Laboratorio e coltura sul campo delle larve della patella pantofola, Crepidula fornicata

L'articolo presenta metodi per la coltura larvale del gasteropode Crepidula fornicata in un sistema su scala di laboratorio di piccolo volume e in un sistema di mesocosmo ambiente-acqua marina che può essere utilizzato sul campo.

Il mollusco gasteropode caliptreide, Crepidula fornicata, è stato ampiamente utilizzato per studi di biologia, fisiologia ed ecologia dello sviluppo larvale. Le larve di veliger covate di questa specie sono state raccolte mediante sifonamento su un setaccio dopo il rilascio naturale da parte degli adulti, distribuite nella coltura ad una densità di 200/L e alimentate con Isochrysis galbana (ceppo T-ISO) a 1 x 10⁵ cellule/mL. La crescita del guscio e l'acquisizione di competenze per la metamorfosi sono state documentate per larve di fratelli allevate in colture ventilate da 800 mL progettate per l'equilibrio con l'aria ambiente o con miscele di gas atmosferici definite. In contrasto con queste condizioni di coltura di laboratorio; I dati sulla crescita e sulla competenza sono stati raccolti anche per le larve allevate in un mesocosmo di acqua marina ambientale a flusso continuo di 15 L situato in una popolazione di campo di adulti riproduttivi. I tassi di crescita e la tempistica della competenza metamorfica nelle colture di laboratorio erano simili a quelli riportati negli studi precedentemente pubblicati. Le larve allevate nel mesocosmo di campo sono cresciute molto più velocemente e si sono metamorfosate prima di quanto riportato per qualsiasi studio di laboratorio. Insieme, questi metodi sono adatti per esplorare lo sviluppo larvale in condizioni controllate predeterminate in laboratorio e in condizioni naturali sul campo.

La patella pantofola, Crepidula fornicata (Gastropoda: Calyptraeidae), è ben rappresentata nella letteratura di ricerca attuale e storica a causa della sua utilità come modello di sviluppo e per i suoi diffusi impatti come specie invasiva. È servito come esempio fondamentale dello sviluppo spiraliano nell'età classica dell'embriologia sperimentale¹ e ha sperimentato una rinascita di interesse con l'applicazione di moderni strumenti di imaging e genomica per sezionare i meccanismi dello sviluppo precoce dei lofotrocozoi ^2,3. All'altra estremità della sua storia vitale, altre indagini si sono concentrate sugli impatti delle popolazioni adulte di questo ingegnere ecosistemico in ambienti marini costieri temperati molto lontani dalla sua distribuzione originale nel Nord America orientale ^4,5. Tra l'embrione e l'adulto, le larve veliger di questa specie sono state oggetto di numerosi studi sullo sviluppo larvale e sull'ecologia, in particolare sui fattori che influenzano la crescita e l'acquisizione di competenze per la metamorfosi, i segnali interni ed esterni che mediano l'insediamento larvale e gli effetti dell'esperienza larvale sulle prestazioni giovanili 6,7,8,9,10,11 . Studi recenti hanno rivelato la resilienza delle larve e dei giovani di C. fornicata all'acidificazione degli oceani, un'altra strada per l'uso produttivo della ricerca di questo animale 12,13,14,15,16.

Un vantaggio di C. fornicata per gli studi di biologia larvale marina è che è relativamente facile da coltivare in laboratorio in acqua di mare naturale o artificiale con una dieta unialgale del flagellato Isochrysis galbana. I metodi colturali sono stati dettagliati dall'autore in una precedente pubblicazione cartacea incentrata sui metodi¹⁷. Le ragioni del presente contributo sono duplici. In primo luogo, le manovre fisiche di routine coinvolte nella creazione e nella cura delle culture sono concettualmente molto semplici ma difficili da eseguire correttamente senza una dimostrazione pratica o video. In secondo luogo, vengono descritte due varianti dei metodi di coltura precedentemente descritti che sono particolarmente adatte agli studi di laboratorio e sul campo delle risposte a fattori di stress ambientale come l'acidificazione degli oceani, l'eutrofizzazione e l'esaurimento dell'ossigeno. Il primo di questi è un sistema di coltura a basso volume (800 mL) adatto per la manipolazione del pH e dell'ossigeno disciolto nell'acqua di mare attraverso piccoli volumi di gas bollati, e il secondo è un sistema di mesocosmo a volume maggiore (15 L) che può essere posizionato sul campo e che consente il libero scambio di acqua di mare ambiente.

