Culture en laboratoire et sur le terrain de larves de la patelle slipper, Crepidula fornicata

L’article présente des méthodes de culture larvaire du gastéropode Crepidula fornicata dans un système à l’échelle du laboratoire de petit volume et dans un système de mésocosme d’eau de mer ambiante qui peut être déployé sur le terrain.

Le mollusque gastéropode calyptréide, Crepidula fornicata, a été largement utilisé pour l’étude de la biologie du développement larvaire, de la physiologie et de l’écologie. Les larves véligères couvées de cette espèce ont été récoltées par siphonnage sur un tamis après leur libération naturelle par les adultes, distribuées dans la culture à une densité de 200/L et nourries avec Isochrysis galbana (souche T-ISO) à raison de 1 x 10⁵ cellules/mL. La croissance de la coquille et l’acquisition de la compétence pour la métamorphose ont été documentées chez des larves sœurs élevées dans des cultures ventilées de 800 mL conçues pour s’équilibrer à l’air ambiant ou à des mélanges de gaz atmosphériques définis. Contrastant avec ces conditions de culture en laboratoire ; Des données sur la croissance et la compétence ont également été recueillies pour des larves élevées dans un mésocosme d’eau de mer ambiante de 15 L situé dans une population de champs d’adultes reproducteurs. Les taux de croissance et le moment de la compétence métamorphique dans les cultures de laboratoire étaient similaires à ceux rapportés dans des études publiées précédemment. Les larves élevées dans le mésocosme sur le terrain ont grandi beaucoup plus rapidement et se sont métamorphosées plus tôt que ce qui a été rapporté pour les études de laboratoire. Ensemble, ces méthodes sont adaptées à l’exploration du développement larvaire dans des conditions contrôlées prédéterminées en laboratoire ainsi que dans des conditions naturelles sur le terrain.

La patelle pastel, Crepidula fornicata (Gastropoda : Calyptraeidae), est bien représentée dans la littérature de recherche actuelle et historique en raison de son utilité en tant que modèle de développement et de ses impacts généralisés en tant qu’espèce envahissante. Il a servi d’exemple fondamental de développement spiralique à l’ère classique de l’embryologie expérimentale¹ et a connu un regain d’intérêt avec l’application de l’imagerie moderne et des outils génomiques pour disséquer les mécanismes du développement précoce des lophotrochozoaires ^2,3. À l’autre extrémité de son cycle biologique, d’autres recherches ont porté sur les impacts des populations adultes de cet ingénieur de l’écosystème dans des environnements marins côtiers tempérés très éloignés de son aire de répartition d’origine dans l’est de l’Amérique du Nord ^4,5. Entre l’embryon et l’adulte, les larves véligères de cette espèce ont fait l’objet de nombreuses études sur le développement et l’écologie des larves, en particulier sur les facteurs influençant la croissance et l’acquisition de la compétence pour la métamorphose, les indices internes et externes médiateurs de l’établissement larvaire, et les effets de l’expérience larvaire sur les performances juvéniles 6,7,8,9,10,11 . Des études récentes ont révélé la résilience des larves et des juvéniles de C. fornicata à l’acidification des océans, une autre voie pour une utilisation productive de cet animal à des fins de recherche 12,13,14,15,16.

Un avantage de C. fornicata pour les études de biologie larvaire marine est qu’il est relativement facile de le cultiver en laboratoire dans de l’eau de mer naturelle ou artificielle avec un régime unialgal du flagellé Isochrysis galbana. Les méthodes de culture ont été détaillées par l’auteur dans une publication imprimée antérieure axée sur les méthodes¹⁷. Les raisons de cette contribution sont doubles. Tout d’abord, les manœuvres physiques de routine impliquées dans l’établissement et l’entretien des cultures sont conceptuellement très simples, mais difficiles à réaliser correctement sans démonstration pratique ou vidéo. Deuxièmement, deux variantes des méthodes de culture décrites précédemment sont décrites qui sont particulièrement adaptées aux études en laboratoire et sur le terrain des réponses aux facteurs de stress environnementaux tels que l’acidification des océans, l’eutrophisation et l’épuisement de l’oxygène. Le premier est un système de culture à faible volume (800 ml) adapté à la manipulation du pH et de l’oxygène dissous dans l’eau de mer via de petits volumes de gaz à bulles, et le second est un système de mésocosme de plus grand volume (15 L) qui peut être placé sur le terrain et qui permet le libre échange de l’eau de mer ambiante.

