الاستزراع المختبري والميداني ليرقات النعال ، Crepidula fornicata

وتعرض الورقة طرقا لاستزراع يرقات بطنيات الأقدام Crepidula fornicata في نظام صغير الحجم على نطاق مختبري وفي نظام mesocosm لمياه البحر المحيطة يمكن نشره في الميدان.

تم استخدام رخويات بطنيات الأرجل كاليبتريد، Crepidula fornicata، على نطاق واسع لدراسات علم الأحياء التنموي لليرقات، وعلم وظائف الأعضاء، والبيئة. تم جمع يرقات القطيفة الحاضنة من هذا النوع عن طريق السحب على غربال بعد الإطلاق الطبيعي من قبل البالغين ، وتوزيعها في المستزرع بكثافة 200 / لتر ، وتغذيتها ب Isochrysis galbana (سلالة T-ISO) عند 1 × 10⁵ خلايا / مل. تم توثيق نمو القشرة واكتساب الكفاءة للتحول لليرقات الشقيقة التي تمت تربيتها في مزارع 800 مل جيدة التهوية مصممة لتحقيق التوازن مع الهواء المحيط أو لمخاليط غازات الغلاف الجوي المحددة. على النقيض من ظروف الثقافة المختبرية هذه ؛ كما تم جمع بيانات النمو والكفاءة لليرقات التي تمت تربيتها في ميزوكوزم مياه البحر المحيطة المتدفقة بسعة 15 لترا والتي تقع في مجموعة حقلية من البالغين الناضجين المتكاثرين. كانت معدلات النمو وتوقيت الكفاءة المتحولة في الثقافات المختبرية مماثلة لتلك التي تم الإبلاغ عنها في الدراسات المنشورة سابقا. نمت اليرقات التي تربى في حقل mesocosm بشكل أسرع بكثير وتحولت في وقت أقرب مما تم الإبلاغ عنه في أي دراسات معملية. هذه الطرق معا مناسبة لاستكشاف تطور اليرقات في ظل ظروف مضبوطة محددة مسبقا في المختبر وكذلك في ظل الظروف التي تحدث بشكل طبيعي في الحقل.

يتم تمثيل النعال ، Crepidula fornicata (Gastropoda: Calyptraeidae) ، بشكل جيد في الأدبيات البحثية الحالية والتاريخية بسبب فائدته كنموذج تنموي وبسبب تأثيراته الواسعة النطاق كنوع غازي. كان بمثابة مثال تأسيسي للتطور الحلزوني في العصر الكلاسيكي لعلم الأجنة التجريبي¹ وشهد ولادة جديدة للاهتمام مع تطبيق أدوات التصوير والجينوم الحديثة لتشريح آليات التطور المبكر lophotrochozoan ^2,3. في الطرف الآخر من تاريخ حياتها ، ركزت تحقيقات أخرى على تأثيرات السكان البالغين لمهندس النظام البيئي هذا في البيئات البحرية الساحلية المعتدلة البعيدة عن توزيعها الأصلي في شرق أمريكا الشمالية ^4,5. بين الجنين والبالغ ، كانت يرقات veliger من هذا النوع موضوع العديد من الدراسات حول تطور اليرقات والبيئة ، وخاصة العوامل التي تؤثر على النمو واكتساب الكفاءة للتحول ، والإشارات الداخلية والخارجية التي تتوسط استقرار اليرقات ، وآثار تجربة اليرقات على أداء الأحداث^{6،7،8،9،10،11}. كشفت الدراسات الحديثة عن مرونة يرقات وصغار C. fornicata لتحمض المحيطات ، وهو وسيلة أخرى للاستخدام البحثي المنتج لهذا^{12،13،14،15،16}.