1. Manovre di routine per l'instaurazione e il mantenimento di colture larvali di C. fornicata

NOTA: Questo metodo inizia con un barattolo da 3,8 litri di acqua di mare contenente C. fornicata adulto che ha appena rilasciato larve di veliger covate. Gli adulti possono essere raccolti sul campo o ottenuti da un fornitore indicato nella Tabella dei materiali. Gli adulti sono ermafroditi protandri che vivono in faraglioni di accoppiamento con femmine covatrici sessili sul fondo del camino. Non rompere le pile di adulti. La stagionalità della riproduzione e i metodi per condizionare gli adulti alla deposizione delle uova fuori stagione sono stati precedentemente descritti¹⁷. Le larve si raccolgono meglio entro 2-3 ore dal rilascio, quando sono fortemente geonegative e si concentrano vicino alla superficie del barattolo.

1. Realizzare un setaccio tagliando il fondo di un becher di plastica monouso a tre angoli da 400 ml e incollandolo su un pannello di rete di nylon da 236 μm. A questo scopo e in particolare per la costruzione del mesocosmo (sotto), utilizzare una colla a caldo formulata per una buona adesione al polietilene.
2. Rimuovi l'aerazione dal barattolo adulto e lascialo riposare per 15-20 minuti in modo che i detriti si depositino e le larve possano nuotare facilmente in superficie.
3. Travasare le larve attraverso un breve tratto (15-20 cm) di tubo di vetro da 5 mm fissato all'estremità di un tubo di plastica morbida per acquario lungo 60-80 cm nel setaccio preparato come sopra, sospeso in un becher di vetro da 600 ml in modo tale che l'acqua di mare in eccesso trabocchi dal becher di vetro mentre le larve vengono trattenute sul setaccio. Mantieni il fondo del setaccio sott'acqua ed evita di arenare le larve.
4. Sollevare brevemente il setaccio dal becher e utilizzare una bottiglia spruzzata di acqua di mare filtrata (FSW) per sciacquare le larve in una ciotola di vetro di FSW di dimensioni convenienti da manipolare con un microscopio da dissezione a bassa potenza.
   NOTA: Le larve di C. fornicata prosperano in acqua di mare naturale filtrata vicino a 30 ppt di salinità o in acqua di mare artificiale Instant Ocean prodotta fino a 32 ppt di salinità, a 20-25 °C^17,18. La filtrazione a < 1 μm è sufficiente per eliminare i protisti epizootici incrostati che possono causare problemi nelle colture di laboratorio.
5. Trasferire e contare manualmente il numero desiderato di larve in un barattolo di coltura utilizzando una pipetta Pasteur. Per ottenere i migliori risultati, utilizzare 1 larva/5 mL di volume di coltura per C. fornicata. Conta le larve ed evita la tentazione di stimare i numeri.
6. Nutrire le larve con la razione desiderata di microalghe quando viene avviata la coltura e sostituire le microalghe a giorni alterni quando viene sostituita l'acqua di coltura.
   NOTA: Una dieta di 1 x 10⁵ cellule/mL di Isochrysis galbana (ceppo T-ISO) è una buona dieta standard che produce tassi di crescita di laboratorio quasi massimi. La razione alimentare e i metodi per la coltura del T-ISO sono forniti in una precedente pubblicazione¹⁷.
7. Cambiare l'acqua della coltura a giorni alterni versando il contenuto della coltura in un setaccio all'interno di un bicchiere, come nel passaggio 1.3 sopra. Solleva il setaccio e usa un flacone a spruzzo di FSW per sciacquare le larve in un barattolo di coltura di FSW fresco con nuovo cibo.
   NOTA: La migliore pratica consiste nel separare qualsiasi vetreria utilizzata per la coltura larvale ed evitare qualsiasi contatto di tale vetreria con fissativi, sali di metalli pesanti solubili o detergenti. La pulizia ordinaria viene eseguita al meglio con una pasta di bicarbonato di sodio (NaHCO₃) e un tampone di nylon, mentre i depositi minerali possono essere rimossi con un lavaggio acido delicato in aceto bianco o diluito di HCl.

