Labor- und Feldkultur von Larven des Pantoffelzuwandes, Crepidula fornicata

In der Arbeit werden Methoden für die Larvenkultur der Schnecke Crepidula fornicata in einem kleinvolumigen System im Labormaßstab und in einem Umgebungs-Meerwasser-Mesokosmen-System vorgestellt, die im Feld eingesetzt werden können.

Die Calyptraeide-Schnecke, Crepidula fornicata, wurde häufig für Studien zur Entwicklungsbiologie, Physiologie und Ökologie der Larven verwendet. Gebrütete Veligerlarven dieser Art wurden nach der natürlichen Freisetzung durch adulte Tiere auf ein Sieb gefüttert, mit einer Dichte von 200/l in die Kultur verteilt und mit Isochrysis galbana (Stamm T-ISO) in einer Menge von 1 x 10⁵ Zellen/ml gefüttert. Das Schalenwachstum und der Erwerb von Kompetenz für die Metamorphose wurden für Geschwisterlarven dokumentiert, die in belüfteten 800-ml-Kulturen aufgezogen wurden, die für das Gleichgewicht mit Umgebungsluft oder definierten atmosphärischen Gasgemischen ausgelegt waren. Im Gegensatz zu diesen Laborkulturbedingungen; Wachstums- und Kompetenzdaten wurden auch für Larven gesammelt, die in einem 15-Liter-Durchfluss-Meerwasser-Mesokosmen aufgezogen wurden, der sich in einer Feldpopulation reproduktiver adulter Tiere befand. Die Wachstumsraten und der Zeitpunkt der metamorphen Kompetenz in den Laborkulturen waren ähnlich wie in zuvor veröffentlichten Studien. Larven, die im Feldmesokosmen gezüchtet wurden, wuchsen viel schneller und metamorphosierten sich früher, als in Laborstudien berichtet wurde. Zusammen eignen sich diese Methoden sowohl für die Erforschung der Larvenentwicklung unter vorgegebenen kontrollierten Bedingungen im Labor als auch unter natürlich vorkommenden Bedingungen im Freiland.

Die Pantoffelschnecke, Crepidula fornicata (Gastropoda: Calyptraeidae), ist in der aktuellen und historischen Forschungsliteratur aufgrund ihrer Nützlichkeit als Entwicklungsmodell und ihrer weitreichenden Auswirkungen als invasive Art gut vertreten. Sie diente als grundlegendes Beispiel für die spiralische Entwicklung im klassischen Zeitalter der experimentellen Embryologie¹ und erlebte mit der Anwendung moderner bildgebender und genomischer Werkzeuge zur Entschlüsselung der Mechanismen der frühen Entwicklung von Lophotrochozoen eine Wiedergeburt des Interesses ^2,3. Am anderen Ende seiner Lebensgeschichte konzentrierten sich andere Untersuchungen auf die Auswirkungen erwachsener Populationen dieses Ökosystem-Ingenieurs in gemäßigten Küstenmeeresumgebungen, die weit von seiner ursprünglichen Verbreitung im östlichen Nordamerika entfernt sind ^4,5. Zwischen Embryo und adultem Tier waren die Veliger-Larven dieser Art Gegenstand zahlreicher Studien zur Larvenentwicklung und -ökologie, insbesondere zu Faktoren, die das Wachstum und den Erwerb von Kompetenz zur Metamorphose beeinflussen, den internen und externen Signalen, die die Ansiedlung der Larven vermitteln, und den Auswirkungen der Larvenerfahrung auf die Leistung der Jungtiere 6,7,8,9,10,11 . Jüngste Studien haben die Widerstandsfähigkeit von Larven und Jungtieren von C. fornicata gegenüber der Ozeanversauerung gezeigt, ein weiterer Weg für eine produktive Forschungsnutzung dieses Tieres 12,13,14,15,16.

