מעבדה ותרבית שדה של זחלים של צלע נעלי בית, Crepidula fornicata

המאמר מציג שיטות לתרבית זחלים של הגסטרופוד Crepidula fornicata במערכת בקנה מידה מעבדתי קטן ובמערכת מזוקוסמוס של מי ים שניתן לפרוס בשטח.

רכיכת הגסטרופוד הקליפטראידית, Crepidula fornicata, נמצאת בשימוש נרחב במחקרים של ביולוגיה התפתחותית של הזחל, פיזיולוגיה ואקולוגיה. זחלי ויליגר ממין זה נאספו על ידי סיפון על מסננת לאחר שחרור טבעי על ידי בוגרים, הופצו לתרבית בצפיפות של 200/L, והוזנו באיזוכריזיס גלבנה (זן T-ISO) ב 1 x 10⁵ תאים / מ"ל. גדילת קונכיות ורכישת כשירות למטמורפוזה תועדו עבור זחלים אחים שגודלו בתרביות מאווררות של 800 מ"ל שתוכננו לשיווי משקל לאוויר הסביבה או לתערובות גזים אטמוספריות מוגדרות. בניגוד לתנאי תרבית מעבדה אלה; נתוני גדילה וכשירות נאספו גם עבור זחלים שגודלו במזוקוסמה של מי ים בזרימה של 15 ליטר הממוקמת באוכלוסיית שדה של בוגרים רבייתיים. שיעורי הצמיחה והתזמון של יכולת מטמורפית בתרביות מעבדה היו דומים לאלה שדווחו במחקרים שפורסמו בעבר. הזחלים שגודלו בשדה מזוקוסמוס גדלו הרבה יותר מהר ועברו מטמורפוזה מוקדם יותר ממה שדווח בכל מחקרי המעבדה. יחד, שיטות אלה מתאימות לחקר התפתחות הזחלים בתנאים מבוקרים שנקבעו מראש במעבדה וכן בתנאים טבעיים בשטח.

הצלע המחליקה, Crepidula fornicata (Gastropoda: Calyptraeidae), מיוצגת היטב בספרות המחקר העכשווית וההיסטורית בשל יעילותה כמודל התפתחותי ובשל השפעותיה הנרחבות כמין פולש. הוא שימש דוגמה יסודית להתפתחות ספירלית בעידן הקלאסי של אמבריולוגיה ניסיונית¹ וחווה לידה מחודשת של עניין עם יישום של הדמיה מודרנית וכלים גנומיים לנתח מנגנונים של התפתחות מוקדמת lophotrochozoan ^2,3. בקצה השני של תולדות חייו, חקירות אחרות התמקדו בהשפעות של אוכלוסיות בוגרות של מהנדס מערכות אקולוגיות זה בסביבות ימיות חופיות ממוזגות, רחוקות מאוד מתפוצתו המקורית במזרח צפון אמריקה ^4,5. בין עובר לבוגר, זחלי הווליג'ר של מין זה היו מושא למחקרים רבים על התפתחות הזחל והאקולוגיה, במיוחד על גורמים המשפיעים על גדילה ורכישת כשירות למטמורפוזה, הרמזים הפנימיים והחיצוניים המתווכים את התיישבות הזחל, והשפעות חוויית הזחל על ביצועי הצעירים 6,7,8,9,10,11 . מחקרים אחרונים חשפו את עמידותם של זחלים וצעירים של C. fornicata להחמצת האוקיינוס, אפיק נוסף לשימוש מחקרי פרודוקטיבי בבעל חיים זה 12,13,14,15,16.