2. Costruzione di colture ventilate per larve di C. fornicata

NOTA: Il barattolo di vetro consigliato (Tabella dei materiali) ha un coperchio in polipropilene, che è inerte all'acqua di mare e ha lo spessore giusto per il fissaggio degli ingressi delle alette dei tubi per un flusso di gas di ventilazione.

1. Praticare due fori da 5 mm nel coperchio di ciascun barattolo di coltura (compreso il rivestimento interno del coperchio), ciascuno a circa 1,5 cm dal bordo e uno di fronte all'altro. (Una punta da trapano da 13/64 pollici imperiale o #7 ASME standard per macchinisti eseguirà anche un foro di gioco appropriato).
2. Installare un adattatore per tubi in nylon filettato da 1/8 di pollice x 10-32 in ciascun foro, utilizzando un dado in nylon 10-32, con la punta del tubo sulla superficie esterna del coperchio.
3. Applicare una piccola quantità di sigillante per acquari in gomma siliconica sull'apertura della parte interna filettata di uno degli adattatori per tubi e spingere un tubo di polietilene lungo 20 cm di 2 mm (diametro esterno) attraverso l'apertura dall'interno in modo che sporga di alcuni mm oltre l'apertura esterna dell'aletta del tubo.
4. Il tubo avrà ora un piccolo tappo di sigillante per acquari all'estremità che sporge attraverso l'aletta del tubo, ma il tubo trasparente sarà visibile appena oltre l'estremità dell'aletta . Lasciare indurire il sigillante, quindi tagliare l'estremità sporgente del tubo in polietilene in modo che sia a filo con l'estremità della punta del tubo.
5. Riempire il barattolo di coltura con FSW fino a una distanza massima di 1 cm dalla spalla nella parte superiore del barattolo, avvitare il coperchio e collegare l'aria di ventilazione o l'alimentazione della miscela di gas sperimentale alla punta del tubo che contiene il tubo di ventilazione in polietilene. Taglia la lunghezza del tubo di ventilazione in modo che la sua estremità si trovi ordinatamente sul fondo del barattolo.
6. Regolare il flusso dell'aria di ventilazione o della miscela di gas per ottenere un flusso lento di bolle (Figura 1). Utilizzare una pompa dell'aria per acquari con comuni valvole per acquari per fornire ventilazione con aria ambiente o utilizzare regolatori di flusso di massa per altre miscele sperimentali di gas atmosferici¹⁴.

3. Costruzione di una coltura mesocosmica dispiegabile sul campo per larve di C. fornicata

1. Taglia 4 aperture rettangolari equidistanti, ciascuna di 25 cm x 14,5 cm, ai lati di un secchio standard in polietilene da 7 galloni. Posizionare il fondo di ciascuna apertura a circa 3,5 cm dal fondo interno del secchio (Figura 2A). Una sega a sciabola elettrica portatile con lama a denti fini è l'ideale per questo scopo. Conservare i pezzi di scarto ritagliati e tagliarli nel senso della lunghezza in strisce larghe 2 cm con una sega da banco.
2. Ritagliare 4 pannelli di rete di nylon da 236 μm, ciascuno di almeno 30 cm x 20 cm, in modo da sovrapporre comodamente (di almeno 2 cm) le aperture ritagliate nel secchio. Fissare temporaneamente un bordo di un pannello in rete su un bordo lungo del suo ritaglio utilizzando piccoli morsetti a molla o mollette.
3. Incollare il bordo del pannello in rete all'apertura del secchio con colla a caldo formulata per polietilene. Una volta fissato il primo bordo, incollare gli altri bordi mantenendo la tensione per ottenere una superficie tesa sul pannello in rete.
4. Taglia le lunghezze delle strisce dei pezzi di scarto del secchio dal passaggio 3.1, per realizzare strisce di rinforzo per coprire ordinatamente l'area incollata dove i pannelli di rete si sovrappongono alle aperture del secchio. Premere ogni striscia di copertura in posizione con una quantità generosa di colla a caldo, lavorando rapidamente per posizionare ogni striscia prima che la colla si indurisca.
5. Fissare l'estremità di ogni striscia con un rivetto cieco in nylon installato dall'esterno del secchio. Tagliare la colla e la rete in eccesso dai bordi esterni delle strisce di rinforzo con un taglierino multiuso.
   NOTA: Ogni rivetto richiede un foro pilota da 15/64 pollici. Le parti interne (cieche) dei rivetti sono visibili all'interno del mesocosmo finito nella Figura 2B.
6. Dispiegare il mesocosmo in una rastrelliera galleggiante che tenga la parte superiore del secchio ben al di sopra dell'acqua (Figura 2C). La rastrelliera galleggiante mostrata è costituita da segmenti di 30 cm di tubo in PVC Schedule 40 da 2 pollici, cementati insieme con giunti a gomito e a T per creare una struttura ermetica in grado di contenere una fila di 4 mesocosmi replicati.
7. A seconda delle condizioni locali, i pannelli in rete possono sporcarsi in 1-2 giorni, in modo da impedire lo scambio di acqua di mare attraverso il mesocosmo. Nella misura in cui ciò si verifica, trasferire le larve in un mesocosmo fresco e pulito tirando^fuori dall'acqua il mesocosmo sporco per 2/3 e lanciandolo ripetutamente dal suo fondo nel mesocosmo fresco con una brocca da 2 L.
8. Eseguire 20-25 iterazioni per trasferire la maggior parte delle larve, o fino a quando le larve non sono più osservate nel mesocosmo contaminato. Pulisci il mesocosmo sporco strofinando delicatamente i pannelli in rete con una spugna morbida caricata con una pasta di bicarbonato di sodio (NaHCO₃) e risciacqua con acqua di rubinetto.