Ein Vorteil von C. fornicata für Untersuchungen der Biologie von Meereslarven besteht darin, dass es relativ einfach ist, sie im Labor in natürlichem oder künstlichem Meerwasser auf einer unialgalen Diät des Flagellaten Isochrysis galbana zu züchten. Kulturmethoden wurden vom Autor in einer früheren, methodenorientierten Printpublikation ausführlich beschrieben¹⁷. Der vorliegende Beitrag hat zwei Gründe. Erstens sind die routinemäßigen körperlichen Manöver, die mit der Etablierung und Pflege von Kulturen verbunden sind, konzeptionell sehr einfach, aber ohne praktische oder Videodemonstration schwer korrekt durchzuführen. Zweitens werden zwei Varianten der zuvor beschriebenen Kulturmethoden beschrieben, die sich besonders für Labor- und Feldstudien zu Reaktionen auf Umweltstressoren wie Ozeanversauerung, Eutrophierung und Sauerstoffmangel eignen. Das erste ist ein Kultursystem mit geringem Volumen (800 ml), das für die Manipulation des pH-Werts und des gelösten Sauerstoffs im Meerwasser über kleine Volumina von Blasengasen geeignet ist, und das zweite ist ein Mesokosmensystem mit größerem Volumen (15 l), das im Feld platziert werden kann und den freien Austausch von Meerwasser ermöglicht.

1. Routinemäßige Manöver zur Etablierung und Pflege von Larvenkulturen von C. fornicata

HINWEIS: Diese Methode beginnt mit einem 3,8 l fassenden Glas Meerwasser, das adulte C. fornicata enthält, die gerade gebrütete Veligerlarven freigelassen haben. Adulte Tiere können vor Ort gesammelt oder von einem in der Materialtabelle angegebenen Lieferanten bezogen werden. Bei den adulten Pflanzen handelt es sich um protandröse Hermaphroditen, die in Paarungshaufen mit sitzenden brütenden Weibchen am unteren Ende des Stapels leben. Brechen Sie keine Stapel für Erwachsene auf. Die Saisonalität der Fortpflanzung und Methoden zur Konditionierung der erwachsenen Tiere auf das Laichen außerhalb der Saison wurden bereits beschrieben¹⁷. Die Larven werden am besten innerhalb von 2-3 Stunden nach der Freisetzung gesammelt, wenn sie stark geonegativ sind und sich in der Nähe der Oberfläche des Glases konzentrieren.

1. Stellen Sie ein Sieb her, indem Sie den Boden eines 400-ml-Einwegbechers aus Kunststoff mit drei Ecken abschneiden und eine Platte aus 236 μm Nylonnetz aufkleben. Verwenden Sie zu diesem Zweck und insbesondere für die Mesokosmenkonstruktion (unten) einen Schmelzkleber, der für eine gute Haftung auf Polyethylen formuliert ist.
2. Entfernen Sie die Belüftung aus dem erwachsenen Glas und lassen Sie es 15-20 Minuten stehen, damit sich Schmutz absetzt und die Larven leicht an die Oberfläche schwimmen können.
3. Saugen Sie die Larven durch ein kurzes Stück (15-20 cm) von 5 mm Glasrohr, das am Ende eines 60-80 cm langen Aquarienschlauchs aus weichem Kunststoff befestigt ist, in das wie oben vorbereitete Sieb ab, das in einem 600-ml-Glasbecherglas aufgehängt ist, so dass überschüssiges Meerwasser über das Glasbecherglas läuft, während die Larven auf dem Sieb zurückgehalten werden. Halten Sie den Boden des Siebs unter Wasser und vermeiden Sie strandende Larven.
4. Heben Sie das Sieb kurz aus dem Becherglas und spülen Sie die Larven mit einer Spritzflasche mit gefiltertem Meerwasser (FSW) in eine Glasschüssel mit FSW, die eine praktische Größe hat, um sie unter einem Präpariermikroskop mit geringer Leistung zu manipulieren.
   HINWEIS: Larven von C. fornicata gedeihen in gefiltertem natürlichem Meerwasser mit einem Salzgehalt von bis zu 30 ppt oder in künstlichem Meerwasser von Instant Ocean mit einem Salzgehalt von bis zu 32 ppt bei 20-25 °C^17,18. Eine Filtration bei < 1 μm ist ausreichend, um die Verschmutzung epizootischer Protisten zu eliminieren, die in Laborkulturen Probleme verursachen können.
5. Übertragen und zählen Sie die gewünschte Anzahl von Larven manuell mit einer Pasteurpipette in ein Kulturgefäß. Für beste Ergebnisse verwenden Sie 1 Larve/5 ml Kulturvolumen für C. fornicata. Zählen Sie die Larven und widerstehen Sie der Versuchung, Zahlen zu schätzen.
6. Füttern Sie die Larven mit der gewünschten Ration an Mikroalgen, wenn die Kultur gestartet wird, und ersetzen Sie die Mikroalgen jeden zweiten Tag, wenn das Kulturwasser ausgetauscht wird.
   HINWEIS: Eine Diät von 1 x 10⁵ Zellen/ml Isochrysis galbana (Stamm T-ISO) ist eine gute Standarddiät, die nahezu maximale Laborwachstumsraten liefert. Die Futterration und die Methoden für die Kultivierung von T-ISO sind in einer früheren Veröffentlichung¹⁷ enthalten.
7. Wechseln Sie das Kulturwasser jeden zweiten Tag, indem Sie den Inhalt der Kultur in ein Sieb in einem Becherglas gießen, wie in Schritt 1.3 oben. Heben Sie das Sieb heraus und spülen Sie die Larven mit einer Spritzflasche FSW in ein Kulturglas mit frischem FSW mit neuem Futter.
   HINWEIS: Es empfiehlt sich, alle Glaswaren, die für die Larvenzucht verwendet werden, zu trennen und jeglichen Kontakt dieser Glaswaren mit Fixiermitteln, löslichen Schwermetallsalzen oder Reinigungsmitteln zu vermeiden. Die routinemäßige Reinigung erfolgt am besten mit einer Paste aus Backpulver (NaHCO₃) und einem Nylon-Scheuerschwamm, während mineralische Ablagerungen mit einer milden Säurewäsche in weißem Essig oder verdünntem HCl entfernt werden können.