1. Manœuvres de routine pour l’établissement et le maintien des cultures larvaires de C. fornicata

REMARQUE : Cette méthode commence avec un pot d’eau de mer d’un gallon (3,8 L) contenant des C. fornicata adultes qui viennent de libérer des larves véligères couvées. Les adultes peuvent être collectés sur le terrain ou obtenus auprès d’un fournisseur indiqué dans la table des matières. Les adultes sont des hermaphrodites protandres qui vivent en piles d’accouplement avec des femelles sessiles au bas de la pile. Ne brisez pas les piles adultes. La saisonnalité de la reproduction et les méthodes de conditionnement des adultes pour le frai hors saison ont déjà été décrites¹⁷. Il est préférable de recueillir les larves dans les 2 à 3 heures suivant leur libération, lorsqu’elles sont fortement géonégatives et qu’elles se concentrent près de la surface du bocal.

1. Fabriquez un tamis en coupant le fond d’un bécher en plastique jetable à trois coins de 400 ml et en collant un panneau de maille de nylon de 236 μm. À cet effet et en particulier pour la construction en mésocosme (ci-dessous), utilisez une colle thermofusible formulée pour une bonne adhérence au polyéthylène.
2. Retirez l’aération du bocal adulte et laissez-le reposer pendant 15 à 20 minutes afin que les débris se déposent et que les larves puissent nager facilement à la surface.
3. Siphonnez les larves à travers une courte longueur (15-20 cm) de tube de verre de 5 mm fixé à l’extrémité d’une longueur de 60-80 cm de tube d’aquarium en plastique souple dans le tamis préparé comme ci-dessus, suspendu dans un bécher en verre de 600 mL de sorte que l’excès d’eau de mer déborde du bécher en verre tandis que les larves sont retenues sur le tamis. Gardez le fond du tamis sous l’eau et évitez d’échouer les larves.
4. Soulevez brièvement le tamis du bécher et rincez les larves à l’aide d’un flacon d’eau de mer filtrée à l’aide d’un flacon pulvérisateur d’eau de mer filtrée dans un bol en verre de FSW de taille pratique pour être manipulé sous un microscope de dissection de faible puissance.
   REMARQUE : Les larves de C. fornicata prospèrent dans l’eau de mer naturelle filtrée à une salinité proche de 30 ppt ou dans l’eau de mer artificielle Instant Ocean composée jusqu’à 32 ppt. salinité, à 20-25 °C^17,18. Une filtration à < 1 μm est suffisante pour éliminer l’encrassement des protistes épizootiques qui peuvent causer des problèmes dans les cultures de laboratoire.
5. Transférez manuellement et comptez le nombre souhaité de larves dans un bocal de culture à l’aide d’une pipette Pasteur. Pour de meilleurs résultats, utiliser 1 larve/5 mL de volume de culture pour C. fornicata. Comptez les larves et évitez la tentation d’estimer les nombres.
6. Nourrissez les larves avec la ration désirée de microalgues au début de la culture et remplacez les microalgues tous les deux jours lorsque l’eau de culture est remplacée.
   REMARQUE : Un régime alimentaire composé de 1 x 10⁵ cellules/mL d’Isochrysis galbana (souche T-ISO) est un bon régime standard qui donne des taux de croissance en laboratoire presque maximaux. La ration alimentaire et les méthodes de culture du T-ISO sont fournies dans une publication antérieure¹⁷.
7. Changez l’eau de culture tous les deux jours en versant le contenu de la culture dans un tamis à l’intérieur d’un bécher, comme à l’étape 1.3 ci-dessus. Soulevez le tamis et utilisez une bouteille à jet d’eau de FSW pour rincer les larves dans un bocal de culture de FSW frais avec de la nourriture neuve.
   REMARQUE : La meilleure pratique consiste à séparer toute verrerie utilisée pour la culture larvaire et à éviter tout contact de cette verrerie avec des fixateurs, des sels de métaux lourds solubles ou des détergents. Le nettoyage de routine est mieux effectué avec une pâte de bicarbonate de soude (NaHCO₃) et un tampon à récurer en nylon, tandis que les dépôts minéraux peuvent être éliminés avec un lavage acide doux au vinaigre blanc ou au HCl dilué.

