasco de cultura com FSW até 1 cm do ombro na parte superior do frasco, aperte a tampa e conecte o suprimento de ar de ventilação ou mistura de gás experimental à farpa do tubo que segura o tubo de ventilação de polietileno. Apare o comprimento do tubo de ventilação para que sua extremidade fique bem no fundo do frasco.
6. Ajuste o fluxo da mistura de ar ou gás de ventilação para produzir um fluxo lento de bolhas (Figura 1). Use uma bomba de ar de aquário com válvulas comuns de aquário para fornecer ventilação com ar ambiente ou use controladores de fluxo de massa para outras misturas experimentais de gases atmosféricos¹⁴.

3. Construção de uma cultura de mesocosmo implantável em campo para larvas de C. fornicata

1. Corte 4 aberturas retangulares uniformemente espaçadas, cada uma com 25 cm x 14,5 cm, nas laterais de um balde de polietileno padrão de 7 galões. Posicione a parte inferior de cada abertura a cerca de 3.5 cm da parte inferior interna do balde (Figura 2A). Uma serra de sabre elétrica portátil com uma lâmina de dentes finos é ideal para essa finalidade. Guarde os pedaços de resíduos recortados e corte-os longitudinalmente em tiras de 2 cm de largura com uma serra de mesa.
2. Corte 4 painéis de malha de nylon de 236 μm, cada um com pelo menos 30 cm x 20 cm, de modo a sobrepor confortavelmente (em pelo menos 2 cm) as aberturas de recorte no balde. Prenda temporariamente uma borda de um painel de malha sobre uma borda longa de seu recorte usando pequenos grampos de mola ou prendedores de roupa.
3. Cole a borda do painel de malha na abertura do balde com cola quente formulada para polietileno. Depois que a primeira borda estiver presa, cole as outras bordas, mantendo a tensão para obter uma superfície esticada no painel de malha.
4. Apare os comprimentos das tiras de resíduos do balde da etapa 3.1, para fazer tiras de reforço para cobrir perfeitamente a área colada onde os painéis de malha se sobrepõem às aberturas do balde. Pressione cada tira de cobertura no lugar com uma quantidade generosa de cola quente, trabalhando rapidamente para colocar cada tira no lugar antes que a cola endureça.
5. Prenda a extremidade de cada tira com um rebite cego de náilon instalado do lado de fora do balde. Apare o excesso de cola e malha das bordas externas das tiras de reforço com uma faca de barbear.
   NOTA: Cada rebite requer um orifício piloto de 15/64 polegadas. As partes internas (cegas) dos rebites são visíveis no interior do mesocosmo acabado na Figura 2B.
6. Implante o mesocosmo em um rack flutuante que segure a parte superior do balde bem acima da água (Figura 2C). A cremalheira de flutuação que é mostrada é feita dos segmentos de 30 cm da tubulação de 2 polegadas do PVC da programação 40, cimentada junto com as junções do cotovelo e do T para fazer uma estrutura hermética que possa guardar uma fileira de 4 mesocosmos replicados.
7. Dependendo das condições locais, os painéis de malha podem ficar sujos em 1-2 dias, de forma a impedir a troca de água do mar através do mesocosmo. Na medida em que isso ocorrer, transfira as larvas para um mesocosmo fresco e limpo, puxando o mesocosmo sujo 2/3^{rd para fora} da água e saltando repetidamente de seu fundo para o mesocosmo fresco com um jarro de 2 L.
8. Execute 20-25 iterações para transferir a maioria das larvas ou até que as larvas não sejam mais observadas no mesocosmo sujo. Limpe o mesocosmo sujo esfregando suavemente os painéis de malha com uma esponja macia carregada com uma pasta de bicarbonato de sódio (NaHCO₃) e enxágue com água da torneira.

O crescimento larval e a aquisição de competência para metamorfose foram medidos em 4 repetições simultâneas das culturas ventiladas de 800 mL, cada uma contendo 160 larvas, derivadas de um lote irmão de larvas que eclodiram de uma única massa de ovo e que foram alimentadas com Isochrysis galbana a uma densidade de 1 x 10⁵ células/mL. O pH foi de 7,9-8,0, a temperatura foi de 20-21 °C e a salinidade foi de 30-31 ppt. O crescimento e a metamorfose também foram determinados com um lote irmão diferente de larvas em um único teste do mesocosmo de 15 L contendo 600 larvas, implantado em Buzzards Bay, MA, EUA, sob condições semelhantes de pH, temperatura e salinidade às culturas de laboratório, mas alimentadas por fitoplâncton natural na água do mar ambiente que fluía através dos painéis de malha do mesocosmo. O pH medido foi de 7,8-8,3, a temperatura foi de 20-24 °C e a salinidade foi de 26-28 ppt. O crescimento foi determinado como uma mudança no comprimento da concha (Figura 3). As larvas cresceram mais rápido no mesocosmo (71 μm / dia) do que nas culturas de laboratório (54 μm / dia) durante os primeiros 4-5 dias após a eclosão (Figura 4). Entre o^5º e o^6º dia, as larvas do mesocosmo começaram a se metamorfosear espontaneamente, e as larvas que permaneceram no mesocosmo no dia 6 foram, em média, 181 μm maiores do que no dia 5. Não houve mais medições larvais do mesocosmo porque a maioria dos indivíduos havia se metamorfoseado no dia 7. As larvas nas culturas de laboratório cresceram a uma taxa muito mais lenta do dia 4 ao dia 8 (41 μm / dia) e do dia 8 ao dia 13 (31 μm / dia). Essas larvas começaram a se tornar competentes para metamorfose no dia 8 e eram quase todas competentes no dia 12, conforme determinado pela estimulação de subamostras com [K⁺] elevado, descrito em⁸. Houve pouca metamorfose espontânea nas culturas de laboratório (<10%) até o dia 13, quando o experimento foi encerrado. A sobrevivência foi de 91% a 100% nas culturas de laboratório e não foi determinada no mesocosmo devido à dificuldade em inspecionar e recuperar todos os indivíduos do volume e das superfícies do mesocosmo.

