Tipo de fibra e análise subcelular-específica do conteúdo de gotícula lipídica no músculo esquelético

Evidências crescentes indicam que a infiltração excessiva de lipídios dentro do músculo esquelético resulta em lipotoxicidade e diabetes. Aqui, apresentamos um protocolo completo, incluindo processamento de tecidos, coloração com Bodipy, aquisição de imagens e análise, para quantificar o tamanho, densidade e distribuição subcelular de gotículas lipídicas de forma específica do tipo fibra.

A infiltração de lipídios musculares esqueléticos, conhecida como micosteatose, aumenta com obesidade e envelhecimento. A miostetose também foi descoberta recentemente como um fator prognóstico negativo para vários outros transtornos, como doenças cardiovasculares e câncer. A infiltração excessiva de lipídios diminui a massa e a força muscular. Também resulta em lipotoxicidade e resistência à insulina, dependendo do teor total de lipídio intramialcelular, morfologia de gotícula lipídica (LD) e distribuição subcelular. O tipo de fibra (oxidativo versus glicolítico) também é importante, uma vez que as fibras oxidativas têm maior capacidade de utilizar lipídios. Devido às suas implicações cruciais na fisiopatologia, estudos aprofundados sobre a dinâmica ld e função de forma específica do tipo de fibra são justificados.

Aqui, é apresentado um protocolo completo para a quantificação do conteúdo lipídudo intramyocelular e análise da morfologia LD e distribuição subcelular de forma específica do tipo de fibra. Para isso, as crioseções musculares em série foram manchadas com o corante fluorescente Bodipy e anticorpos contra isoformas de cadeia pesada de miosina. Este protocolo permite o processamento simultâneo de diferentes músculos, economizando tempo e evitando possíveis artefatos e, graças a uma macro personalizada criada em Fiji, a automatização da análise LD também é possível.

A infiltração de lipídios musculares esqueléticos, conhecida como micosteatose, aumenta com obesidade e envelhecimento. A miostetose está negativamente correlacionada com massa muscular e força e com sensibilidade à insulina¹. Além disso, estudos recentes indicam que o grau de mostetose poderia ser usado como fator prognóstico para outras condições como doença cardiovascular², doença hepática gordurosa não alcoólica³ ou câncer⁴. Lipídios podem se acumular no músculo esquelético entre as fibras musculares como lipídios extramyocelulares ou dentro das fibras, como lipídios intramyocelulares (IMCLs). Os IMCLs são predominantemente armazenados como triglicérides em gotículas lipídicas (LDs) que são usadas como combustível metabólico durante o exercício físico ^5,6. No entanto, quando a oferta lipídica excede a demanda, ou quando as mitocôndrias se tornarem disfuncionais, os IMCLs serão implicados na resistência à insulina muscular, como visto em indivíduos metabolicamente insalubres, obesos e em pacientes com diabetes tipo 2⁷. Curiosamente, os atletas de resistência têm níveis semelhantes, se não mais elevados, de IMCLs aos encontrados em pacientes obesos com diabetes mellitus tipo 2, mantendo alta sensibilidade à insulina. Esse fenômeno é descrito como o "paradoxo do atleta"^8,9, e é explicado por uma avaliação mais matizada de LDs musculares, relacionadas ao seu tamanho, densidade, localização, dinâmica e composição de espécies lipídicas.

Primeiro, o tamanho do LD está inversamente correlacionado à sensibilidade à insulina e ao condicionamento físico^10,11. De fato, LDs menores exibem uma área de superfície relativamente maior para a ação de lipase e, portanto, potencialmente têm maior capacidade de mobilizar lipídios¹². Em segundo lugar, a densidade LD (número/superfície) desempenha um papel controverso na ação de insulina ^8,10; ainda, parece ser aumentado em atletas. Em terceiro lugar, a localização subcelular de LDs é importante, uma vez que os LDs localizados logo abaixo da membrana superficial (subsarcolemmal ou periférico) exercem um efeito mais deletério sobre a sensibilidade à insulina do que os centrais ^8,9,13. Estas últimas fornecem combustível para mitocôndrias centrais, que possuem maior atividade respiratória e são mais especializadas para atender à alta demanda energética necessária para a contração¹⁴. Em contrapartida, os LDs periféricos fornecem mitocôndrias subsarcolemmal, que estão envolvidas nos processos relacionados à membrana⁸. Finalmente, além dos triglicérides, lipídios complexos específicos dentro do músculo podem ser mais deletérios do que outros. Por exemplo, diaciglicerol, acicl-CoA de cadeia longa e ceramidas podem se acumular em músculos quando a taxa de rotatividade de triglicérides é baixa, prejudicando assim a sinalização de insulina ^9,15. Voltando ao "paradoxo do atleta", os atletas de resistência têm um alto número de LDs centrais menores com taxas de rotatividade elevadas nas fibras tipo I (oxidativa), enquanto pacientes obesos e diabéticos têm LDs periféricos maiores com baixas taxas de rotatividade nas fibras tipo II (glicolítico) ^8,15,16. Além de seu papel no armazenamento e liberação de energia, os LDs via ácidos graxos derivados (FA) e uma proteína de casaco (perilipin 5) também poderiam funcionar como atores críticos envolvidos na regulação transcricional da oxidação da FA e biogênese mitocondrial⁸. Devido às suas implicações cruciais na fisiologia e na fisiopatologia, estudos aprofundados sobre dinâmicas e funções de LDs são justificados.

Embora existam várias técnicas para estudar IMCLs, elas não são todas adequadas para quantificar com precisão o tamanho, a densidade e a distribuição de LD de forma específica. Por exemplo, a avaliação de IMCLs por espectroscopia de ressonância magnética, embora não invasiva, oferece um nível de resolução que não é suficiente para estudar o tamanho e a localização precisa de LDs dentro da fibra, e não é específica do tipo fibra ^17,18. Da mesma forma, técnicas bioquímicas realizadas em homogeneizadores musculares^{inteiros 19} não podem avaliar a localização e o tamanho dos lipídios. Consequentemente, o método mais adequado para analisar a morfologia e localização de LD é a microscopia eletrônica de transmissão quantitativa¹³, mas essa técnica é cara e demorada. Portanto, a fluorescência confocal em preparações com corantes como Oil Red O (ORO)^20,21, monodansylpentane (MDH)²², ou Bodipy 23,24,25, emergiu como a melhor ferramenta para esses estudos.

Aqui, é descrito um protocolo completo, incluindo amostragem e processamento de tecidos, coloração bodipy e aquisição e análise de imagem confocal para quantificar o tamanho, o número e a localização de LD em crioseções musculares de camundongos. Uma vez que as IMCLs não são distribuídas uniformemente entre fibras oxidativas e glicolíticas, e cada tipo de fibra regula a dinâmica LD de forma diferente, o estudo das IMCLs deve ser específico do tipo fibra 16,25,26,27. Portanto, este protocolo utiliza imunofluorescência em seções seriais para identificar isoform(s) de cadeia pesada de miosina (MyHC) expressa por cada fibra. Outra vantagem deste protocolo é o processamento simultâneo de um músculo glicolítico (extensor digitorum longus, EDL) e um músculo oxidativo (soleus) colocado lado a lado antes de congelar (Figura 1). Esse processamento simultâneo não só economiza tempo, mas também evita a variabilidade devido ao processamento separado das amostras.