2. Construction de cultures ventilées pour les larves de C. fornicata

REMARQUE : Le bocal en verre recommandé (tableau des matériaux) a un couvercle en polypropylène, qui est inerte à l’eau de mer et a la bonne épaisseur pour fixer les entrées de cannelures du tube pour un flux de gaz de ventilation.

1. Percez deux trous de 5 mm dans le couvercle de chaque bocal de culture (y compris la doublure intérieure du couvercle), chacun à environ 1,5 cm du bord et en face l’un de l’autre. (Un foret de machiniste impérial de 13/64 pouce ou un foret de machiniste standard ASME #7 fera également un trou de dégagement approprié).
2. Installez un adaptateur de tube en nylon fileté 1/8 de pouce x 10-32 dans chaque trou, à l’aide d’un écrou en nylon 10-32, avec l’ardillon du tube sur la surface extérieure du couvercle.
3. Appliquez une noisette de mastic d’aquarium en caoutchouc de silicone sur l’ouverture de la partie intérieure filetée de l’un des adaptateurs de tube et poussez un tube en polyéthylène de 20 cm de longueur de 20 mm (diamètre extérieur) à travers l’ouverture de l’intérieur de manière à ce qu’il dépasse de quelques mm l’ouverture extérieure de l’ardillon du tube.
4. Le tube aura maintenant un petit bouchon de scellant d’aquarium à l’extrémité qui dépasse à travers l’ardillon du tube, mais le tube transparent sera visible juste au-delà de l’extrémité de l’ardillon. Laissez le scellant durcir, puis coupez l’extrémité saillante du tube en polyéthylène de manière à ce qu’elle affleure l’extrémité de l’ardillon du tube.
5. Remplissez le bocal de culture avec du FSW jusqu’à 1 cm de l’épaule en haut du bocal, vissez le couvercle et fixez l’air de ventilation ou le mélange de gaz expérimental à l’ardillon du tube qui maintient le tube de ventilation en polyéthylène. Coupez la longueur du tube de ventilation de manière à ce que son extrémité se trouve soigneusement au fond du bocal.
6. Ajustez le débit de l’air de ventilation ou du mélange de gaz pour produire un flux lent de bulles (Figure 1). Utilisez une pompe à air d’aquarium avec des vannes d’aquarium communes pour alimenter la ventilation avec de l’air ambiant ou utilisez des régulateurs de débit massique pour d’autres mélanges expérimentaux de gaz atmosphériques¹⁴.