من مزايا C. fornicata لدراسات بيولوجيا اليرقات البحرية أنه من السهل نسبيا أن تنمو في المختبر في مياه البحر الطبيعية أو الاصطناعية على نظام غذائي unialgal من السوط Isochrysis galbana. تم تفصيل أساليب الثقافة من قبل المؤلف في منشور مطبوع سابق يركز على الأساليب¹⁷. وأسباب هذه المساهمة ذات شقين. أولا ، المناورات الجسدية الروتينية التي ينطوي عليها إنشاء الثقافات والعناية بها بسيطة للغاية من الناحية المفاهيمية ولكن من الصعب إجراؤها بشكل صحيح دون التدريب العملي أو عرض الفيديو. ثانيا، تم وصف نوعين مختلفين عن طرق الاستزراع الموصوفة سابقا وهما مناسبان بشكل خاص للدراسات المختبرية والميدانية للاستجابات للضغوط البيئية مثل تحمض المحيطات، والتخثث، واستنفاد الأكسجين. أولها نظام استزراع منخفض الحجم (800 مل) مناسب لمعالجة الأس الهيدروجيني والأكسجين المذاب في مياه البحر عبر كميات صغيرة من الغازات الفقاعية ، والثاني هو نظام ميزوكوزم أكبر حجما (15 لتر) يمكن وضعه في الحقل ويسمح بالتبادل الحر لمياه البحر المحيطة.

1. المناورات الروتينية لإنشاء والحفاظ على مزارع اليرقات من C. fornicata

ملاحظة: تبدأ هذه الطريقة بوعاء جالون (3.8 لتر) من مياه البحر يحتوي على C. fornicata البالغة التي أطلقت للتو يرقات veliger الحضنة. يمكن جمع البالغين ميدانيا أو الحصول عليها من مورد مذكور في جدول المواد. البالغون هم خنثى بروتاندروس يعيشون في مداخن التزاوج مع إناث حاضنة لاطئة في قاع المكدس. لا تفتت أكوام الكبار. تم وصف موسمية التكاثر وطرق تكييف البالغين للتفريخ خارج الموسم^{سابقا 17}. من الأفضل جمع اليرقات في غضون 2-3 ساعات بعد إطلاقها عندما تكون سلبية بقوة وستركز بالقرب من سطح الجرة.

1. اصنع غربالا عن طريق قطع الجزء السفلي من دورق بلاستيكي ثلاثي الزوايا سعة 400 مل يمكن التخلص منه واللصق على لوحة من شبكة نايلون 236 ميكرومتر. لهذا الغرض وخاصة لبناء mesocosm (أدناه) ، استخدم غراء تذوب ساخنا تمت صياغته من أجل الالتصاق جيد بالبولي إيثيلين.
2. قم بإزالة التهوية من الجرة البالغة واتركها لمدة 15-20 دقيقة حتى يستقر الحطام ويمكن لليرقات السباحة بسهولة إلى السطح.
3. قم بسحب اليرقات من خلال أنبوب زجاجي قصير الطول (15-20 سم) من 5 مم مثبت في نهاية أنبوب حوض السمك البلاستيكي الناعم بطول 60-80 سم في الغربال المحضر أعلاه ، معلقا في دورق زجاجي سعة 600 مل بحيث تفيض مياه البحر الزائدة على الدورق الزجاجي بينما يتم الاحتفاظ باليرقات على الغربال. الحفاظ على الجزء السفلي من الغربال تحت الماء وتجنب تقطعت بهم السبل اليرقات.
4. ارفع الغربال لفترة وجيزة من الدورق واستخدم زجاجة بخ من مياه البحر المفلترة (FSW) لشطف اليرقات في وعاء زجاجي من FSW بحجم مناسب للتلاعب به تحت مجهر تشريح منخفض الطاقة.
   ملاحظة: تزدهر يرقات C. fornicata في مياه البحر الطبيعية المفلترة بالقرب من 30 جزء في المليون من الملوحة أو مياه البحر الاصطناعية الفورية للمحيطات التي تصل إلى 32 جزء في الألف. الملوحة ، عند 20-25 درجة مئوية^17،18. الترشيح عند < 1 ميكرومتر يكفي للقضاء على الطلائعيات الوبائية الملوثة التي يمكن أن تسبب مشاكل في الثقافات المختبرية.
5. قم بنقل وحساب العدد المطلوب من اليرقات يدويا في جرة استزراع باستخدام ماصة باستور. للحصول على أفضل النتائج، استخدم حجم مزرعة 1 يرقة/5 مل لبكتيريا C. fornicata. عد اليرقات وتجنب إغراء تقدير الأعداد.
6. تغذية اليرقات بالحصة المرغوبة من الطحالب الدقيقة عند بدء الاستزراع واستبدال الطحالب الدقيقة كل يوم عند استبدال مياه الاستزراع.
   ملاحظة: اتباع نظام غذائي من 1 × 10⁵ خلايا / مل Isochrysis galbana (سلالة T-ISO) هو نظام غذائي قياسي جيد ينتج عنه معدلات نمو معملية شبه قصوى. تم توفير الحصص الغذائية وطرق ثقافة T-ISO في منشور سابق¹⁷.
7. قم بتغيير ماء الاستزراع كل يومين عن طريق سكب محتويات المستنبتة في غربال داخل دورق ، كما في الخطوة 1.3 أعلاه. ارفع الغربال واستخدم زجاجة بخ من FSW لشطف اليرقات في جرة استزراع من FSW الطازج مع طعام جديد.
   ملاحظة: أفضل الممارسات هي فصل أي أواني زجاجية تستخدم في استزراع اليرقات وتجنب أي اتصال لتلك الأواني الزجاجية بالمثبتات أو أملاح المعادن الثقيلة القابلة للذوبان أو المنظفات. من الأفضل القيام بالتنظيف الروتيني باستخدام عجينة من صودا الخبز (NaHCO₃) ووسادة تنظيف من النايلون ، بينما يمكن إزالة الرواسب المعدنية بغسل حمض خفيف في الخل الأبيض أو حمض الهيدروكلوريك المخفف.