Figura 1: Visão geral do procedimento. Após dissecção muscular (1), músculos selecionados de tamanho semelhante são preparados e congelados juntos (2). Seções transversais em série de 10 μm são obtidas usando um criostat e montadas diretamente em slides de adesão (3). A partir de dois slides seriais, o primeiro (4A) é imunolabeled para laminina e manchado com Bodipy para reconhecer LDs e o segundo (4B) é imunossumado com anticorpos contra MyHCs para o reconhecimento de tipos de fibras musculares. As imagens são adquiridas usando um microscópio confocal para Bodipy (5A) e um microscópio de epifluorescência para tipos de fibras musculares (5B). As imagens são analisadas em Fiji aplicando um limiar e quantificando partículas (6A) para obter o número, tamanho médio, densidade e percentual da área total ocupada por LDs (7) ou células de contagem (6B) para obter a porcentagem de fibras de cada tipo na seção (7). Abreviaturas: LDs = gotículas lipídicas; EDL = extensor digitorum longus; MyHCs = isoforms de cadeia pesada de miosina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Todos os procedimentos realizados em camundongos foram aprovados pelo Comitê de Ética para Experimentação Animal do Setor Médico da Université Catholique de Louvain (2019/UCL/MD/013).

1. Dissecção e preparação das amostras para congelamento

1. Rotule um pedaço de rolha de 3 mm de espessura para cada par de músculos.
2. Através de uma pequena incisão feita com uma lâmina no centro da rolha, insira perpendicularmente uma peça retangular de plástico rígido (0,5 cm W, 1 cm H) que servirá como suporte (Figura 2B).
   NOTA: O tamanho da peça de plástico retangular dependerá do tamanho do músculo. Aqui, as dimensões descritas são adaptadas ao tamanho do soleus (~9 mgs, 1 cm L, 2-3 mm W) e EDL (~5 mgs, 1 cm L, 2-3 mm W) de um rato masculino C57BL/6J de 3 meses de idade.
3. No momento da dissecção, remova o sola e o EDL do membro traseiro do rato. Para evitar que as amostras sequem durante a dissecção, coloque-as em uma compressa levemente umedecida com solução salina em uma placa de Petri colocada no gelo.
   NOTA: Consulte Wang et ^al.28 para obter explicações sobre como dissecar esses dois músculos dos membros.
4. Coloque uma pequena gota do composto de temperatura de corte ideal (OCT) na junção de cortiça/plástico, evitando bolhas de ar.
5. Elimine o excesso de umidade das amostras secando-as suavemente com uma toalha de papel (Figura 2A) e coloque ambos os músculos no perpendicular plástico à rolha (Figura 2C).
6. Verifique a orientação dos myofibers musculares sob um microscópio estéreo (Figura 2D).
   NOTA: É importante não cobrir o músculo com OCT, uma vez que seu efeito isolante evitaria o congelamento rápido e produziria artefatos congelantes.

2. Congelar amostras de músculo esquelético para criosectioning

ATENÇÃO: O congelamento do músculo deve ser feito sob uma capa química, usando equipamentos de proteção individual adequados (veja a Tabela de Materiais).

1. Use um tumbler de aço inoxidável (~8 cm H, 6 cm Ø) com duas correias laterais presas a ele com pelo menos 25 cm de comprimento (Figura 2F), e encha o tumbler até 2/3 de sua capacidade com isopia.
2. Agarrando o tumbler pelas correias, mergulhe-o suavemente em uma caixa de poliestireno cheia de nitrogênio líquido para que o nível de nitrogênio fora do recipiente esteja acima do nível de isopentano dentro (Figura 2F,G).
   ATENÇÃO: Quando o tumbler entra em contato com o nitrogênio, o choque térmico pode causar rodírio. Certifique-se de que o tumbler está suficientemente imerso, mas evite a entrada de nitrogênio, pois isso causaria precipitação isofentane. Se isso acontecer, deixe a isopentane esfriar, encha o tumbler com novo isopentane e comece de novo.
3. Quando o interior do tumbler estiver completamente coberto com uma camada branca sólida de isopentane, tire-o da caixa de nitrogênio líquido (Figura 2H).
   NOTA: A temperatura de fusão da isopentane é de -159 °C, as bordas do tumbler ficarão brancas quando estiver fria o suficiente.
4. Mexa suavemente as peças de isopentane sólidas no isopentane líquido restante com fórceps até que todo o volume se torne líquido novamente.
5. Remerque o tumbler no nitrogênio líquido até que a isopentane forme seixos brancos por todo o fundo e bordas do tumbler (Figura 2G,H).
   NOTA: Esta segunda etapa de resfriamento garante a temperatura de congelamento adequada da isopentane.
6. Remova o tumbler do nitrogênio líquido e mergulhe rapidamente os músculos na parte inferior do tumbler, segurando a rolha com pinça de dente de rato. Gire a rolha por 15 s na isopentane e armazene-a a -80 °C até o processamento (Figura 2I).
   NOTA: Para armazenamento a curto prazo, as amostras podem ser mantidas em um congelador de -20 °C. O protocolo completo para o congelamento rápido do músculo esquelético já foi publicado em outros lugares. Para obter referências detalhadas e solução de problemas, consulte: Meng et ^al.29, Kumar et ^al.30 e Leiva-Cepas et ^al.31.

3. Criosectioning

1. Leve as amostras para a câmara de um criostat previamente resfriado a -20 °C e a temperatura da lâmina está definida para -25 °C.
   NOTA: Transportar amostras do congelador -20 °C/-80 °C até o criostat em uma caixa de poliestireno cheia de gelo seco e permitir que as amostras se equilibrem por pelo menos 20-30 minutos até a temperatura da câmara antes de cortar.
2. Retire o plástico da rolha com pinças finas e coloque o disco do espécime criostat na placa de congelamento rápido para esfriar. Uma vez que a placa tenha atingido -50 °C, coloque algum OCT no disco e coloque rapidamente a rolha em cima do disco, pressionando firmemente. Aguarde até que o OCT se solidifique e a rolha esteja bem fixada no disco.
3. Coloque o disco sobre a cabeça do objeto na orientação de corte desejada (Figura 2J,K) e corte o bloco muscular além de pelo menos 1/3 do comprimento dos músculos e até que ambas as seções transversais dos músculos sejam visíveis.
4. Coloque a espessura de corte em 10 μm e coloque uma seção em um slide de adesão para verificar a orientação correta das fibras em um microscópio de campo brilhante.
   NOTA: Verificar a orientação transversal das fibras é fundamental. Se as fibras não estiverem adequadamente orientadas, ajuste o ângulo da cabeça do objeto, corte outra seção e verifique novamente.
5. Coloque duas seções transversais em série em dois slides de adesão pré-rotulados: um slide para determinar tipos de fibra, o outro para quantificar o conteúdo lipídico (Figura 2L).
   NOTA: Podem ser obtidas seções transversais adicionais e mantidas a -80 °C para outros estudos histológicos. No entanto, para evitar alterar o conteúdo lipídudo e a morfologia intracelular²⁴, é essencial processar os dois primeiros slides imediatamente após o corte para evitar a secagem do ar. Congelar e descongelar os slides para quantificação LD teria o mesmo efeito e, portanto, é altamente desaconselhável.