יתרון של C. fornicata למחקרים של ביולוגיה של זחלים ימיים הוא שקל יחסית לגדל במעבדה במי ים טבעיים או מלאכותיים על תזונה חד אצתית של השוטון Isochrysis galbana. שיטות התרבות פורטו על ידי המחבר בפרסום מודפס מוקדם יותר המתמקד בשיטות¹⁷. הסיבות לתרומה הנוכחית הן כפולות. ראשית, התמרונים הפיזיים השגרתיים הכרוכים בביסוס תרבויות ובטיפול בהן הם פשוטים מאוד מבחינה רעיונית אך קשים לביצוע נכון ללא התנסות מעשית או הדגמת וידאו. שנית, מתוארות שתי וריאציות על שיטות תרבית שתוארו קודם לכן, המתאימות במיוחד למחקרי מעבדה ושדה של תגובות לגורמי עקה סביבתיים כגון החמצת אוקיינוסים, אטרופיקציה ודלדול חמצן. הראשונה שבהן היא מערכת תרבית בנפח נמוך (800 מ"ל) המתאימה למניפולציה של pH וחמצן מומס במי ים באמצעות נפחים קטנים של גזים מבעבעים, והשנייה היא מערכת מזוקוסמוס בעלת נפח גדול יותר (15 ליטר) שניתן למקם בשדה ומאפשרת החלפה חופשית של מי ים סביבתיים.

1. תמרונים שגרתיים להקמה ותחזוקה של תרביות זחלים של C. fornicata

הערה: שיטה זו מתחילה עם צנצנת גלון (3.8 ליטר) של מי ים המכילה C. fornicata בוגרים שזה עתה שחררו זחלי וליגר מגודלים. ניתן לאסוף מבוגרים בשטח או להשיגם מספק המופיע בטבלת החומרים. הבוגרים הם הרמפרודיטים פרוטנדרוסים החיים בערימות הזדווגות עם נקבות ססיליות בתחתית הערימה. אין לפרק ערימות למבוגרים. עונתיות הרבייה ושיטות להתניה של בוגרים להשרצה מחוץ לעונה תוארו בעבר¹⁷. הזחלים נאספים בצורה הטובה ביותר תוך 2-3 שעות לאחר שחרורם, כאשר הם גיאושליליים מאוד ויתרכזו ליד פני השטח של הצנצנת.

1. צור מסננת על ידי חיתוך החלק התחתון של פלסטיק חד פעמית תלת פינתית בנפח 400 מ"ל והדבקה על לוח של רשת ניילון בגודל 236 מיקרומטר. למטרה זו ובמיוחד לבניית מזוקוסמוס (להלן), השתמשו בדבק מומס חם המיוצר להדבקה טובה לפוליאתילן.
2. הסר אוורור מהצנצנת הבוגרת ותן לה לעמוד במשך 15-20 דקות, כך שהפסולת תשקע והזחלים יוכלו לשחות בקלות אל פני השטח.
3. סיפון הזחלים באורך קצר (15-20 ס"מ) של צינורות זכוכית בקוטר 5 מ"מ המודבקים לקצה צינור אקווריום פלסטיק רך באורך 60-80 ס"מ לתוך המסננת שהוכנה כנ"ל, תלויים בתוך זכוכית בנפח 600 מ"ל כך שעודפי מי ים עולים על גדותיהם של הזכוכית בעוד הזחלים נשמרים על המסננת. שמרו על תחתית המסננת מתחת למים והימנעו מזחלים תקועים.
4. הרימו לרגע את המסננת מהכוס והשתמשו בבקבוק התזת מי ים מסוננים (FSW) כדי לשטוף את הזחלים לתוך קערת זכוכית של FSW בגודל נוח למניפולציה תחת מיקרוסקופ ניתוח בהספק נמוך.
   הערה: זחלים של C. fornicata משגשגים במי ים טבעיים מסוננים ליד מליחות 30 ppt או במי ים מלאכותיים Instant Ocean העשויים עד 32 ppt. מליחות, ב 20-25 ° C^17,18. סינון ב < 1 מיקרומטר מספיק כדי לחסל פרוטיסטים אפיזוטיים עכורים שיכולים לגרום לבעיות בתרביות מעבדה.
5. מעבירים ידנית וסופרים את מספר הזחלים הרצוי לצנצנת תרבית באמצעות פיפט פסטר. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, יש להשתמש בנפח תרבית של זחל אחד/5 מ"ל עבור C. fornicata. ספרו את הזחלים והימנעו מהפיתוי להעריך מספרים.
6. האכילו את הזחלים במנה הרצויה של מיקרו-אצות כאשר התרבית מתחילה ופעם ביומיים החליפו את המיקרו-אצות כאשר מוחלפים מי תרבית.
   הערה: דיאטה של 1 x 10⁵ תאים / מ"ל איזוכריזיס גלבנה (זן T-ISO) היא תזונה סטנדרטית טובה המניבה שיעורי צמיחה כמעט מקסימליים במעבדה. הקצבת מזון ושיטות לתרבות של T-ISO מסופקים בפרסום מוקדם יותר¹⁷.
7. החליפו את מי התרבית אחת ליומיים על ידי מזיגת תכולת התרבית לתוך מסננת בתוך כוסית, כמו בשלב 1.3 לעיל. הרימו את המסננת והשתמשו בבקבוק שפריץ של FSW כדי לשטוף זחלים לתוך צנצנת תרבית של FSW טרי עם מזון חדש.
   הערה: השיטה הטובה ביותר היא להפריד כל כלי זכוכית המשמשים לתרבית זחלים ולהימנע מכל מגע של כלי זכוכית אלה עם קיבוע, מלחי מתכת כבדים מסיסים או דטרגנטים. ניקוי שגרתי נעשה בצורה הטובה ביותר עם משחה של סודה לשתייה (NaHCO₃) וכרית קרצוף ניילון, בעוד מרבצי מינרלים ניתן להסיר עם שטיפת חומצה עדינה בחומץ לבן או לדלל HCl.