2. بناء مزارع جيدة التهوية ليرقات C. fornicata

ملاحظة: يحتوي الجرة الزجاجية الموصى بها (جدول المواد) على غطاء من مادة البولي بروبيلين ، وهو خامل لمياه البحر وله سمك مناسب لتثبيت مداخل الأنابيب الشائكة لتيار غاز التهوية.

1. قم بحفر فتحتين مقاس 5 مم في غطاء كل جرة ثقافة (بما في ذلك البطانة الداخلية للغطاء) ، كل منهما على بعد حوالي 1.5 سم من الحافة ومقابل بعضهما البعض. (مثقاب ميكانيكي إمبراطوري مقاس 13/64 بوصة أو # 7 ASME قياسي سيجعل أيضا فتحة خلوص مناسبة).
2. قم بتركيب محول أنابيب نايلون ملولب 1/8 بوصة × 10-32 في كل فتحة ، باستخدام صامولة نايلون 10-32 ، مع شوكة الأنبوب على السطح الخارجي للغطاء.
3. ضع القليل من مانع التسرب المطاطي السيليكوني على فتحة الجزء الداخلي الملولب لأحد محولات الأنابيب وادفع أنبوب البولي إيثيلين بطول 20 سم من 2 مم (القطر الخارجي) عبر الفتحة من الداخل بحيث يبرز بضعة مم خارج الفتحة الخارجية لشوكة الأنبوب.
4. سيحتوي الأنبوب الآن على سدادة صغيرة من مادة مانعة للتسرب في نهاية الحوض تبرز من خلال شوكة الأنبوب ، لكن الأنابيب الشفافة ستكون مرئية بعد نهاية الشوكة مباشرة. دع المادة المانعة للتسرب تعالج ، ثم قم بقص الطرف البارز لأنبوب البولي إيثيلين بحيث يكون متدفقا مع نهاية شوكة الأنبوب.
5. املأ جرة الاستزراع ب FSW في حدود 1 سم من الكتف في الجزء العلوي من الجرة ، وقم بربط الغطاء لأسفل ، وقم بتوصيل هواء التهوية أو إمداد مزيج الغاز التجريبي بشوكة الأنبوب التي تحمل أنبوب تهوية البولي إيثيلين. قم بقص طول أنبوب التهوية بحيث تقع نهايته بدقة في أسفل الجرة.
6. اضبط تدفق الهواء أو مزيج الغاز للتهوية لإنتاج تيار بطيء من الفقاعات (الشكل 1). استخدم مضخة هواء حوض السمك مع صمامات عصابة حوض السمك الشائعة لتزويد التهوية بالهواء المحيط أو استخدم وحدات التحكم في التدفق الشامل لخلطات غازات الغلاف الجوي التجريبية الأخرى¹⁴.