4. Digitação de fibras e coloração bodipy

1. Detecção imunohistoquímica do tipo de fibra muscular
   NOTA: Para o protocolo a seguir, um volume total de solução de 250 μL é suficiente para cobrir toda a seção muscular cercada por um círculo desenhado com uma caneta hidrofóbica do tamanho aproximado de uma moeda de 1 centavo.
   1. Cerque as seções com um contorno desenhado com uma caneta hidrofóbica e enxágue com soro fisiológico com fosfato de 0,1 M (PBS) por 1 min a temperatura ambiente (RT). Coloque o slide em uma câmara úmida e bloqueie por 90 min a 37 °C na solução de bloqueio (soro de cabra 10% normal (NGS) e 1:30 mouse on mouse (MOM) bloqueando reagente em PBS).
   2. Remova a solução de bloqueio e incuba os slides por 90 min a 37 °C com a solução contendo os anticorpos primários (5% de NGS, 1:30 MOM bloqueador reagente, os anticorpos primários do rato para reconhecer o tipo I (IgG2b, à 1:10), tipo IIa (IgG1, às 1:10), e tipo IIx (IgM, em 1:5) fibras e um anti-laminina de rato (cadeia α2, 1:1.000) na PBS.
   3. Lave os slides com PBS 3 x 5 min no RT.
   4. Incubar os slides no escuro por 1 h no RT com a solução contendo os anticorpos secundários (anti-IgG2b AF405 (1:500), anti-IgG1 AF488 (1:500), anti-IgM AF568 (1:1.000) e anti-laminina de cabra AF647 (1:500) na PBS).
      ATENÇÃO: Para o resto do protocolo, certifique-se de manter os slides longe da luz para preservar a fluorescência.
   5. Lave novamente 3 x 5 min em PBS, enxágue em H₂O duplamente destilado, remova o excesso de água e monte com um reagente antifade.
      NOTA: Armazene os slides a 4 °C, protegidos da luz para preservar a fluorescência até a aquisição da imagem. Como os slides não são fixos, recomenda-se usar soluções recém-feitas para cada experimento, autoclave o PBS e adquira as imagens o mais rápido possível para evitar a contaminação das seções.
2. Mancha de LDs com Bodipy
   NOTA: Semelhante ao passo 4.1., um volume total de solução de 250 μL é suficiente para cobrir toda a seção muscular cercada por um círculo desenhado com uma caneta hidrofóbica do tamanho aproximado de uma moeda de 1 centavo.
   1. Cerque as seções com um contorno desenhado por uma caneta hidrofóbica e enxágue com pbs gelado de 0,1 M por 10 min na RT. Use PBS gelado para todas as lavagens e lavagens.
   2. Corrija com paraformaldeído frio de 4% (PFA) sem metanol por 10 minutos no RT. Depois de uma primeira lavagem rápida, lave os slides com PBS 3 x 5 min no RT.
      ATENÇÃO: Execute esta etapa sob um capô químico.
   3. Coloque o slide em uma câmara úmida e bloqueie por 1h no RT com 5% de NGS em PBS.
   4. Incubar os slides por 90 min a 37 °C com a solução do anticorpo primário (2% NGS e anti-laminina de rato (cadeia α2, 1:1.000) em PBS). Lave os slides com PBS 3 x 5 min no RT.
      ATENÇÃO: Para o resto do protocolo, certifique-se de manter os slides longe da luz para preservar a fluorescência.
   5. Incubar por 1 h na RT com a solução secundária de anticorpos contendo anticorpo anti-rato-AF647 (1:500) em PBS. Lave os slides com PBS 3 x 5 min no RT.
   6. Incubar por 20 min em RT com uma solução de 4',6-diamidino-2-fenilôndole (DAPI, 0,5 μg/mL) e BODIPY (1 μg/mL) em PBS.
      NOTA: Para preparar a solução de estoque BODIPY, dissolva-a em DMSO a uma concentração de 1 mg/mL. Diferentes formulações bodipy estão disponíveis comercialmente para coloração LD. Dependendo da escolha feita, o método de coloração é o mesmo (mesmos passos, concentração e tempo de incubação); no entanto, o método de aquisição será ligeiramente diferente.
   7. Depois de uma primeira lavagem rápida, lave os slides com PBS 3 x 5 min no RT, enxágue em H₂O duplamente destilado, remova o excesso de água e monte com um reagente antifado.
      NOTA: Armazene os slides a 4 °C, protegidos da luz, para preservar a fluorescência até a aquisição da imagem.

5. Aquisição de imagens

NOTA: Uma vez concluídos os protocolos de coloração, é importante proceder imediatamente à aquisição de imagens (dentro das seguintes 24h), não apenas para evitar contaminação, mas também para preservar a morfologia, tamanho e número de LDs.

