סוג הסיבים וניתוח ספציפי תת-תאי של תכולת טיפות השומנים בשרירי השלד

עדויות הולכות וגוברות מצביעות על כך שחדירה מוגזמת של שומנים בתוך שרירי השלד גורמת לליפטוקסיות ולסוכרת. כאן אנו מציגים פרוטוקול שלם, כולל עיבוד רקמות, צביעה עם Bodipy, רכישת תמונה וניתוח, כדי לכמת את הגודל, הצפיפות וההתפלגות התת-תאית של טיפות שומנים באופן ספציפי מסוג סיבים.

חדירת שומנים בשריר השלד, המכונה מיואסטאטוזיס, עולה עם השמנת יתר והזדקנות. מיאוסטאטוזיס התגלתה לאחרונה גם כגורם פרוגנוסטי שלילי למספר הפרעות אחרות כגון מחלות לב וכלי דם וסרטן. חדירת שומנים מוגזמת מפחיתה את מסת השריר ואת כוחו. היא גם גורמת לליפטוקסיות ולתנגודת לאינסולין בהתאם לתכולת השומנים התוך-תאיים הכוללת, למורפולוגיה של טיפות השומנים (LD) ולפיזור התת-תאי. סוג הסיבים (חמצון לעומת גליקוליטי) חשוב גם הוא, שכן לסיבים חמצוניים יש יכולת גדולה יותר להשתמש בשומנים. בגלל ההשלכות הקריטיות שלהם בפתופיזיולוגיה, יש צורך במחקרים מעמיקים על דינמיקה ותפקוד של LD באופן ספציפי לסוג הסיבים.

להלן מוצג פרוטוקול מלא לכימות תכולת השומנים התוך-תאיים ולניתוח מורפולוגיה של LD והתפלגות תת-תאית באופן ספציפי לסוג הסיבים. לשם כך, קריוזקציות שרירים סדרתיות הוכתמו בצבע הפלואורסצנטי Bodipy ובנוגדנים נגד איזופורמים של שרשרת כבדה של מיוזין. פרוטוקול זה מאפשר עיבוד סימולטני של שרירים שונים, חוסך זמן ונמנע מממצאים אפשריים, ובזכות מאקרו מותאם אישית שנוצר בפיג'י, האוטומטיזציה של ניתוח LD אפשרית גם כן.

חדירת שומנים בשריר השלד, המכונה מיואסטאטוזיס, עולה עם השמנת יתר והזדקנות. מיואסטאטוזיס מתואמת באופן שלילי עם מסת שריר וכוח ועם רגישות לאינסולין¹. יתר על כן, מחקרים אחרונים מצביעים על כך שמידת המיוסטאטוזיס יכולה לשמש כגורם פרוגנוסטי למצבים אחרים כגון מחלות לב וכלי דם², מחלת כבד שומני שאינה אלכוהולית³, או סרטן⁴. שומנים יכולים להצטבר בשרירי השלד בין סיבי השריר כשומנים חוץ-תאיים או בתוך הסיבים, כמו שומנים תוך-תאיים (IMCLs). IMCLs מאוחסנים בעיקר כטריגליצרידים בטיפות שומנים (LDs) המשמשים כדלק מטבולי במהלך פעילות גופנית ^5,6. עם זאת, כאשר היצע השומנים עולה על הביקוש, או כאשר המיטוכונדריה הופכת לבלתי מתפקדת, IMCLs יהיו מעורבים בתנגודת לאינסולין בשרירים, כפי שניתן לראות אצל אנשים לא בריאים מבחינה מטבולית, שמנים ובחולי סוכרת מסוג 2⁷. באופן מסקרן, לספורטאי סיבולת יש רמות דומות, אם לא גבוהות יותר, של IMCLs לאלה שנמצאו בחולים שמנים עם סוכרת מסוג 2, תוך שמירה על רגישות גבוהה לאינסולין. תופעה זו מתוארת כ"פרדוקס הספורטאי"^8,9, והיא מוסברת על ידי הערכה ניואנסית יותר של LDs שרירים, הקשורים לגודלם, צפיפותם, לוקליזציה, דינמיקה והרכב מיני שומנים.