3. بناء مستزرع ميزوكوزم قابل للنشر الميداني ليرقات C. fornicata

1. قطع 4 فتحات مستطيلة متباعدة بشكل متساو ، كل منها 25 سم × 14.5 سم ، في جوانب دلو قياسي من البولي إيثيلين سعة 7 جالون. ضع الجزء السفلي من كل فتحة على بعد حوالي 3.5 سم من الجزء السفلي الداخلي للدلو (الشكل 2 أ). يعتبر منشار السيف الكهربائي المحمول باليد بشفرة ذات أسنان دقيقة مثاليا لهذا الغرض. احتفظ بقطع النفايات المقطوعة وقم بتقطيعها بالطول إلى شرائح بعرض 2 سم باستخدام منشار طاولة.
2. قم بقطع 4 ألواح من شبكة نايلون 236 ميكرومتر ، كل منها لا يقل عن 30 سم × 20 سم ، وذلك لتداخل بشكل مريح (بمقدار 2 سم على الأقل) فتحات القطع في الجرافة. قم بتأمين حافة واحدة من اللوحة الشبكية مؤقتا على حافة طويلة من الفتحة باستخدام مشابك زنبركية صغيرة أو مشابك غسيل.
3. قم بلصق حافة اللوحة الشبكية بفتحة الجرافة باستخدام غراء تذوب ساخن مصمم للبولي إيثيلين. بمجرد تثبيت الحافة الأولى ، قم بلصق الحواف الأخرى مع الحفاظ على التوتر للحصول على سطح مشدود على اللوحة الشبكية.
4. قم بقص أطوال شرائط قطع نفايات الجرافة من الخطوة 3.1 ، لعمل شرائط تقوية لتغطية المنطقة الملصقة بدقة حيث تتداخل الألواح الشبكية مع فتحات الجرافة. اضغط على كل شريط تغطية في مكانه بكمية كبيرة من الغراء الذائب الساخن ، واعمل بسرعة لوضع كل شريط في مكانه قبل أن يصلب الغراء.
5. قم بتأمين نهاية كل شريط باستخدام برشام ستار من النايلون مثبت من خارج الجرافة. تقليم الغراء الزائد وشبكة من الحواف الخارجية لشرائط التسليح بسكين الحلاقة فائدة.
   ملاحظة: يتطلب كل برشام فتحة تجريبية مقاس 15/64 بوصة. تظهر الأجزاء الداخلية (العمياء) من المسامير داخل الميزوكوزم النهائي في الشكل 2 ب.
6. انشر mesocosm في رف عائم يحمل الجزء العلوي من الدلو فوق الماء جيدا (الشكل 2C). الرف العائم الموضح مصنوع من شرائح 30 سم من أنابيب PVC 2 بوصة Schedule 40 ، مثبتة مع وصلات الكوع ونقطة الإنطلاق لإنشاء هيكل محكم الإغلاق يمكنه استيعاب صف من 4 mesocosms مكررة.
7. اعتمادا على الظروف المحلية ، قد تصبح الألواح الشبكية فاسدة في غضون 1-2 أيام ، بطريقة تعيق تبادل مياه البحر عبر الميزوكوزم. إلى الحد الذي يحدث فيه هذا ، انقل اليرقات إلى ميزوكوزم نظيف طازج عن طريق سحب الميزوكوزم الملوث 2/3^من الماء والإنقاذ بشكل متكرر من قاعه إلى الميزوكوزم الطازج باستخدام إبريق سعة 2 لتر.
8. قم بإجراء 20-25 تكرارا لنقل معظم اليرقات ، أو حتى لا يتم ملاحظة اليرقات في الميزوكوزم الملوث. نظف الميزوكوزم الملوث عن طريق فرك الألواح الشبكية برفق باستخدام إسفنجة ناعمة محملة بعجينة من صودا الخبز (NaHCO₃) وشطفها بماء الصنبور.