2. בניית תרביות מאווררות לזחלים של C. fornicata

הערה: לצנצנת הזכוכית המומלצת (טבלת חומרים) יש מכסה פוליפרופילן, שהוא אינרטי למי ים ובעל העובי הנכון להידוק פתחי צינורות לזרם גז מאוורר.

1. קודחים שני חורים בקוטר 5 מ"מ במכסה של כל צנצנת תרבית (כולל התוחם הפנימי של המכסה), כל אחד מהם במרחק של כ-1.5 ס"מ מהקצה וממול לשני. (מקדח קיסרי בגודל 13/64 אינץ 'או #7 ASME סטנדרטי של מכונאי יעשה גם חור אישור מתאים).
2. התקן מתאם צינורות ניילון מושחל בגודל 1/8 אינץ 'x 10-32 בכל חור, באמצעות אום ניילון 10-32, עם מוט הצינור על פני השטח החיצוניים של המכסה.
3. מרחו חומר איטום של אקווריום גומי סיליקון על הצמצם של החלק הפנימי המושחל של אחד ממתאמי הצינור ודחפו צינור פוליאתילן באורך 20 ס"מ של 2 מ"מ (קוטר חיצוני) דרך הצמצם מבפנים כך שהוא יבלוט כמה מ"מ מעבר לצמצם החיצוני של מוט הצינור.
4. לצינורות יהיה כעת תקע קטן של חומר איטום אקווריום בקצה הבולט דרך מוט הצינורות, אך צינורות שקופים ייראו ממש מעבר לקצה הברב. תן את חומר האיטום לרפא, ולאחר מכן לקצץ את הקצה הבולט של צינור פוליאתילן כך שהוא סומק עם קצה צינור.
5. מלאו את צנצנת התרבית ב-FSW עד למרחק של 1 ס"מ מהכתף בחלק העליון של הצנצנת, הבריגו את המכסה וחברו את האוויר המאוורר או את תערובת הגז הניסיונית לצינור המחזיק את צינור אוורור הפוליאתילן. חתכו את אורך צינור האוורור כך שקצהו מונח בצורה מסודרת בתחתית הצנצנת.
6. התאימו את זרימת האוויר המאוורר או תערובת הגז כדי ליצור זרם איטי של בועות (איור 1). השתמש במשאבת אוויר לאקווריום עם שסתומי כנופיות אקווריום משותפים כדי לספק אוורור עם אוויר הסביבה או השתמש בבקרי זרימה המונית עבור תערובות גז אטמוספרי ניסיוניות אחרות¹⁴.