La crescita larvale e l'acquisizione della competenza per la metamorfosi sono state misurate in 4 repliche simultanee di colture ventilate da 800 mL, ciascuna contenente 160 larve, derivate da un lotto di larve sorelle che si sono schiuse da una singola massa di uova e che sono state alimentate con Isochrysis galbana a una densità di 1 x 10⁵ cellule/mL. Il pH era 7,9-8,0, la temperatura era 20-21 °C e la salinità era 30-31 ppt. La crescita e la metamorfosi sono state determinate anche con un diverso lotto di larve in un singolo test del mesocosmo da 15 L contenente 600 larve, distribuito a Buzzards Bay, MA, USA, in condizioni di pH, temperatura e salinità simili a quelle delle colture di laboratorio, ma alimentato da fitoplancton naturale nell'acqua di mare ambiente che scorreva attraverso i pannelli a maglie del mesocosmo. Il pH misurato era 7,8-8,3, la temperatura era di 20-24 °C e la salinità era di 26-28 ppt. La crescita è stata determinata come una variazione della lunghezza del guscio (Figura 3). Le larve sono cresciute più velocemente nel mesocosmo (71 μm/giorno) rispetto alle colture di laboratorio (54 μm/giorno) durante i primi 4-5 giorni dopo la schiusa (Figura 4). Tra il 5^{° e il} 6^{° giorno,} le larve nel mesocosmo hanno iniziato a metamorfosare spontaneamente e le larve che sono rimaste nel mesocosmo il giorno 6 erano, in media, 181 μm più grandi rispetto al giorno 5. Non ci sono state ulteriori misurazioni larvali dal mesocosmo perché la maggior parte degli individui si era metamorfosata entro il giorno 7. Le larve nelle colture di laboratorio sono cresciute a un ritmo molto più lento dal giorno 4 al giorno 8 (41 μm/giorno) e dal giorno 8 al giorno 13 (31 μm/giorno). Queste larve hanno iniziato a diventare competenti per la metamorfosi il giorno 8 ed erano quasi tutte competenti entro il giorno 12, come determinato dalla stimolazione di sottocampioni con elevato [K⁺], descritto in⁸. C'è stata poca metamorfosi spontanea nelle colture di laboratorio (<10%) fino al giorno 13, quando l'esperimento è stato terminato. La sopravvivenza è stata del 91%-100% nelle colture di laboratorio e non è stata determinata nel mesocosmo a causa della difficoltà di ispezionare e recuperare tutti gli individui dal volume e dalle superfici del mesocosmo.