3. Construction d’une culture en mésocosme déployable sur le terrain pour les larves de C. fornicata

1. Découpez 4 ouvertures rectangulaires uniformément espacées, chacune de 25 cm x 14,5 cm, sur les côtés d’un seau en polyéthylène standard de 7 gallons. Positionnez le bas de chaque ouverture à environ 3,5 cm du fond intérieur du seau (Figure 2A). Une scie sabre électrique portative avec une lame à dents fines est idéale à cet effet. Conservez les déchets découpés et coupez-les dans le sens de la longueur en bandes de 2 cm de large à l’aide d’une scie à table.
2. Découper 4 panneaux de maille de nylon de 236 μm, chacun d’au moins 30 cm x 20 cm, de manière à chevaucher confortablement (d’au moins 2 cm) les ouvertures découpées dans le seau. Fixez temporairement un bord d’un panneau en maille sur un bord long de sa découpe à l’aide de petites pinces à ressort ou de pinces à linge.
3. Collez le bord du panneau en maille à l’ouverture du seau avec de la colle thermofusible formulée pour le polyéthylène. Une fois le premier bord fixé, collez les autres bords tout en maintenant la tension pour obtenir une surface tendue sur le panneau en maille.
4. Coupez les longueurs des bandes de déchets de seau à partir de l’étape 3.1, pour faire des bandes de renforcement pour couvrir soigneusement la zone collée où les panneaux de maille chevauchent les ouvertures du seau. Appuyez sur chaque bande de recouvrement en place avec une quantité généreuse de colle thermofusible, en travaillant rapidement pour mettre chaque bande en place avant que la colle ne durcisse.
5. Fixez l’extrémité de chaque bande à l’aide d’un rivet aveugle en nylon installé à l’extérieur du godet. Coupez l’excès de colle et de maillage des bords extérieurs des bandes de renforcement avec un couteau de rasoir utilitaire.
   REMARQUE : Chaque rivet nécessite un trou pilote de 15/64 pouce. Les parties intérieures (aveugles) des rivets sont visibles à l’intérieur du mésocosme fini de la figure 2B.
6. Déployez le mésocosme dans un rack flottant qui maintient le haut du seau bien au-dessus de l’eau (Figure 2C). Le support flottant illustré est composé de segments de 30 cm de tuyaux en PVC Schedule 40 de 2 pouces, cimentés ensemble avec des joints de coude et de té pour former une structure étanche à l’air qui peut contenir une rangée de 4 mésocosmes répliqués.
7. Selon les conditions locales, les panneaux en maille peuvent être encrassés en 1 à 2 jours, d’une manière qui empêche l’échange d’eau de mer à travers le mésocosme. Dans la mesure où cela se produit, transférez les larves dans un mésocosme frais et propre en tirant le mésocosme encrassé aux 2/3^de l’eau et en l’écopant à plusieurs reprises de son fond dans le mésocosme frais à l’aide d’un pichet de 2 L.
8. Effectuez 20 à 25 itérations pour transférer la plupart des larves, ou jusqu’à ce que les larves ne soient plus observées dans le mésocosme encrassé. Nettoyez le mésocosme encrassé en frottant doucement les panneaux en maille avec une éponge douce chargée d’une pâte de bicarbonate de soude (NaHCO₃) et rincez à l’eau du robinet.

La croissance larvaire et l’acquisition de la compétence pour la métamorphose ont été mesurées dans 4 répétitions simultanées des cultures ventilées de 800 ml, chacune contenant 160 larves, dérivées d’un lot frère de larves qui ont éclos d’une seule masse d’œuf et qui ont été nourries avec Isochrysis galbana à une densité de 1 x 10⁵ cellules/mL. Le pH était de 7,9-8,0, la température de 20-21 °C et la salinité de 30-31 ppt. La croissance et la métamorphose ont également été déterminées avec un lot différent de larves dans un seul essai du mésocosme de 15 L contenant 600 larves, déployé à Buzzards Bay, MA, États-Unis, dans des conditions de pH, de température et de salinité similaires à celles des cultures en laboratoire, mais nourries par du phytoplancton naturel dans l’eau de mer ambiante qui s’écoulait à travers les panneaux de maille du mésocosme. Le pH mesuré était de 7,8-8,3, la température de 20-24 °C et la salinité de 26-28 ppt. La croissance a été déterminée comme un changement de la longueur de la coquille (figure 3). Les larves se sont développées plus rapidement dans le mésocosme (71 μm/jour) que dans les cultures de laboratoire (54 μm/jour) au cours des 4 à 5 premiers jours après l’éclosion (figure 4). Entre le 5e^{et le} 6e^jour, les larves du mésocosme ont commencé à se métamorphoser spontanément, et les larves qui sont restées dans le mésocosme le jour 6 étaient, en moyenne, 181 m plus grosses qu’au jour 5. Il n’y a pas eu d’autres mesures larvaires dans le mésocosme car la plupart des individus s’étaient métamorphosés au jour 7. Dans les cultures de laboratoire, les larves se sont développées à un rythme beaucoup plus lent du jour 4 au jour 8 (41 μm/jour) et du jour 8 au jour 13 (31 μm/jour). Ces larves ont commencé à devenir aptes à la métamorphose le 8e jour et étaient presque toutes aptes au 12e jour, comme le détermine la stimulation de sous-échantillons avec un [K^+] élevé, décrit au⁸. Il y a eu peu de métamorphoses spontanées dans les cultures de laboratoire (<10 %) jusqu’au 13e jour, lorsque l’expérience a pris fin. Le taux de survie était de 91 % à 100 % dans les cultures de laboratoire et n’a pas été déterminé dans le mésocosme en raison de la difficulté d’inspecter et de récupérer tous les individus à partir du volume et des surfaces du mésocosme.