Figura 1: Configuração da cultura ventilada. A figura mostra 800 mL de culturas ventiladas contendo larvas de Crepidula fornicata, estocadas na densidade de 1 larva/5 mL. Observe um fino fluxo de bolhas, especialmente visível nos frascos 2 e 4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Configuração de cultura de mesocosmo implantável em campo. A figura mostra o mesocosmo de 15 L, (A) vista lateral, (B) vista superior e (C) configuração implantada em rack flutuante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Larva de Veliger de Crepidula fornicata 4 dias após a eclosão. A linha tracejada indica o eixo de medição do comprimento da concha. Abreviaturas: s = concha; v = véu; f = pé; o = opérculo. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 4: Crescimento de larvas de Crepidula fornicata em culturas de laboratório e de campo. Crescimento de larvas em culturas de laboratório de 800 mL (linha tracejada, círculos abertos) e mesocosmo de campo de 15 L (linha sólida, quadrados preenchidos). Cada ponto representa a média de 15 larvas de cada uma das 4 culturas de laboratório replicadas ou a média de 25 larvas de um único mesocosmo. As barras de erro são ± 1 SD. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Embora as larvas de C. fornicata sejam relativamente fáceis de cultivar em comparação com outras larvas marinhas planctotróficas, a atenção aos fundamentos das boas práticas de cultivo ainda é essencial^17,19. As larvas saudáveis devem começar a se alimentar imediatamente após a eclosão. Isso é facilmente verificado no dia seguinte à eclosão, observando suas entranhas cheias, repletas de células de algas, usando um microscópio de dissecação com transiluminação. As conchas de larvas saudáveis devem permanecer limpas, brilhantes e livres de incrustações visíveis por protistas ciliados com caule ou diatomáceas penadas sésseis, que se espalham rapidamente em culturas lotadas. A incrustação da concha inibe a natação e a alimentação, causa mortalidade e geralmente é uma indicação de que a densidade de larvas na cultura é muito alta.

As taxas de crescimento larval e o tempo de competência documentados aqui nas culturas de laboratório ventiladas são semelhantes aos resultados publicados de experimentos de laboratório usando uma versão anterior deste método sob condições semelhantes de densidade larval, pH, temperatura, salinidade e ração alimentar 13,14,16. A única diferença substantiva entre o método descrito aqui e o usado nos últimos estudos é que, no presente experimento, o fluxo de gás de ventilação foi introduzido através de um tubo de 2 mm (diâmetro externo) que criou um fluxo de bolhas do fundo do frasco de cultura, em vez de ser passado pelo headspace na superfície do frasco. A circulação e mistura de água criada pelo fluxo de bolhas não é, portanto, deletéria para o crescimento larval e aquisição de competência e pode ter vantagens para experimentos que exigem equilíbrio rápido da cultura da água do mar para mudar as misturas de gases, por exemplo, para experimentos que investigam os efeitos dos ciclos diéricos nas pressões parciais de CO₂ e O_{dissolvido 2}, como ocorrem em ambientes marinhos produtivos próximos à costa^{20, 21}.

Os resultados do mesocosmo produziram taxas de crescimento larval superiores a qualquer uma publicada em estudos de laboratório, bem como o menor tempo para aquisição de competência para metamorfose^22,23. Embora os resultados atuais tenham sido obtidos em condições de campo claramente muito favoráveis ao crescimento e desenvolvimento larval, o método deve ser mais informativo para explorar o desempenho larval em locais de campo que exibem combinações naturais de estressores ambientais, incluindo habitats em risco e degradados que são de interesse para fins de manejo e remediação²⁴.

Não há conflitos de interesse a serem relatados.

O desenvolvimento inicial do sistema de cultura ventilada de baixo volume foi apoiado em parte pela National Science Foundation (CRI-OA-1416690 para Dickinson College). A Dra. Lauren Mullineaux gentilmente cedeu instalações laboratoriais na Woods Hole Oceanographic Institution, onde os dados apresentados para este sistema (Figura 4) foram coletados.