2. Bau von belüfteten Kulturen für Larven von C. fornicata

HINWEIS: Das empfohlene Glasgefäß (Materialtabelle) hat einen Polypropylendeckel, der gegenüber Meerwasser inert ist und die richtige Dicke für die Befestigung von Schlaucheinlässen für einen belüfteten Gasstrom hat.

1. Bohren Sie zwei 5 mm große Löcher in den Deckel jedes Kulturglases (einschließlich der Innenauskleidung des Deckels), jeweils etwa 1,5 cm vom Rand entfernt und gegenüberliegend. (Ein 13/64-Zoll-Zoll- oder #7-ASME-Standard-Maschinistenbohrer macht auch ein entsprechendes Durchgangsloch).
2. Installieren Sie in jedem Loch einen 1/8 Zoll x 10-32 Gewindeadapter aus Nylon mit einer 10-32 Nylonmutter, wobei der Schlauchwiderhaken an der Außenfläche des Deckels angebracht ist.
3. Tragen Sie einen Klecks Aquariendichtmittel aus Silikonkautschuk auf die Öffnung des Gewindeinnenteils eines der Schlauchadapter auf und schieben Sie einen 20 cm langen 2 mm (Außendurchmesser) Polyethylenschlauch von innen durch die Öffnung, so dass er einige mm über die äußere Öffnung der Schlauchtülle hinausragt.
4. Der Schlauch hat nun einen kleinen Stopfen Aquariendichtmittel am Ende, der durch den Schlauchwiderhaken ragt, aber der durchsichtige Schlauch ist direkt hinter dem Ende des Schlauchs sichtbar. Lassen Sie das Dichtmittel aushärten und schneiden Sie dann das hervorstehende Ende des Polyethylenschlauchs so ab, dass es bündig mit dem Ende des Schlauchwiderhakens abschließt.
5. Füllen Sie das Kulturglas bis zu einem Abstand von 1 cm von der Schulter an der Oberseite des Glases mit FSW, schrauben Sie den Deckel fest und befestigen Sie die Belüftungsluft- oder Versuchsgasgemischzufuhr an der Schlauchtülle, die den Belüftungsschlauch aus Polyethylen hält. Kürzen Sie die Länge des Beatmungsschlauchs so, dass sein Ende sauber am Boden des Glases liegt.
6. Passen Sie den Durchfluss des Belüftungsluft- oder Gasgemisches so an, dass ein langsamer Blasenstrom entsteht (Abbildung 1). Für die Belüftung mit Umgebungsluft ist eine Aquarienluftpumpe mit gängigen Aquarien-Gang-Ventilen zu verwenden, oder für andere experimentelle atmosphärische Gasgemische ist ein Massendurchflussregler zu verwenden¹⁴.