1. Aquisição de imagens para avaliar os tipos de fibras de cada músculo amostrado
   NOTA: Esta etapa pode ser alcançada com um microscópio de varredura de fluorescência de lâmina total ou com um microscópio de epifluorescência convencional. Com esta última, a costura manual ou automatizada das imagens deve ser feita para reconstruir a seção.
   1. Para reconhecimento do tipo de fibra, utilize um microscópio de epifluorescência com um objetivo de 10x/0.3. Selecione filtros de excitação para DAPI (405 nm), FITC, TRITC e Cy5 para detectar as fibras tipo I, IIa, IIx e laminina, respectivamente.
      NOTA: As fibras IIb tipo não serão imunolabeladas. Eles serão reconhecidos como fibras manchadas por laminina nos limites do sarcolemma com um sarcoplasmo preto.
   2. Ajuste o tempo de exposição adequado para cada canal.
   3. Ao usar um microscópio de epifluorescência convencional, sempre adquira as imagens de todo o músculo seguindo a mesma ordem para facilitar a reconstrução muscular. Certifique-se de que as fibras na borda direita de uma imagem também apareçam na borda esquerda da imagem a seguir. O mesmo se aplica às partes superior e inferior das imagens (Figura 3A).
      NOTA: Como referência, para uma seção do EDL ou do soleus dissecado de um rato de 3 meses de idade, uma média de seis e oito imagens, respectivamente, cobrirá toda a seção transversal muscular.
   4. Depois que o músculo é escaneado, carregue as imagens digitais capturadas em qualquer software de processamento de imagem para reconstrução (costura), com base na morfologia de fibras (laminina) e na histologia da seção muscular, e salve-a como um arquivo TIFF, PNG ou JPG com todos os canais (cores) mesclados (Figura 3A).
2. Aquisição de imagens com co-coloração de laminina e Bodipy
   NOTA: Para reconhecer o tipo de fibra e ter uma estimativa do número de fibras para cada tipo capturado, é essencial ter a seção do tipo fibra já escaneada e os músculos reconstruídos antes de iniciar a aquisição de imagem de Bodipy-laminin (Figura 3B).
   1. Para observação e aquisição de imagem Bodipy, use um microscópio confocal com uma lente objetiva de imersão de óleo de 40x com uma abertura numérica de 1,4.
   2. Use as seguintes configurações: pinhole a 1 UA, resolução de 2.048 pixels x 2.048 pixels, tamanho do pixel a 0,08 μm, modo unidirecional, velocidade de varredura em 4 (~4 μs/pixel), linha de média definida para 4x e zoom digital definido para 1.
   3. Para evitar conversas cruzadas entre Bodipy-558/568 e laminin-AF647, use o modo de varredura sequencial no software confocal.
      NOTA: Quando o corante escolhido é Bodipy-493/503, a varredura simultânea de laser confocal é possível sem conversa cruzada entre o canal Bodipy e o canal laminin-AF647. Isso acelerará a aquisição de imagens.
   4. Excite Bodipy-493/503 usando a linha laser de 488 nm ou linha laser de argônio, e excite Bodipy-555/568 usando a linha laser de diodo de 561 nm. Finalmente, detecte laminin-AF647 com uma linha laser de diodo de 640 nm.
      ATENÇÃO: Tenha em mente que as moléculas bodipy são muito sensíveis ao fotobleaching, por isso evite a varredura desnecessária a laser. Para reconhecer fibras, use apenas o laser para laminina.
   5. Dependendo do corante escolhido, defina as faixas de emissão em 570-650 nm para Bodipy-493/503²⁴ e em 565-620 nm para Bodipy-558/568. Defina a faixa de emissão para laminina em 656-700 nm.
   6. Defina o ganho e o ganho digital adequadamente para que nenhum pixel saturado seja detectado no indicador de intervalo. Corrija o sinal de fundo ajustando o deslocamento.
      NOTA: A seleção do filtro e outros parâmetros de varredura acima mencionados devem ser otimizados para cada microscópio confocal. É importante que todas as configurações acima mencionadas sejam mantidas constantes para que todas as imagens capturadas a partir de amostras sejam comparadas.
   7. Para identificar o tipo de fibra entre os visualizados no microscópio confocal, utilize um laptop pessoal no qual a imagem da seção reconstruída após a imunodedoca do tipo fibra seja verificada (Figura 3B).
   8. Uma vez que um grupo de fibras é corretamente identificado, adquira a imagem com os canais Bodipy e laminin.
      NOTA: Recomenda-se observar o nome da imagem Bodipy-laminin na região do músculo onde essas fibras estão localizadas na imagem adquirida para o reconhecimento myHC para facilitar a análise posterior de fibras específicas de LDs.

6. Análise de imagens

1. Análise dos tipos de fibras em cada amostra muscular
   1. Em Fiji (ou ImageJ)³², abra o arquivo TIFF, PNG ou JPG com o músculo reconstruído obtido a partir da fusão de todos os canais utilizados para detectar as isoformas de fibra.
   2. Para iniciar a ferramenta Contagem de células , clique em Plugins | Analisar | Contador de células | Contador de células.
   3. Na janela do contador Celular , clique em Ações | Inicialize.
   4. Em Contadores na mesma janela, selecione Tipo 1.
   5. Na janela principal de Fiji, selecione a ferramenta Varinha .
   6. Para quantificar o número de fibras de cada tipo, clique em cada fibra do mesmo tipo, para que o programa registra o número de fibras clicadas.
   7. Uma vez terminado, selecione o próximo tipo de fibra e repita os mesmos passos.
   8. Quando todas as fibras da imagem tiverem sido atribuídas a um determinado tipo de fibra, clique em Resultados na janela Contador de células para exibir os resultados em uma tabela.
   9. Salve esta tabela como uma tabela de planilha clicando em Arquivo | Salve Como na janela Resultados .
   10. Salve e recarregue as seleções na mesma imagem a qualquer momento clicando em Salvar marcadores ou marcadores de carga, respectivamente, na janela Contagem de células .
2. Análise de gotículas lipídicas de forma dependente de fibras
   1. Analise as imagens de Bodipy e laminina obtidas no confocal usando Fiji para quantificação de LDs.
      NOTA: Os autores criaram uma macro personalizada para automatizar a análise. Esta macro, juntamente com uma explicação passo a passo sobre como usá-la, está disponível como Arquivo Suplementar 1 e Arquivo Suplementar 2, respectivamente.
   2. Abra cada imagem com o auxílio do Importador de Bioformitos de Fiji. Na opção Exibir pilha com opção, selecione Hyperstack | Modo de cor, Padrão. Certifique-se de que a janela Escala automática esteja selecionada.
      NOTA: As seguintes etapas descreverão o protocolo para a análise de uma fibra na imagem, mas deve ser repetido tantas vezes quanto o número de fibras inteiras aparecem na imagem.
   3. Use a ferramenta de seleção à mão livre para selecionar manualmente o sarcolemma da fibra com base no canal laminin (Figura 4A) e pressione T no teclado para gravar a seleção ou Região de Interesse (ROI) na janela ROI .
   4. Vá até a janela principal de Fiji e clique em Analisar | Defina medidas e na janela pop-up, selecione Área e diâmetro de Feret. Deixe as caixas restantes desmarcadas e outros parâmetros à medida que aparecem por padrão.
   5. Clique em Medir na janela ROI para obter a Área e o Diâmetro Mínimo do Feret (MF) da fibra selecionada e observe-as para uso posterior.
      NOTA: Ao analisar LDs, é importante ter em mente que seu tamanho e densidade variam entre o centro e a periferia (região subsarcolemmal-SS) da fibra. Portanto, a análise deve ser feita separadamente.
   6. Calcule o valor de 1/6 do MF para delimitar a parte central da fibra.
      NOTA: Na macro, o valor mf padrão é definido para 6, o que significa que a redução aplicada será definida como 1/6 do MF. Esse valor foi escolhido com base nos dados empíricos obtidos do soleus dos animais alimentados com uma dieta rica em gordura. No entanto, cada pesquisador deve alterar esse número com base nos dados empíricos e nos músculos analisados, no tipo de fibra e na condição animal.
   7. Na janela ROI , clique em Adicionar para ter uma duplicata do primeiro ROI e selecione o segundo ROI que aparece na janela.
   8. Na janela principal de Fiji, clique em Editar | | de seleção Amplie e introduza o valor calculado anteriormente (a partir da etapa 6.2.6.) com um sinal de menos antes do número e clique em OK. Na janela ROI, clique em Adicionar[t] (um terceiro ROI deve aparecer) e Excluir, para excluir o segundo ROI.
      NOTA: O pesquisador pode conferir os resultados clicando na caixa Mostrar Tudo na janela roi . Neste ponto, devem aparecer dois ROIs, um que circunda todo o perímetro da fibra (Figura 4B) e outro que é colocado no centro (Figura 4C).
   9. Selecione ambos os ROIs na janela ROI e clique em Mais | XOR | Adicione[t]. Aguarde que um terceiro ROI apareça, o que corresponde à periferia da fibra (Figura 4D).
   10. Salve os ROIs clicando em Mais | Economize para salvar os ROIs no caso de uma reanálise posterior das mesmas fibras ser necessária.
   11. Selecione o canal Bodipy e abra a ferramenta Limiar clicando em Imagem | Ajuste | Limiar na janela principal de Fiji.
   12. Na janela pop-up Threshold , defina os valores para 70/255, selecione Yen | Método B&W e clique em | de fundo escuro Inscreva-se.
       NOTA: Os valores aplicados no Limiar podem variar dependendo das condições do experimento e o limiar deve ser adequadamente definido para otimizar a análise. Uma janela B&W com o sinal Bodipy acima do limite de limiar mostrado em branco e o fundo em preto deve aparecer (compare a imagem Bodipy original na Figura 4E com a da Figura 4F).
   13. Vá até a janela principal de Fiji e clique em Analisar | Defina medidas e na janela pop-up, selecione Área, Fração de área e Limite ao limite. Deixe as caixas restantes desmarcadas e outros parâmetros à medida que aparecem por padrão.
       NOTA: Se o pesquisador quiser analisar a "circularidade" dos LDs, que é um índice da morfologia esférica que varia de 1 para uma esfera perfeita a 0 para uma linha, clique na caixa de descritores de forma da janela pop-up Set Measurements .
   14. Vá para a janela do ROI e selecione o primeiro ROI. Na janela principal de Fiji, clique em Analisar | Analise a ferramenta de partículas.
       NOTA: Esta ferramenta quantifica o número, tamanho, área coberta e porcentagem da área total coberta por partículas em cada seleção e salva os resultados como um arquivo de planilha.
   15. Defina os valores de 2 a Infinity (2-Infinity) na janela Analisar partículas , verifique a caixa Pixels , mantenha os valores de circularidade padrão, selecione Resumo e clique em OK.
       NOTA: Para verificar os resultados da fibra, na opção Mostrar , selecione qualquer uma das opções disponíveis. Para ter as informações de cada LD reconhecidas na seleção em uma tabela, verifique a opção Resultados de Exibição na janela Analisar partículas . Os resultados da análise da área total da fibra são mediados e resumidos em uma tabela com várias colunas (Contagem, Área Total, Tamanho Médio, % Área; estas correspondem ao número de partículas [LDs], a área ocupada por essas partículas, seu tamanho médio, e a porcentagem da área total da seleção ocupada por partículas, respectivamente). Para calcular a densidade, divida o número de partículas pela área total de cada seleção.
   16. Para obter os valores do centro e da periferia da fibra, repita as etapas 6.2.14 e 6.2.15, selecionando o segundo (centro) e o terceiro ROI (periferia) de cada vez.
   17. Salve os resultados clicando em Arquivo | Guarde como na janela Resumo .
       NOTA: Inclua o tipo de fibra, a condição e o nome da imagem no nome atribuído dos resultados para facilitar a unificação posterior e a análise estatística dos dados. Para analisar o resto das fibras na mesma imagem, repita as etapas 6.2.3 a 6.2.17. Para a análise estatística, pelo menos 10-15 fibras de cada tipo devem ser analisadas por animal.