Figure 1 : Installation de culture ventilée. La figure montre des cultures ventilées de 800 mL contenant des larves de Crepidula fornicata, stockées à une densité de 1 larve/5 mL. Notez un mince filet de bulles, particulièrement visible dans les bocaux 2 et 4. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Configuration de la culture du mésocosme déployable sur le terrain. La figure montre un mésocosme de 15 L, (A) une vue latérale, (B) une vue de dessus et (C) une configuration déployée dans un rack flottant. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Larve de Veliger de Crepidula fornicata 4 jours après l’éclosion. La ligne pointillée indique l’axe de mesure de la longueur de la coque. Abréviations : s = coquille ; v = vélum ; f = pied ; o = opercule. Barre d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4 : Croissance des larves de Crepidula fornicata dans des cultures en laboratoire et sur le terrain. Croissance des larves dans des cultures de laboratoire de 800 mL (ligne pointillée, cercles ouverts) et de 15 L de mésocosme de terrain (ligne continue, carrés remplis). Chaque point représente la moyenne de 15 larves de chacune des 4 cultures de laboratoire répétées ou la moyenne de 25 larves d’un seul mésocosme. Les barres d’erreur sont ± 1 SD. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Bien que les larves de C. fornicata soient relativement faciles à élever par rapport à d’autres larves marines planctotrophes, l’attention portée aux principes fondamentaux d’une bonne pratique d’élevage reste essentielle^17,19. Les larves saines devraient commencer à se nourrir immédiatement après l’éclosion. Ceci est facilement vérifié le lendemain de l’éclosion en observant leurs intestins pleins, remplis de cellules d’algues, à l’aide d’un microscope de dissection avec transillumination. Les coquilles des larves saines doivent rester propres, brillantes et exemptes de salissures visibles par des protistes ciliés pédonculés ou des diatomées pennées sessiles, qui se propagent rapidement dans les cultures surpeuplées. L’encrassement de la coquille empêche la nage et l’alimentation, provoque la mortalité et indique généralement que la densité des larves dans l’élevage est trop élevée.

Les taux de croissance larvaire et le moment de la compétence documentés ici dans les cultures de laboratoire ventilées sont similaires aux résultats publiés d’expériences de laboratoire utilisant une version antérieure de cette méthode dans des conditions similaires de densité larvaire, de pH, de température, de salinité et de ration alimentaire 13,14,16. La seule différence substantielle entre la méthode décrite ici et celle utilisée dans ces dernières études est que dans la présente expérience, le flux de gaz de ventilation a été introduit à travers un tube de 2 mm (diamètre extérieur) qui a créé un flux de bulles à partir du fond du bocal de culture, plutôt que d’être passé à travers l’espace de tête à la surface du bocal. La circulation et le mélange de l’eau créés par le courant à bulles ne sont donc pas préjudiciables à la croissance larvaire et à l’acquisition de compétences et peuvent présenter des avantages pour les expériences nécessitant un équilibrage rapide de l’eau de mer d’élevage avec des mélanges gazeux changeants, par exemple, pour des expériences portant sur les effets des cycles diurnes sur les pressions partielles de_CO2 et d’O₂ dissous tels que cela se produit dans les environnements marins côtiers productifs^{20, 21}. Aéroport de Lyna

Les résultats du mésocosme ont donné des taux de croissance larvaire supérieurs à tous ceux qui ont été publiés à partir d’études de laboratoire, ainsi que le temps le plus court pour acquérir la compétence pour la métamorphose^22,23. Bien que les résultats actuels aient été obtenus dans des conditions de terrain qui étaient clairement très favorables à la croissance et au développement des larves, la méthode devrait être des plus informatives pour explorer la performance larvaire dans les sites de terrain qui présentent des combinaisons naturelles de facteurs de stress environnementaux, y compris les habitats en péril et dégradés qui présentent un intérêt à des fins de gestion et d’assainissement²⁴.

Il n’y a aucun conflit d’intérêts à signaler.

Le développement initial du système de culture ventilée à faible volume a été soutenu en partie par la National Science Foundation (CRI-OA-1416690 au Dickinson College). Lauren Mullineaux, Ph. D., a aimablement fourni des installations de laboratoire à l’Institut océanographique de Woods Hole, où les données présentées pour ce système (figure 4) ont été recueillies.