Figura 1: Configurazione della coltura ventilata. La figura mostra 800 mL di colture ventilate contenenti larve di Crepidula fornicata, stoccate a una densità di 1 larva/5 mL. Notare un sottile flusso di bolle, particolarmente visibile nei barattoli 2 e 4. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Configurazione della coltura del mesocosmo distribuibile sul campo. La figura mostra il mesocosmo da 15 L, (A) vista laterale, (B) vista dall'alto e (C) configurazione dispiegata in rastrelliera galleggiante. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Larva di Veliger di Crepidula fornicata a 4 giorni dalla schiusa. La linea tratteggiata indica l'asse di misurazione della lunghezza del proiettile. Abbreviazioni: s = conchiglia; v = velum; f = piede; o = opercolo. Barra della scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Crescita delle larve di Crepidula fornicata in colture di laboratorio e di campo. Crescita delle larve in colture di laboratorio da 800 mL (linea tratteggiata, cerchi aperti) e mesocosmo di campo da 15 L (linea continua, quadrati pieni). Ogni punto rappresenta la media di 15 larve da ciascuna delle 4 colture di laboratorio replicate o la media di 25 larve da un singolo mesocosmo. Le barre di errore sono ± 1 SD. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Sebbene le larve di C. fornicata siano relativamente facili da coltivare rispetto ad altre larve marine planctotrofiche, l'attenzione ai fondamenti delle buone pratiche di coltura è ancora essenziale^17,19. Le larve sane dovrebbero iniziare a nutrirsi immediatamente dopo la schiusa. Questo è facilmente verificabile il giorno dopo la schiusa osservando le loro viscere piene, piene di cellule algali, utilizzando un microscopio da dissezione con transilluminazione. I gusci delle larve sane dovrebbero rimanere puliti, luminosi e privi di incrostazioni visibili da parte di protisti ciliati peduncolati o diatomee pennate sessili, che si diffondono rapidamente in colture affollate. L'incrostazione del guscio inibisce il nuoto e l'alimentazione, causa mortalità e di solito è un'indicazione che la densità di larve nella coltura è troppo alta.

I tassi di crescita larvale e i tempi di competenza documentati qui nelle colture di laboratorio ventilate sono simili ai risultati pubblicati da esperimenti di laboratorio che utilizzano una versione precedente di questo metodo in condizioni simili di densità larvale, pH, temperatura, salinità e razione alimentare 13,14,16. L'unica differenza sostanziale tra il metodo qui descritto e quello utilizzato negli ultimi studi è che nel presente esperimento, il flusso di gas di ventilazione è stato introdotto attraverso un tubo di 2 mm (diametro esterno) che ha creato un flusso di bolle dal fondo del vaso di coltura, piuttosto che essere fatto passare attraverso lo spazio di testa sulla superficie del barattolo. La circolazione e la miscelazione dell'acqua create dal flusso di bolle non sono quindi deleterie per la crescita larvale e l'acquisizione di competenze e possono presentare vantaggi per esperimenti che richiedono un rapido equilibrio dell'acqua di mare di coltura al variare delle miscele di gas, ad esempio, per esperimenti che studiano gli effetti dei cicli diel nelle pressioni parziali di CO₂ e O₂ disciolto come si verificano in ambienti marini costieri produttivi^{20, 21}.

I risultati del mesocosmo hanno prodotto tassi di crescita larvale superiori a quelli pubblicati da studi di laboratorio, nonché il tempo più breve per l'acquisizione della competenza per la metamorfosi^22,23. Sebbene i risultati attuali siano stati ottenuti in condizioni di campo chiaramente molto favorevoli per la crescita e lo sviluppo delle larve, il metodo dovrebbe essere più informativo per esplorare le prestazioni larvali in siti sul campo che mostrano combinazioni naturali di fattori di stress ambientale, inclusi habitat a rischio e degradati che sono di interesse ai fini della gestione e della bonifica²⁴.

Non ci sono conflitti di interesse da segnalare.

Lo sviluppo iniziale del sistema di coltura ventilata a basso volume è stato supportato in parte dalla National Science Foundation (CRI-OA-1416690 al Dickinson College). La dottoressa Lauren Mullineaux ha gentilmente fornito le strutture di laboratorio presso la Woods Hole Oceanographic Institution, dove sono stati raccolti i dati presentati per questo sistema (Figura 4).