3. Aufbau einer im Feld einsetzbaren Mesokosmenkultur für Larven von C. fornicata

1. Schneiden Sie 4 gleichmäßig verteilte rechteckige Öffnungen von jeweils 25 cm x 14,5 cm in die Seiten eines Standard-7-Gallonen-Polyethyleneimers. Positionieren Sie den Boden jeder Öffnung etwa 3,5 cm vom inneren Boden des Eimers entfernt (Abbildung 2A). Eine handgeführte elektrische Säbelsäge mit feinverzahnter Klinge ist dafür ideal. Bewahren Sie die ausgeschnittenen Abfallstücke auf und schneiden Sie sie mit einer Tischkreissäge längs in 2 cm breite Streifen.
2. Schneiden Sie 4 Platten aus 236 μm Nylonnetz mit einer Größe von mindestens 30 cm x 20 cm aus, um die Ausschnittöffnungen im Eimer bequem (um mindestens 2 cm) zu überlappen. Befestigen Sie vorübergehend eine Kante einer Gitterplatte mit kleinen Federklemmen oder Wäscheklammern über einer langen Kante des Ausschnitts.
3. Kleben Sie den Rand der Gitterplatte mit Schmelzkleber, der für Polyethylen formuliert ist, auf die Eimeröffnung. Sobald die erste Kante befestigt ist, kleben Sie die anderen Kanten unter Beibehaltung der Spannung fest, um eine straffe Oberfläche auf der Mesh-Platte zu erhalten.
4. Schneiden Sie die Streifen der Eimerabfallstücke aus Schritt 3.1 ab, um Verstärkungsstreifen herzustellen, die den geklebten Bereich, an dem die Gitterplatten die Schaufelöffnungen überlappen, sauber abdecken. Drücken Sie jeden Abdeckstreifen mit einer großzügigen Menge Schmelzkleber an Ort und Stelle und arbeiten Sie schnell, um jeden Streifen an Ort und Stelle zu bringen, bevor der Kleber aushärtet.
5. Befestigen Sie das Ende jedes Streifens mit einem Nylon-Blindniet, der von der Außenseite des Eimers angebracht wird. Schneiden Sie überschüssigen Kleber und Netz von den Außenkanten der Verstärkungsstreifen mit einem Rasiermesser ab.
   HINWEIS: Für jeden Niet ist ein 15/64-Zoll-Pilotloch erforderlich. Die inneren (blinden) Teile der Nieten sind auf der Innenseite des fertigen Mesokosmos in Abbildung 2B sichtbar.
6. Platzieren Sie den Mesokosmen in einem schwimmenden Gestell, das die Oberseite des Eimers weit über Wasser hält (Abbildung 2C). Das gezeigte schwimmende Gestell besteht aus 30 cm langen Segmenten aus 2 Zoll Schedule 40 PVC-Rohren, die mit Ellbogen- und T-Fugen zu einer luftdichten Struktur verklebt sind, die eine Reihe von 4 replizierten Mesokosmen aufnehmen kann.
7. Abhängig von den örtlichen Bedingungen können die Netzpaneele innerhalb von 1-2 Tagen verschmutzt sein, so dass der Austausch von Meerwasser durch den Mesokosmen behindert wird. In dem Maße, in dem dies geschieht, überführen Sie die Larven in einen frischen, sauberen Mesokosmos, indem Sie den verschmutzten Mesokosmen zu 2/3^aus dem Wasser ziehen und wiederholt mit einem 2-Liter-Krug von seinem Boden in den frischen Mesokosmen springen.
8. Führen Sie 20-25 Iterationen durch, um die meisten Larven zu übertragen, oder bis keine Larven mehr im verschmutzten Mesokosmen beobachtet werden. Reinigen Sie den verschmutzten Mesokosmos, indem Sie die Netzpaneele vorsichtig mit einem weichen Schwamm schrubben, der mit einer Paste aus Backpulver (NaHCO₃) gefüllt ist, und spülen Sie ihn mit Leitungswasser ab.