3. בניית תרבית מזוקוסמוס הניתנת לפריסה בשדה עבור זחלים של C. fornicata

1. חותכים 4 פתחים מלבניים במרווחים שווים, כל אחד בגודל 25 ס"מ x 14.5 ס"מ, בצידי דלי פוליאתילן סטנדרטי של 7 גלון. מקמו את החלק התחתון של כל פתח במרחק של כ-3.5 ס"מ מהתחתית הפנימית של הדלי (איור 2A). מסור חרב חשמלי ידני עם להב בעל שיניים עדינות אידיאלי למטרה זו. שומרים את חתיכות הפסולת החתוכות ופורסים אותן לאורכן לרצועות ברוחב 2 ס"מ בעזרת מסור שולחן.
2. גזרו 4 לוחות של רשת ניילון בגודל 236 מיקרומטר, כל אחד בגודל 30X20 ס"מ לפחות, כדי לחפוף בנוחות (ב-2 ס"מ לפחות) את פתחי החיתוך בדלי. אבטחו באופן זמני קצה אחד של לוח רשת שינוי על קצה ארוך של המגרעת בעזרת מהדקים קפיציים קטנים או סיכות כביסה.
3. הדביקו את קצה לוח הרשת לפתח הדלי בדבק מומס חם המיוצר עבור פוליאתילן. לאחר הידוק הקצה הראשון, הדביקו את הקצוות האחרים תוך שמירה על מתח לקבלת משטח מתוח בלוח הרשת.
4. חתוך את אורכן של רצועות פסולת הדלי משלב 3.1, כדי ליצור רצועות חיזוק שיכסו בצורה מסודרת את האזור המודבק שבו לוחות הרשת חופפים את פתחי הדלי. לחץ על כל רצועת כיסוי במקומה עם כמות נדיבה של דבק נמס חם, ועבוד במהירות כדי לקבל כל רצועה במקומה לפני שהדבק מתקשה.
5. אבטחו את הקצה של כל רצועה באמצעות מסמר תריס ניילון המותקן מבחוץ של הדלי. חותכים עודפי דבק ורשת מהקצוות החיצוניים של רצועות החיזוק בעזרת סכין גילוח שימושית.
   הערה: כל מסמר דורש חור טייס בגודל 15/64 אינץ'. החלקים הפנימיים (העיוורים) של המסמרות נראים בחלק הפנימי של המזוקוסמוס המוגמר באיור 2B.
6. פרסו את המזוקוסמוס במדף צף שמחזיק את החלק העליון של הדלי הרבה מעל המים (איור 2C). המדף הצף המוצג עשוי מקטעים של 30 ס"מ של צינור PVC 2 אינץ 'Schedule 40, צמנטי יחד עם מפרקי מרפקים וטי ליצירת מבנה אטום שיכול להחזיק שורה של 4 מזוקוסמות משוכפלות.
7. בהתאם לתנאים המקומיים, לוחות הרשת עלולים להתקלקל תוך 1-2 ימים, באופן המעכב את חילופי מי הים דרך המזוקוסמוס. במידה שזה קורה, מעבירים את הזחלים למזוקוסמוס טרי ונקי על ידי משיכת המזוקוסמוס העכור 2/3^rd מהמים וחילוץ חוזר ונשנה מקרקעיתו לתוך המזוקוסמוס הטרי עם קנקן 2 ליטר.
8. בצע 20-25 חזרות כדי להעביר את רוב הזחלים, או עד שהזחלים כבר לא נצפים במזוקוסמוס העכור. נקו את המזוקוסמוס על ידי קרצוף עדין של לוחות הרשת בספוג רך עמוס במשחה של סודה לשתייה (NaHCO₃) ושטפו במי ברז.