O protocolo descrito aqui fornece um método eficiente para quantificar facilmente os LDs de forma subcelular e subcelular. Mostra como, congelando juntos dois músculos de tamanho semelhante, como o EDL e o soleus, o tempo e os recursos gastos nas etapas seguintes são reduzidos pela metade.

Um protocolo completo é fornecido para imunostaining, aquisição de imagem e análise dos diferentes isoformes MyHC expressos em músculos de camundongos adultos. Este protocolo é baseado no primeiro projetado por Schiaffino et al. em 1989³³, com alguns ajustes como o uso de um anticorpo adicional para rotular laminina. Esta modificação posterior é fundamental para a localização das fibras tipo IIb, que serão pretas, pois não estão manchadas com qualquer anticorpo. Como mostrado na Figura 5, este protocolo imunohistoquímico não só permite o reconhecimento de fibras lentas -oxidativas (tipo I e IIa) e fibras glicolíticos rápidas (tipo IIx e IIb), mas também a presença de fibras híbridas (ver asterisco na Figura 5D). Além disso, ter as seções transversais de ambos os músculos no mesmo slide permite a comparação das proporções de cada tipo de fibra entre os dois músculos selecionados, garantindo que as condições experimentais fossem idênticas em ambas as seções.

Para rotulagem LD, os resultados aqui apresentados baseiam-se no uso de Bodipy-558/568 C₁₂ como corante lipídeo; no entanto, o leitor é encaminhado a um excelente documento de protocolo detalhando o uso do corante clássico Bodipy-493/503 nas seções musculares²³. O protocolo apresentado combinou a coloração de LDs com base na imunohistoquímica contra α2-laminina para distinguir o sarcolemma de fibra. Assim como no experimento do tipo fibra, esse passo é essencial, não apenas para o reconhecimento de fibras individuais, mas também para análise subsequente de lipídios nas regiões central e periférica das fibras (Figura 4). Uma das etapas críticas deste protocolo é a identificação e marcação das mesmas fibras nos dois slides. Como explicado anteriormente, é importante escanear o slide com tipos de fibras e ter a reconstrução de seções musculares transversais com as cores mescladas antes da aquisição de imagens para LDs (Figura 3B). Estruturas notáveis de cada seção muscular, como galhos de axônio ou fusos musculares, são bons marcos que podem ajudar o pesquisador a localizar as mesmas fibras em ambos os slides (Figura 6). Lembre-se que, como o slide é colocado de cabeça para baixo na maioria dos microscópios confocal, recomenda-se inverter a imagem reconstruída do tipo fibra no computador pessoal para facilitar a tarefa de localização.

As configurações descritas para a aquisição da coloração bodipy-laminin por microscopia confocal permitem a visualização e análise posterior do tamanho, número e distribuição de LDs de três a seis fibras simultaneamente (Figura 6 e Figura 7). Um protocolo passo a passo detalhado para analisar LDs com o software de análise de imagens Fiji também é fornecido aqui. Como mostrado no protocolo, a análise completa de cada uma das fibras presentes em uma imagem é longa e tediosa. No entanto, Fiji tem a vantagem de permitir o design de programas personalizados, chamados macros, baseados na linguagem Java. Os autores criaram uma macro que permite a automação da série de comandos individuais descritos acima que é automaticamente executada em um loop para analisar em poucos minutos - não apenas cada uma das fibras presentes em uma imagem, mas também um grande conjunto de imagens. A única entrada do pesquisador é a seleção manual do perímetro da fibra a ser analisada cada vez, a seleção do tipo de fibra e a inspeção visual da imagem resultante após a aplicação do limiar e quantificação das partículas.