Das Larvenwachstum und der Erwerb der Kompetenz für die Metamorphose wurden in 4 gleichzeitigen Replikaten der 800 ml beatmeten Kulturen gemessen, die jeweils 160 Larven enthielten, die von einer Geschwistercharge von Larven stammten, die aus einer einzigen Eimasse geschlüpft waren und mit Isochrysis galbana in einer Dichte von 1 x 10⁵ Zellen/ml gefüttert wurden. Der pH-Wert lag bei 7,9-8,0, die Temperatur bei 20-21 °C und der Salzgehalt bei 30-31 ppt. Wachstum und Metamorphose wurden auch mit einer anderen Geschwistercharge von Larven in einem einzigen Versuch mit dem 15-Liter-Mesokosmen mit 600 Larven bestimmt, der in Buzzards Bay, MA, USA, unter ähnlichen Bedingungen in Bezug auf pH, Temperatur und Salzgehalt wie die Laborkulturen eingesetzt wurde, aber von natürlichem Phytoplankton im umgebenden Meerwasser gefüttert wurde, das durch die Netzpaneele des Mesokosmos floss. Der gemessene pH-Wert lag bei 7,8-8,3, die Temperatur bei 20-24 °C und der Salzgehalt bei 26-28 ppt. Das Wachstum wurde als Änderung der Schalenlänge bestimmt (Abbildung 3). Die Larven wuchsen in den ersten 4-5 Tagen nach dem Schlüpfen im Mesokosmos (71 μm/Tag) schneller als in den Laborkulturen (54 μm/Tag) (Abbildung 4). Zwischen dem 5^. und 6^. Tag begannen sich die Larven im Mesokosmen spontan zu metamorphosieren, und die Larven, die am Tag 6 im Mesokosmos verblieben waren, waren im Durchschnitt 181 μm größer als am Tag 5. Es gab keine weiteren Larvenmessungen aus dem Mesokosmos, da sich die meisten Individuen bis zum 7. Tag metamorphosiert hatten. Die Larven in den Laborkulturen wuchsen von Tag 4 bis Tag 8 (41 μm/Tag) und von Tag 8 bis Tag 13 (31 μm/Tag) deutlich langsamer. Diese Larven begannen am 8. Tag für die Metamorphose kompetent zu werden und waren am 12. Tag fast alle in der Lage, wie durch Stimulation von Unterproben mit erhöhtem [K⁺] bestimmt wurde, die in⁸ beschrieben wurden. Es gab nur geringe spontane Metamorphosen in den Laborkulturen (<10%) bis zum Tag 13, an dem das Experiment beendet wurde. Die Überlebensrate lag in den Laborkulturen bei 91%-100% und wurde im Mesokosmen nicht bestimmt, da es schwierig war, alle Individuen aus dem Mesokosmenvolumen und den Oberflächen zu untersuchen und zu bergen.