ראשית, גודל LD נמצא בקורלציה הפוכה לרגישות לאינסולין ולכושר גופני^10,11. למעשה, LDs קטנים יותר מציגים שטח פנים גדול יחסית לפעולת ליפאז, ולכן, יש להם יכולת גדולה יותר לגייס שומנים¹². שנית, צפיפות LD (מספר/משטח) ממלאת תפקיד שנוי במחלוקת בפעולת^{האינסולין 8,10}; עם זאת, נראה כי הוא גדל בספורטאים. שלישית, הלוקליזציה התת-תאית של LDs חשובה, שכן LDs הממוקמים ממש מתחת לממברנה של פני השטח (תת-סרקולמל או היקפי) מפעילים השפעה מזיקה יותר על הרגישות לאינסולין מאשר אלה המרכזיים ^8,9,13. אלה האחרונים מספקים דלק למיטוכונדריה מרכזית, שיש לה פעילות נשימתית גדולה יותר ומתמחה יותר כדי לענות על הביקוש האנרגטי הגבוה הנדרש להתכווצות¹⁴. לעומת זאת, LDs היקפיים מספקים מיטוכונדריה תת-סרקולמלית, המעורבים בתהליכים הקשורים לממברנה⁸. לבסוף, מעבר לטריגליצרידים, שומנים מורכבים ספציפיים בתוך השריר עשויים להיות מזיקים יותר מאחרים. לדוגמה, דיאצילגליצרול, אציל-CoA ארוך שרשרת וסרמידים עשויים להצטבר בשריר כאשר שיעור תחלופת הטריגליצרידים נמוך, ובכך לפגוע באינסולין המאותת^{על 9,15}. אם נחזור ל"פרדוקס של הספורטאי", לספורטאי סיבולת יש מספר גבוה של LDs מרכזיים קטנים יותר עם שיעורי תחלופה גבוהים בסיבים מסוג I (חמצוניים), בעוד שלחולי השמנת יתר וסוכרת יש LD היקפיים גדולים יותר עם שיעורי תחלופה נמוכים יותר בסיבים מסוג II (גליקוליטי) ^8,15,16. בנוסף לתפקידם באגירת ושחרור אנרגיה, LDs באמצעות חומצות שומן נגזרות (FA) וחלבון פרווה (פריליפין 5) יכולים גם לתפקד כשחקנים קריטיים המעורבים בוויסות השעתוק של חמצון FA וביוגנזה מיטוכונדריאלית⁸. בגלל ההשלכות המכריעות שלהם בפיזיולוגיה ובפתופיזיולוגיה, יש הצדקה למחקרים מעמיקים על דינמיקה ותפקודים של LDs.

למרות שישנן מספר טכניקות לחקר IMCLs, לא כולן מתאימות לכימות מדויק של גודל LD, צפיפותו והתפלגותו באופן ספציפי לסיבים. לדוגמה, ההערכה של IMCLs על ידי ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית, למרות היותה לא פולשנית, מציעה רמת רזולוציה שאינה מספיקה כדי לחקור את הגודל והמיקום המדויק של LDs בתוך הסיבים, והיא אינה ספציפית מסוג סיבים^17,18. כמו כן, טכניקות ביוכימיות המבוצעות על הומוגנטים של שרירים שלמים¹⁹ אינן יכולות להעריך את מיקומם וגודלם של שומנים. כתוצאה מכך, השיטה המתאימה ביותר לניתוח המורפולוגיה והמיקום של LD היא מיקרוסקופיה אלקטרונית של שידור כמותי¹³, אך טכניקה זו יקרה וגוזלת זמן רב. לכן, הדמיה פלואורסצנטית קונפוקלית על תכשירים עם צבעים כגון שמן אדום O (ORO)^20,21, monodansylpentane (MDH)²², או Bodipy 23,24,25, התגלתה ככלי הטוב ביותר למחקרים אלה.

כאן מתואר פרוטוקול שלם, הכולל דגימה ועיבוד של רקמות, צביעת Bodipy, ורכישה וניתוח של תמונה קונפוקלית כדי לכמת את הגודל, המספר והלוקליזציה של LD בקריואזות שרירי העכבר. מאחר ש-IMCLs אינם מחולקים באופן שווה בין סיבים חמצוניים וגליקוליטיים, וכל סוג סיבים מווסת את הדינמיקה של LD באופן שונה, המחקר של IMCLs חייב להיות ספציפי מסוג סיבים 16,25,26,27. לכן, פרוטוקול זה משתמש באימונופלואורסצנציה בחתכים סדרתיים כדי לזהות איזופורמים של שרשרת כבדת מיוזין (MyHC) המבוטאים על ידי כל סיב. יתרון נוסף של פרוטוקול זה הוא עיבוד סימולטני של שריר גליקוליטי (extensor digitorum longus, EDL) ושריר חמצוני (סולוס) המונחים זה לצד זה לפני הקפאה (איור 1). עיבוד סימולטני זה לא רק חוסך זמן אלא גם מונע השתנות עקב עיבוד נפרד של הדגימות.