تم قياس نمو اليرقات واكتساب الكفاءة للتحول في 4 تكرارات متزامنة من 800 مل من المستنبتات المهواة ، كل منها يحتوي على 160 يرقة ، مشتقة من مجموعة شقيقة من اليرقات التي فقست من كتلة بيضة واحدة والتي تم تغذيتها Isochrysis galbana بكثافة 1 × 10⁵ خلايا / مل. كان الرقم الهيدروجيني 7.9-8.0 ، وكانت درجة الحرارة 20-21 درجة مئوية ، وكانت الملوحة 30-31 جزء في الألف. كما تم تحديد النمو والتحول مع مجموعة شقيقة مختلفة من اليرقات في تجربة واحدة من 15 L mesocosm تحتوي على 600 يرقة ، تم نشرها في خليج Buzzards ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية ، في ظل ظروف مماثلة من درجة الحموضة ودرجة الحرارة والملوحة مثل مزارع المختبر ، ولكن تغذيها العوالق النباتية الطبيعية في مياه البحر المحيطة التي تدفقت عبر الألواح الشبكية للعالم المتوسط. كان الرقم الهيدروجيني المقاس 7.8-8.3 ، وكانت درجة الحرارة 20-24 درجة مئوية ، والملوحة 26-28 جزء في الألف. تم تحديد النمو على أنه تغيير في طول القشرة (الشكل 3). نمت اليرقات بشكل أسرع في الميزوكوزم (71 ميكرومتر / يوم) مقارنة بالمزارع المختبرية (54 ميكرومتر / يوم) خلال أول 4-5 أيام بعد الفقس (الشكل 4). بين^{5 و 6 أيام ،} بدأت اليرقات في mesocosm في التحول تلقائيا ، وكانت اليرقات التي بقيت في mesocosm في اليوم 6 ، في المتوسط ، 181 ميكرومتر أكبر من اليوم 5. لم تكن هناك قياسات يرقية أخرى من الميزوكوزم لأن معظم الأفراد قد تحولوا بحلول اليوم 7. نمت اليرقات في المستنبتات المختبرية بمعدل أبطأ بكثير من اليوم 4 إلى اليوم 8 (41 ميكرومتر / يوم) ومن اليوم 8 إلى اليوم 13 (31 ميكرومتر / يوم). بدأت هذه اليرقات في أن تصبح مؤهلة للتحول في اليوم 8 وكانت جميعها تقريبا مختصة بحلول اليوم 12 ، كما هو محدد من خلال تحفيز العينات الفرعية ذات الارتفاع [K ⁺] ، الموصوفة في⁸. كان هناك القليل من التحول التلقائي في الثقافات المختبرية (<10٪) خلال اليوم 13 ، عندما تم إنهاء التجربة. كان البقاء على قيد الحياة 91٪ -100٪ في مزارع المختبر ولم يتم تحديده في الميزوكوزم بسبب صعوبة فحص واستعادة جميع الأفراد من حجم الميزوكوزم والأسطح.

الشكل 1: إعداد ثقافة جيدة التهوية. يوضح الشكل 800 مل من المستنبتات المهواة التي تحتوي على يرقات Crepidula fornicata ، مخزنة بكثافة 1 يرقة / 5 مل. لاحظ تيارا رقيقا من الفقاعات ، مرئيا بشكل خاص في الجرار 2 و 4. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: إعداد ثقافة mesocosm القابلة للنشر الميداني. يوضح الشكل 15 لترا من الميزوكوزم ، (أ) المنظر الجانبي ، (ب) المنظر العلوي ، و (ج) الإعداد المنشور في الرف العائم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: يرقة Veliger من Crepidula fornicata في 4 أيام بعد الفقس. يشير الخط المتقطع إلى محور قياس طول القشرة. الاختصارات: s = shell ؛ v = القطيفة ؛ و = قدم ؛ س = أوبركولوم. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4: نمو يرقات كريبيدولا فورنيكاتا في المزارع المعملية والحقلية. نمو اليرقات في المستنبتات المختبرية 800 مل (خط متقطع ، دوائر مفتوحة) و 15 لتر ميزوكوزم الحقل (خط صلب ، مربعات مملوءة). تمثل كل نقطة متوسط 15 يرقة من كل من 4 مزارع مختبرية مكررة أو متوسط 25 يرقة من عالم متوسط واحد. أشرطة الخطأ ± 1 SD. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