Abbildung 1: Aufbau der belüfteten Kultur. Die Abbildung zeigt 800 ml belüftete Kulturen, die Larven von Crepidula fornicata enthielten, die mit einer Dichte von 1 Larve/5 ml bestückt wurden. Man beachte einen dünnen Strahl von Blasen, der besonders in den Gläsern 2 und 4 zu sehen ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Aufbau einer vor Ort einsetzbaren Mesokosmenkultur. Die Abbildung zeigt den 15-Liter-Mesokosmen, (A) die Seitenansicht, (B) die Draufsicht und (C) den Aufbau in einem schwebenden Rack. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Veliger-Larve von Crepidula fornicata 4 Tage nach dem Schlüpfen. Die gestrichelte Linie zeigt die Achse der Schalenlängenmessung an. Abkürzungen: s = Schale; v = Velum; f = Fuß; o = Operculum. Maßstabsleiste = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Wachstum von Larven von Crepidula fornicata in Labor- und Feldkulturen. Wachstum der Larven in 800 mL Laborkulturen (gestrichelte Linie, offene Kreise) und 15 L Feldmesokosmen (durchgezogene Linie, gefüllte Quadrate). Jeder Punkt stellt den Mittelwert von 15 Larven aus jeder von 4 replizierten Laborkulturen oder den Mittelwert von 25 Larven aus einem einzigen Mesokosmen dar. Die Fehlerbalken beziehen sich ± 1 SD. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Obwohl die Larven von C. fornicata im Vergleich zu anderen planktotrophen Meereslarven relativ einfach zu kultivieren sind, ist die Beachtung der Grundlagen der guten Kulturpraxis nach wie vor unerlässlich^17,19. Gesunde Larven sollten sofort nach dem Schlüpfen mit der Nahrungsaufnahme beginnen. Dies lässt sich am Tag nach dem Schlüpfen leicht überprüfen, indem man ihre vollen Eingeweide, die mit Algenzellen gefüllt sind, mit einem Präpariermikroskop mit Durchleuchtung beobachtet. Die Schalen gesunder Larven sollten sauber, hell und frei von sichtbarer Verschmutzung durch gestielte Flimmertierprotisten oder sitzende pennatäre Kieselalgen bleiben, die sich in überfüllten Kulturen schnell ausbreiten. Schalenbewuchs hemmt das Schwimmen und Fressen, führt zum Tod und ist in der Regel ein Hinweis darauf, dass die Dichte der Larven in der Kultur zu hoch ist.

Die Wachstumsraten der Larven und der Zeitpunkt der Kompetenz, die hier in den beatmeten Laborkulturen dokumentiert sind, ähneln den veröffentlichten Ergebnissen aus Laborexperimenten mit einer früheren Version dieser Methode unter ähnlichen Bedingungen der Larvendichte, des pH-Werts, der Temperatur, des Salzgehalts und der Futterration 13,14,16. Der einzige wesentliche Unterschied zwischen dem hier beschriebenen Verfahren und dem in den letztgenannten Studien verwendeten Verfahren besteht darin, dass im vorliegenden Versuch der Belüftungsgasstrom durch ein Rohr von 2 mm (Außendurchmesser) eingeführt wurde, das einen Blasenstrom vom Boden des Kulturgefäßes erzeugte, anstatt über den Kopfraum an der Oberfläche des Glases geleitet zu werden. Die durch den Blasenstrom erzeugte Wasserzirkulation und -durchmischung ist daher für das Larvenwachstum und den Kompetenzerwerb nicht schädlich und kann Vorteile für Experimente haben, die ein schnelles Gleichgewicht des Kulturmeerwassers mit wechselnden Gasgemischen erfordern, z. B. für Experimente, die die Auswirkungen von Tageszyklen in den Partialdrücken von CO₂ und gelöstem O₂ untersuchen, wie sie in produktiven küstennahen Meeresumgebungen auftreten^{20, 21}. Urheberrecht

Die Ergebnisse der Mesokosmen zeigten Wachstumsraten der Larven, die über den bisher veröffentlichten Laborstudien lagen, sowie die kürzeste Zeit bis zum Erwerb der Kompetenz für die Metamorphose ^22,23. Obwohl die vorliegenden Ergebnisse unter Feldbedingungen erzielt wurden, die eindeutig sehr günstig für das Wachstum und die Entwicklung von Larven waren, sollte die Methode am aussagekräftigsten für die Untersuchung der Larvenleistung an Feldstandorten sein, die natürlich vorkommende Kombinationen von Umweltstressoren aufweisen, einschließlich gefährdeter und degradierter Lebensräume, die für Management- und Sanierungszwecke von Interesse sind²⁴.

Es gibt keine Interessenkonflikte, die gemeldet werden müssen.

Die anfängliche Entwicklung des belüfteten Kultursystems mit geringem Volumen wurde teilweise von der National Science Foundation unterstützt (CRI-OA-1416690 an das Dickinson College). Dr. Lauren Mullineaux stellte freundlicherweise Laboreinrichtungen an der Woods Hole Oceanographic Institution zur Verfügung, wo die für dieses System vorgestellten Daten (Abbildung 4) gesammelt wurden.