Aqui, a análise dos LDs de forma dependente de localização é implementada. Ao medir anteriormente a área e o diâmetro de MF da fibra, aplica-se uma redução de tamanho dependente (não fixado como descrito por Strauss et ^al.25) para obter as áreas centrais e periféricas de cada fibra (Figura 4 e Figura 7). Como visto nos histogramas da Figura 7, este método permite a quantificação de três parâmetros importantes: a porcentagem da área de fibra ocupada por LDs (Figura 7E), a densidade de LDs - o número de LDs por μm² (Figura 7F), e o tamanho médio dos LDs (Figura 7G). Como resultado, em camundongos de 3 meses de idade (N = 5), as fibras tipo IIa (contorno verde) e tipo IIx (contorno vermelho) apresentam a maior proporção de área ocupada por LDs na periferia (Figura 7E). Com relação à densidade das partículas, as fibras EDL sempre apresentam maior densidade do que as fibras soleus independentemente da localização subcelular (Figura 7F). Finalmente, o tamanho médio desses LDs é sempre maior na periferia do que no centro (Figura 7G).

Os diferentes métodos utilizados por outros grupos para avaliar o acúmulo de LDs no músculo esquelético^de roedores ^34,35 dificultam a comparação desses resultados com os de estudos anteriores. No entanto, em consonância com os resultados de Komiya et ^al.34, a porcentagem de área de fibra ocupada por LDs é maior nas fibras tipo Soleus IIa e EDL IIx. Mais importante, as fibras tipo IIb apresentaram o menor percentual de área ocupada por LDs (Figura 7E, histogramas cinzentos). Uma vez que o tipo de fibra IIb é o tipo de fibra mais predominante do EDL (75%, Figura 5E), esses resultados confirmam o que outros grupos descreveram anteriormente: o acúmulo global de lipídios é menor em EDL do que no soleus^34,35.

Ao contrário do que foi descrito em humanos²⁵, e também em linha com os resultados de Komiya et ^al.34, os resultados aqui apresentados mostram que o acúmulo de LDs nas fibras soleus tipo I é relativamente baixo. Isso pode ser explicado pelas diferenças entre camundongos e humanos do tipo fibras entre camundongos e humanos³⁶, uma vez que as propriedades metabólicas das fibras humanas tipo I são mais semelhantes às do tipo roedor IIa e IIx, enquanto as de fibras IIx do tipo humano estão próximas ao tipo roedor IIb³⁷. Em resumo, as diferentes técnicas aqui descritas fornecem um método reprodutível, confiável e eficiente em tempo para estudar e comparar vários parâmetros relacionados aos LDs e sua distribuição dentro da célula de forma dependente do tipo de fibra.

Experimentos subótimos
Se o procedimento de congelamento não for realizado corretamente e isopentane não estiver na temperatura certa, cristais de gelo se formarão dentro das fibras (Figura 8A). Estes artefatos de congelamento só são detectáveis após a preparação histológica da amostra e podem ser reconhecidos como buracos nas fibras. Para a quantificação adequada dos LDs, estes artefatos devem ser evitados. Foi demonstrado que descongelar e recongelar o bloco muscular adequadamente pode reduzir significativamente esses artefatos²⁹.

Outro problema é encontrado quando as fibras não são cortadas perpendiculares ao eixo longitudinal (Figura 8B). A quantificação e comparação de LD entre fibras, músculos ou animais não podem ser feitas quando as seções não são transversais. Por essa razão, é essencial colocar os músculos corretamente na rolha com o auxílio de um microscópio estéreo antes de congelar e ter um microscópio de campo brilhante perto do criostat. Este último permitirá que o pesquisador encontre o alinhamento correto da amostra no criostat.

Em algumas raras ocasiões, a rotulagem de isoforms MyHC é muito fraca em um ou mais tipos de fibras (Figura 8C). Se isso acontecer, a análise dos LDs será incompleta. Neste caso, o experimento tem que ser repetido a partir do corte dos músculos. Finalmente, Bodipy poderia se acumular na periferia da seção transversal muscular (Figura 8D). Se isso acontecer, a coloração será muito forte nessas fibras produzindo um resultado artefatoual. Evite a aquisição de imagens dessas fibras.