גדילת הזחלים ורכישת כשירות למטמורפוזה נמדדו ב-4 העתקים סימולטניים של תרביות מאווררות בנפח 800 מ"ל, שכל אחת מהן הכילה 160 זחלים, שמקורם בקבוצת אחים של זחלים שבקעו ממסת ביצה אחת והוזנו באיזוכריזיס גלבנה בצפיפות של 1X10⁵ תאים/מ"ל. ה- pH היה 7.9-8.0, הטמפרטורה הייתה 20-21 מעלות צלזיוס, והמליחות הייתה 30-31 ppt. גדילה ומטמורפוזה נקבעו גם עם קבוצה אחים שונים של זחלים בניסוי יחיד של 15 L mesocosm המכיל 600 זחלים, שנפרסו במפרץ Buzzards, מסצ'וסטס, ארה"ב, בתנאים דומים של pH, טמפרטורה ומליחות כמו תרביות המעבדה, אך ניזונו על ידי פיטופלנקטון טבעי במי הים הסביבתיים שזרמו דרך לוחות הרשת של המזוקוסמוס. ה- pH שנמדד היה 7.8-8.3, הטמפרטורה הייתה 20-24 מעלות צלזיוס, והמליחות הייתה 26-28 ppt. הצמיחה נקבעה כשינוי באורך הקונכייה (איור 3). הזחלים גדלו מהר יותר במזוקוסמוס (71 מיקרומטר ליום) מאשר בתרביות המעבדה (54 מיקרומטר ליום) במהלך 4-5 הימים הראשונים לאחר הבקיעה (איור 4). בין היום^{ה-5 ל-6} , הזחלים במזוקוסמוס החלו לעבור מטמורפוזה באופן ספונטני, והזחלים שנשארו במזוקוסמוס ביום ה-6 היו בממוצע גדולים ב-181 מיקרומטר מאשר ביום ה-5. לא היו מדידות זחלים נוספות מהמזוקוסמוס מכיוון שרוב הפרטים עברו מטמורפוזה עד היום השביעי. הזחלים בתרביות המעבדה גדלו בקצב איטי הרבה יותר מהיום ה-4 עד היום ה-8 (41 מיקרומטר ליום) ומהיום ה-8 ליום ה-13 (31 מיקרומטר ליום). זחלים אלה החלו להיות כשירים למטמורפוזה ביום ה-8 וכמעט כולם היו כשירים עד היום ה-12, כפי שנקבע על-ידי גירוי של תת-דגימות עם [K^+] מוגבה, המתואר^ב-8. הייתה מעט מטמורפוזה ספונטנית בתרביות המעבדה (<10%) עד היום ה-13, כאשר הניסוי הופסק. ההישרדות הייתה 91%-100% בתרביות המעבדה ולא נקבעה במזוקוסמוס בגלל הקושי לבדוק ולשחזר את כל הפרטים מנפח המזוקוסמוס ומפני השטח.

איור 1: מערך תרבית מאווררת. האיור מראה 800 מ"ל תרביות מאווררות המכילות זחלים של Crepidula fornicata, מלאי בצפיפות של 1 זחל / 5 מ"ל. שימו לב לזרם דק של בועות, שנראה במיוחד בצנצנות 2 ו-4. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: הגדרת תרבית מזוקוסמוס הניתנת לפריסה בשטח. האיור מראה 15 L mesocosm, (A) מבט רוחבי, (B) מבט עליון ו-(C) התקנה שנפרסה בארון תקשורת צף. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: זחל וליגר של Crepidula fornicata 4 ימים לאחר הבקיעה. קו מקווקו מציין ציר מדידת אורך המעטפת. קיצורים: s = קליפה; v = וולום; f = רגל; o = אופרקולום. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: גידול זחלים של Crepidula fornicata בתרביות מעבדה ושדה. גידול זחלים בתרביות מעבדה של 800 מ"ל (קו מקווקו, עיגולים פתוחים) ומזוקוסמוס שדה של 15 ליטר (קו מוצק, ריבועים מלאים). כל נקודה מייצגת את הממוצע של 15 זחלים מכל אחת מ-4 תרביות מעבדה משוכפלות או את הממוצע של 25 זחלים ממזוקוסמוס יחיד. קווי שגיאה הם ± 1 SD. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