على الرغم من أن يرقات C. fornicata سهلة نسبيا للاستزراع مقارنة باليرقات البحرية الأخرى ذات التغذية العوالق، إلا أن الاهتمام بأساسيات ممارسة الاستزراع الجيد لا يزال ضروريا^17،19. يجب أن تبدأ اليرقات السليمة في التغذية مباشرة بعد الفقس. يمكن التحقق من ذلك بسهولة في اليوم التالي للفقس من خلال مراقبة أحشائهم الكاملة ، المليئة بخلايا الطحالب ، باستخدام مجهر تشريح مع إضاءة متحولة. يجب أن تظل أصداف اليرقات السليمة نظيفة ومشرقة وخالية من التلوث المرئي من قبل الطلائعيات الهدبية المطاردة أو الدياتومات اللاطئة ، والتي تنتشر بسرعة في الثقافات المزدحمة. تمنع تلوث القشرة السباحة والتغذية ، وتسبب الوفيات ، وعادة ما تكون مؤشرا على أن كثافة اليرقات في الاستزراع عالية جدا.

تتشابه معدلات نمو اليرقات وتوقيت الكفاءة الموثقة هنا في المزارع المختبرية ذات التهوية مع النتائج المنشورة من التجارب المعملية باستخدام نسخة سابقة من هذه الطريقة في ظل ظروف مماثلة لكثافة اليرقات ودرجة الحموضة ودرجة الحرارة والملوحة والحصص الغذائية^13،14،16. الفرق الجوهري الوحيد بين الطريقة الموصوفة هنا والطريقة المستخدمة في الدراسات الأخيرة هو أنه في التجربة الحالية ، تم إدخال تيار غاز التهوية من خلال أنبوب 2 مم (القطر الخارجي) الذي خلق تيارا من الفقاعات من قاع جرة الاستزراع ، بدلا من تمريره عبر مساحة الرأس على سطح الجرة. وبالتالي فإن دوران المياه وخلطها الناتج عن تيار الفقاعات ليس ضارا بنمو اليرقات واكتساب الكفاءة وقد يكون له مزايا للتجارب التي تتطلب توازنا سريعا لمياه البحر المستزرعة مع مزيج الغاز المتغير ، على سبيل المثال ، للتجارب التي تبحث في آثار دورات diel في الضغوط الجزئية لثاني أكسيد الكربون₂ و O₂ المذاب كما يحدث في البيئات البحرية المنتجة القريبة من^{الشاطئ 20 ، 21}.

أسفرت نتائج Mesocosm عن معدلات نمو اليرقات تزيد عن أي معدلات تم نشرها من الدراسات المختبرية ، وكذلك أقصر وقت لاكتساب الكفاءة للتحول^22,23. على الرغم من أن النتائج الحالية تم الحصول عليها في ظل ظروف حقلية من الواضح أنها مواتية جدا لنمو اليرقات وتطورها ، إلا أن الطريقة يجب أن تكون مفيدة للغاية لاستكشاف أداء اليرقات في المواقع الميدانية التي تظهر مجموعات تحدث بشكل طبيعي من الضغوطات البيئية ، بما في ذلك الموائل المعرضة للخطر والمتدهورة التي تهم أغراض الإدارة والمعالجة²⁴.

لا يوجد تضارب في المصالح للإبلاغ عنه.

تم دعم التطوير الأولي لنظام الاستزراع منخفض التهوية جزئيا من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم (CRI-OA-1416690 إلى كلية ديكنسون). تفضلت الدكتورة لورين مولينو بتوفير مرافق المختبرات في معهد وودز هول لعلوم المحيطات ، حيث تم جمع البيانات المقدمة لهذا النظام (الشكل 4).