Figura 2: Preparação das amostras para congelamento e criosectioning. (A-D) Os músculos do rato e do EDL são dissecados e colocados em uma rolha mantida por um plástico rígido com uma gota de OCT. (E-G) Um copo de aço inoxidável é preenchido com isoporne e resfriado à sua temperatura de fusão em nitrogênio líquido. (H,I) O tumbler com isoquine fria é retirado do nitrogênio líquido, e a amostra é imersa até o fundo do tumbler, girando por 15 s. (J-L) A rolha com as amostras é colocada no disco portador do criostat sem o suporte plástico, e seções transversais seriais de 10 μm são montadas diretamente em slides de adesão. Duas seções transversais seriais adjacentes são imediatamente processadas para a coloração de LDs e a detecção de MyHCs. Abreviaturas: LDs = gotículas lipídicas; EDL = extensor digitorum longus; MyHCs = isoforms de cadeia pesada de miosina; OCT = temperatura de corte ideal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Aquisição de imagem bodipy após identificar o tipo de fibra da imagem composta reconstruída vista em outro computador. (A) Reconstrução de toda a seção soleus imunolabeled para tipo de fibra (MyHCs) a partir de sete imagens independentes mescladas (retângulos tracejados) costuradas usando software de processamento de imagem. As setas brancas e os números representam a ordem seguida durante a aclamação de imagem usando um microscópio de epifluorescência convencional. (B) Para aquisição de imagem Bodipy, (1) um campo contendo a seção muscular imunostida com laminin-AF647 e Bodipy-555/568 é visualizado na tela de um computador conectado ao microscópio confocal. (2) Essas fibras estão localizadas na imagem reconstruída da seção muscular imunostida para detectar o tipo de fibras (MyHCs). (3) A imagem é adquirida usando um microscópio confocal. Abreviaturas: LDs = gotículas lipídicas; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenildole; MyHCs = isoforms de cadeia pesada de miosina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Análise de gotículas lipídicas com Fiji. (A,B) O sarcolemma da fibra é reconhecido com base na imagem laminina e selecionado como ROI. Área total e MF são medidos. (C) Para reconhecer a parte central da fibra, a seleção é reduzida em 1/6 do valor do MF. (D) A área entre a seleção central e a total é definida como a periferia ou a área subsarcolemmal. (E) Para a análise de LDs manchados com Bodipy, é aplicado um limiar, (F) e a ferramenta Analisar partículas é usada para quantificar diferentes parâmetros relacionados aos LDs (ver tabela). Esses valores são obtidos para a fibra completa (All), para a parte central (Centro) e para a área subsarcolemmal (Periferia), de forma independente. Barras de escala = 12 μm. Abreviaturas: LDs = gotículas lipídicas; ROI = região de interesse; MF = Diâmetro mínimo de Feret. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Imunostaining representativo de tipos de fibras no músculo do camundongo EDL (glicolítico) e soleus (oxidativo). Imagens de fluorescência mesclada de EDL (A,B) e soleus (C,D) obtidas com um microscópio digital de fluorescência de slides. Anticorpos contra o tipo I (azul-AF405), tipo IIa (verde-AF488), tipo IIx (vermelho-AF568) e laminina (branco-AF647) foram utilizados. Fibras pretas correspondem ao tipo de fibra IIb. B e D mostram detalhes das fibras dentro dos retângulos brancos dos painéis A e C, respectivamente. O asterisco (*) no painel D mostra uma fibra híbrida IIa/IIx. (E,F) Quantificação representativa da distribuição do tipo de fibra em EDL e sola de camundongos de 3 meses de idade (N = 5). O EDL era composto principalmente por fibras tipo IIb, depois IIx e IIa (~75%, 15% e 5%, respectivamente). Em contrapartida, o soleus era composto principalmente pelas fibras tipo I (>50%) e tipo I (30%). As proporções de fibras tipo IIx foram bastante semelhantes em ambos os músculos, enquanto as de fibras híbridas foram muito baixas. Barras de escala = 200 μm (A,C), 100 μm (B,D). Abreviação: EDL = extensor digitorum longus. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Coloração representativa de LDs com Bodipy em seções transversais seriais anteriormente imunolabeled para isoforms MyHC. Imagens mescladas de fluorescência de fibras de mouse EDL (A) e soleus (B) adquiridas usando um microscópio de epifluorescência mostrando o tipo I (azul), IIa (verde), IIx (vermelho), IIb (preto) e laminina (sinal branco ao redor das fibras). (C-F) Imagens de fluorescência confocal do EDL (C,D) e do soleus (E,F) co-rotulados com laminina (ciano) e Bodipy (vermelho). Observe que as fibras mostradas em C-F são as mesmas que as internas dos retângulos brancos nos painéis A e B. No canto direito do retângulo branco em A, um galho de axônio pode ser distinguido (ponta de flecha branca). Barras de escala = 200 μm (A,B), 20 μm (C-F). Abreviaturas: LDs = gotículas lipídicas; EDL = extensor digitorum longus; MyHCs = isoforms de cadeia pesada de miosina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Quantificação de LDs de forma tipo de fibra e subcelular. Imagens confocal de fluorescência representativas das fibras tipo I e tipo IIa de soleus (A,B) e tipo IIx e fibras tipo IIb de EDL (C,D) obtidas após a co-rotulagem com Bodipy (vermelho) e α2-laminina (não mostrada). O teor de LD (% da área ocupada por Bodipy e densidade) e morfologia (tamanho) foram analisados de forma subcelular.especificamente. O perímetro de fibra foi definido pela coloração de laminina e as áreas centrais ou periféricas foram definidas com base no diâmetro mf. Percentual de área de fibra ocupada por Bodipy (LDs) (E), densidade LD (número/μm²) (F) ou tamanho LD médio (G) em regiões centrais ou periféricas para cada tipo de fibra. Os resultados são representados como ± médias SEM. Barras de escala = 10 μm. Abreviaturas: LDs = gotículas lipídicas; EDL = extensor digitorum longus; C = central; P = periférico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: Imagens correspondentes a resultados subótimos. (A) Imagem brightfield de seção transversal muscular manchada para hematoxilina-eosina mostrando cristais de gelo formados durante o processo de congelamento. (B) A fluorescência mesclou a imagem de uma seção de soleus imunossus para MyHCs e laminina, mostrando que a maioria das fibras são cortadas ao longo do eixo longitudinal. (C) Imagem de fluorescência de uma seção EDL imunostida para MyHCs e laminina. A mancha fraca do tipo de fibra IIa (verde) dificulta a quantificação correta de cada tipo de fibra. (D) Imagem confocal mostrando uma forte coloração artefato de Bodipy (vermelho) em fibras localizadas na periferia da seção transversal muscular. Barras de escala = 50 μm (A,B), 200 μm (C,D). Abreviaturas: EDL = extensor digitorum longus; MyHCs = isoforms de cadeia pesada de miosina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura Suplementar S1: Mancha de LD com O Vermelho-Óleo em seções transversais musculares. (A,B) Imagens confocal mostrando o padrão de coloração obtida com O Vermelho Óleo no soleus e EDL, respectivamente. O protocolo utilizado para esta coloração é descrito em detalhes por Prats et ^al.24. Observe que o acúmulo de LDs é maior na região subsarcolemmal dos miofibers, como descrito anteriormente para Bodipy. Barras de escala = 20 μm. Abreviaturas: LD = gotícula lipídica; EDL = extensor digitorum longus. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura Suplementar S2: Co-coloração de LDs e mitocôndrias no músculo soleus. (A) Imagem mesclada confocal mostrando o imunolabelamento de Tomm20, uma proteína presente na membrana mitocondrial (verde), DAPI (azul) e Bodipy-558/568 rotulados LDs (vermelho). O inset em A mostra várias mitocôndrias (verdes) ligadas a LDs (vermelho). Esta imagem foi obtida aplicando microscopia de supersselução confocal airyscan. (B,C) Imagens de canal único correspondentes de LDs e mitocôndrias, respectivamente. Barras de escala = 10 μm (A-C), 5 μm (A, inset). Abreviaturas: LDs = gotículas lipídicas; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenildole. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Arquivo suplementar 1: Fiji macro para a análise automatizada de LDs em múltiplas imagens laminin+Bodipy. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Arquivo suplementar 2: Explicação passo a passo de como trabalhar com o macro Bodipy_JoVE.ijm. Clique aqui para baixar este Arquivo.

O protocolo aqui detalhado descreve um método eficiente para quantificar LDs marcados com Bodipy em uma base tipo de fibra e subcelular específico. Nos últimos anos, corantes lipídicos clássicos, como ORO ou Sudan Black B, foram substituídos por uma nova matriz de corantes celulares permeáveis, lipofílicos, fluorescentes que se ligam a lipídios neutros (por exemplo, Bodipy). Disponível como diferentes conjugados, Bodipy tem se mostrado muito eficaz na marcação de LDs para estudar sua morfologia, dinâmica e interação com outras organelas, não apenas em diferentes tecidos fixos e células 23,38,39,40, mas também em células vivas^41,42.