למרות שזחלים של C. fornicata קלים יחסית לתרבית בהשוואה לזחלים ימיים פלנקטוטרופיים אחרים, תשומת לב ליסודות של פרקטיקת תרבות טובה עדיין חיונית^17,19. זחלים בריאים צריכים להתחיל להאכיל מיד לאחר הבקיעה. ניתן לאמת זאת בקלות ביום שלאחר הבקיעה על ידי התבוננות במעיים המלאים שלהם, העמוסים בתאי אצות, באמצעות מיקרוסקופ מנתח עם הארה. קונכיות של זחלים בריאים צריכות להישאר נקיות, בהירות ונקיות מעכירות נראית לעין על ידי פרוטיסטים ריסניים גבעולים או דיאטומים מחומשים ססיליים, המתפשטים במהירות בתרבויות צפופות. עכירת קונכיות מעכבת שחייה והאכלה, גורמת לתמותה, ובדרך כלל מעידה על כך שצפיפות הזחלים בתרבית גבוהה מדי.

שיעורי גדילת הזחלים ועיתוי הכשירות שתועדו כאן בתרביות המעבדה המאווררות דומים לתוצאות שפורסמו מניסויי מעבדה בגרסה מוקדמת יותר של שיטה זו בתנאים דומים של צפיפות הזחל, pH, טמפרטורה, מליחות ומנת מזון 13,14,16. ההבדל המהותי היחיד בין השיטה שתוארה כאן לבין זו ששימשה במחקרים האחרונים הוא שבניסוי הנוכחי, זרם הגז המאוורר הוכנס דרך צינור בקוטר 2 מ"מ (קוטר חיצוני) שיצר זרם של בועות מתחתית צנצנת התרבית, במקום לעבור דרך חלל הראש בפני השטח של הצנצנת. סירקולציית המים וערבובם הנוצרים על ידי זרם הבועות אינם מזיקים אפוא לגדילת הזחלים ולרכישת כשירות, ועשויים להיות להם יתרונות לניסויים הדורשים שיווי משקל מהיר של מי ים תרבותיים לתערובות גזים משתנות, למשל, לניסויים הבוחנים השפעות של מחזורי דיאל בלחצים חלקיים של_CO2 ו- O₂ מומס כגון המתרחשים בסביבות ימיות קרובות לחוף^{20, 21}.

תוצאות מזוקוסמוס הניבו שיעורי גדילה של זחלים העולים על כל אלה שפורסמו ממחקרי מעבדה, כמו גם את הזמן הקצר ביותר לרכישת כשירות למטמורפוזה^22,23. למרות שהתוצאות הנוכחיות הושגו בתנאי שדה שהיו בבירור נוחים מאוד לגדילה והתפתחות של זחלים, השיטה צריכה להיות אינפורמטיבית ביותר לחקר ביצועי הזחלים באתרי שדה המציגים שילובים טבעיים של גורמי עקה סביבתיים, כולל בתי גידול בסיכון ובבתי גידול ירודים שיש בהם עניין למטרות ניהול ותיקון²⁴.

אין ניגודי עניינים לדווח עליהם.

הפיתוח הראשוני של מערכת התרבות המאווררת בנפח נמוך נתמך בחלקו על ידי הקרן הלאומית למדע (CRI-OA-1416690 למכללת דיקינסון). ד"ר לורן מולינו סיפקה באדיבות מתקני מעבדה במכון האוקיינוגרפי וודס הול, שם נאספו הנתונים שהוצגו עבור מערכת זו (איור 4).