Dentro do protocolo, existem vários aspectos críticos que o pesquisador deve considerar para obter resultados ideais. É essencial colocar os músculos escolhidos corretamente na rolha para garantir o alinhamento e orientação perfeitos dos miofibers musculares, uma vez que uma vez congelados, apenas pequenos reajustes do suporte podem ser feitos no criostat. Além disso, é fundamental iniciar o protocolo de imunossuagem imediatamente após o corte das seções, uma vez que as crioseções de secagem de ar (por apenas 15 minutos) têm efeitos adversos graves sobre as LDs, resultando em uma redução de 66% na densidade de LD e uma redução de 37% no tamanho médio²⁴. Da mesma forma, congelar e descongelar os slides teria efeitos adversos e, portanto, não são recomendados. Uma terceira característica importante deste protocolo está relacionada com a fixação de amostras. Para a identificação dos diferentes isoformos myhc com os anticorpos aqui citados, a fixação tecidual deve ser evitada, pois interrompe a ligação dos anticorpos escolhidos aos seus epítopos. Se as amostras musculares tiverem sido previamente fixadas, o leitor é encaminhado a um artigo publicado recentemente usando anticorpos diferentes⁴³. Apenas PFA sem metanol é recomendado para a rotulagem e quantificação de LDs, pois o uso de metanol ou acetona interrompe a morfologia dos LDs^23,44. Além disso, um passo de permeabilização não é necessário para a quantificação de LDs em lâminas imunolabeled com laminina. Uma vez que alguns grupos têm mostrado que a permeabilização com detergentes como TritonX-100, saponina ou glicina pode reduzir o tamanho ou número de LDs^44,45, a permeabilização é altamente desencorajada. Finalmente, o ajuste fino das configurações do microscópio confocal é crucial para reconhecer apenas os lipídios neutros presentes em LDs e não aqueles em membranas de outras organelas²⁴.

Aqui, Bodipy-558/568 C₁₂ foi usado como marcador LD. No entanto, o Bodipy mais usado para marcar LDs e estudar sua morfologia e localização dentro dos myofibers músculo esquelético é Bodipy-493/503. Ambos os corantes são semelhantes em seu tempo de incubação, concentração de trabalho e seus espectros de emissões estreitas, embora suas faixas de excitação e emissão sejam ligeiramente diferentes. Para um protocolo completo sobre o uso de Bodipy-493/503, o leitor é encaminhado para o trabalho de Listenberger e Brown⁴⁶ ou Spangenburg et ^al.23. Bodipy-558/568 C₁₂ tem sido usado para coloração de LDs em outros tecidos como tecido adiposo⁴⁷, retina degenerada⁴⁸, rins fibrosos⁴⁹ ou fibroblastos⁵⁰. Este Bodipy produz uma coloração semelhante à obtida com ORO (ver Figura Suplementar S1), mas com carga consideravelmente menos técnica e mais especificidade^24,51. Além disso, Bodipy-558/568 C₁₂ tem a vantagem de permitir a quantificação de LDs em combinação com a detecção de proteínas ou organelas marcadas com um anticorpo secundário de espectro verde (ver Figura Suplementar S2 e Yan et al.49) ou com modelos geneticamente modificados^{gFP 52}. Essas duas aplicações são ferramentas muito poderosas para desvendar a dinâmica e interações dos LDs com outras organelas celulares e proteínas. No entanto, quando não se destina o acúmulo de proteínas dentro das células, os autores recomendam o uso do corante LD mais bem caracterizado Bodipy-493/503.

Uma das limitações deste protocolo está relacionada à aquisição de imagens e à quantificação de características morfológicas de LD. Os avanços tecnológicos na microscopia de varredura a laser confocal melhoraram muito a resolução do avião em comparação com microscópios de campo largo e permitem a reconstrução 3D de objetos ao digitalizar a amostra no plano Z. Isso tem sido muito útil para o estudo da morfologia^{LD 24} e interação com outras proteínas em myofibers esqueléticos^38,53, mas aumentou o tempo de aquisição e processamento de imagens de imagem, uma vez que cada imagem reconstruída em 3D é composta por várias imagens 2D independentes. No protocolo acima, foram adquiridas imagens confocal com lente objetiva de 40x e apenas em 2D. Este método permite a aquisição de três a seis myofibers por imagem, em vez de apenas um como seria ao usar um objetivo de 63x. Isso resulta em menor resolução e uma estimativa geral do tamanho de LD e morfologia que não é completamente precisa. No entanto, permite a análise de um maior número de fibras por amostra, o que também é um fato importante a se considerar, especialmente em experimentos em animais, nos quais um alto número de músculos e condições devem ser comparados.

Aqui, é demonstrado que, congelando dois músculos de tamanho semelhante que estão adjacentes um ao outro³⁴, o tempo de processamento das amostras é consideravelmente diminuído, e possíveis diferenças artefatosas derivadas de seu processamento independente são reduzidas. Além disso, esse método de análise de LDs leva em consideração as diferenças entre a distribuição subcelular de LDs dentro e entre os tipos de fibras⁵⁴. Selecionar o perímetro do miofibra e reduzir essa seleção em relação ao diâmetro mínimo do Feret da fibra facilita o estudo do tamanho e densidade de LDs centrais e periféricos (subsarcolemmal) de forma independente. A aplicação deste método é extremamente importante, pois foi demonstrado que o acúmulo subsarcolemmal de LDs contribui diretamente para a resistência à insulina. Embora alguns relatos em humanos tenham estudado LDs de forma dependente de fibras e dependentes de localização ^11,16,25, esta é a primeira vez, pelo que sabemos, que este método tem sido aplicado aos músculos dos roedores. Além disso, a quantificação dos LDs com o auxílio de uma macro auto-projetada para Fiji reduziu significativamente e simplificou o tempo de análise da imagem. Tanto a macro quanto uma explicação passo a passo sobre como usá-la estão disponíveis como Arquivo Suplementar 1 e Arquivo Suplementar 2, respectivamente.

No geral, os autores consideram que o protocolo aqui descrito pode ser uma ferramenta útil para outros pesquisadores que estudam o metabolismo lipídico no músculo esquelético. As técnicas explicadas podem ser aplicadas a diferentes músculos e em condições distintas (jejum/superalidos, treinados/sedentários, jovens/idosos, magros/obesos) e, esperançosamente, ajudarão a compreender melhor a dinâmica das LDs, a importância de suas interações com outros componentes da célula, como os lipídios são armazenados e metabolizados em fibras glicólicas e oxidativas, e seu papel no aparecimento da resistência à insulina no tipo 2.

Os autores não têm conflitos de interesse para declarar.

Este trabalho foi apoiado por subvenções da Fonds National de la Recherche Scientifique (FNRS-Crédit de Recherche J.0022.20) e da Société Francophone du Diabète (SFD-Roche Diabetes Care).C.M.S. é o beneficiário de uma bolsa de doutorado da FRIA (FNRS). M.A.D.-L.d.C. recebeu uma bolsa do Programa internacional de Excelência Wallonie-Bruxelles.

Os autores agradecem a Alice Monnier por sua contribuição para o desenvolvimento deste protocolo e Caroline Bouzin por sua expertise e ajuda técnica no processo de aquisição de imagens. Agradecemos também à plataforma de imagem 2IP-IREC pelo acesso ao criostat e aos microscópios (2IP-IREC Imaging Platform, Institute of Experimental and Clinical Research, Université Catholique de Louvain, 1200 Bruxelas, Bélgica). Por fim, os autores gostariam de agradecer Nicolas Dubuisson, Romain Versele e Michel Abou-Samra pela crítica construtiva ao manuscrito. Algumas das figuras deste artigo foram criadas com BioRender.com.