איור 1: סקירה סכמטית של ההליך. לאחר כריתת שרירים (1), השרירים שנבחרו בגודל דומה מוכנים ומקפואים יחד (2). מקטעים רוחביים טוריים של 10 מיקרומטר מתקבלים באמצעות קריוסטאט ומורכבים ישירות על שקופיות הידבקות (3). משתי שקופיות סדרתיות, הראשונה (4A) מסומנת באופן חיסוני ללאמינין ומוכתמת ב-Bodipy כדי לזהות LDs והשנייה (4B) מוכתמת בנוגדנים נגד MyHCs לזיהוי סוגי סיבי שריר. התמונות נרכשות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי עבור Bodipy (5A) ומיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי לסוגי סיבי שריר (5B). התמונות מנותחות בפיג'י על ידי החלת סף וכימות חלקיקים (6A) כדי לקבל את המספר, הגודל הממוצע, הצפיפות והאחוז של השטח הכולל שנכבש על ידי LDs (7) או ספירת תאים (6B) כדי לקבל את אחוז הסיבים מכל סוג בסעיף (7). קיצורים: LDs = טיפות שומנים; EDL = extensor digitorum longus; MyHCs = איזופורמים של שרשרת כבדה של מיוזין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

כל ההליכים שנערכו על עכברים אושרו על ידי הוועדה האתית לניסויים בבעלי חיים מהמגזר הרפואי באוניברסיטת קתוליק דה לוביין (2019/UCL/MD/013).

1. כריתה והכנת הדגימות להקפאה

1. סמן פיסת פקק בעובי 3 מ"מ עבור כל זוג שרירים.
2. באמצעות חתך קטן שנעשה עם להב במרכז הפקק, הוסיפו בניצב חתיכת פלסטיק מלבנית קשיחה (0.5 ס"מ רוחב, 1 ס"מ גובה) שתשמש כתמיכה (איור 2B).
   הערה: גודל חתיכת הפלסטיק המלבנית יהיה תלוי בגודל השריר. כאן, הממדים המתוארים מותאמים לגודלם של הסולאוס (~9 מ"ג, 1 ס"מ ל', 2-3 מ"מ רוחב) ו-EDL (כ-5 מ"ג, 1 ס"מ ל', 2-3 מ"מ W) של עכבר זכר C57BL/6J בן 3 חודשים.
3. בזמן הנתיחה, הסר את הסולאוס וה- EDL של האיבר האחורי של העכבר. כדי למנוע מהדגימות להתייבש במהלך הנתיחה, הניחו אותן על קומפרס לח קלות עם תמיסת מלח בצלחת פטרי המונחת על קרח.
   הערה: ראה Wang et ^al.28 להסברים כיצד לנתח את שני שרירי הגפיים הללו.
4. הניחו טיפה קטנה של תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) בצומת השעם/פלסטיק, תוך הימנעות מבועות אוויר.
5. יש למנוע לחות עודפת מהדגימות על-ידי ייבושן העדין במגבת נייר (איור 2A) ולהניח את שני השרירים על הפלסטיק בניצב לפקק (איור 2C).
6. בדוק את הכיוון של שריר myofibers תחת מיקרוסקופ סטריאו (איור 2D).
   הערה: חשוב לא לכסות את השריר עם OCT, שכן השפעת הבידוד שלו תמנע הקפאה מהירה ותיצור ממצאי הקפאה.

2. הקפאת דגימות שרירי השלד לצורך קריוזקציה

אזהרה: הקפאת השריר חייבת להיעשות תחת מכסה מנוע כימי, תוך לבישת ציוד מגן אישי מתאים (ראו טבלת החומרים).

1. השתמשו בטומבלר מפלדת אל-חלד (כ-8 ס"מ גובה, 6 ס"מ Ø) עם שתי רצועות צד המחוברות אליו באורך של לפחות 25 ס"מ (איור 2F), ומלאו את הטמבלר עד 2/3 מקיבולתו באיזופנטן.
2. תוך כדי אחיזת הטמבלר ברצועות, טבלו אותו בעדינות בקופסת פוליסטירן מלאה בחנקן נוזלי, כך שרמת החנקן שמחוץ למיכל תהיה מעל רמת האיזופנטן שבתוכה (איור 2F,G).
   אזהרה: כאשר הטמבלר בא במגע עם החנקן, ההלם התרמי עלול לגרום למערבולת. ודא כי הטמבלר שקוע מספיק, אך הימנע מכניסת חנקן מכיוון שהדבר יגרום למשקעים איזופנטניים. אם זה קורה, תנו לאיזופנטן להתקרר, מלאו את הטמבלר באיזופנטן חדש והתחילו מחדש.
3. כאשר החלק הפנימי של הטמבלר מכוסה לחלוטין בשכבה מוצקה לבנה של איזופנטן, הוציאו אותו מקופסת החנקן הנוזלי (איור 2H).
   הערה: טמפרטורת ההיתוך של איזופנטן היא -159 מעלות צלזיוס, הקצוות של הטמבלר יהפכו ללבנים כאשר הוא קר מספיק.
4. מערבבים בעדינות את חתיכות האיזופנטן המוצקות לתוך האיזופנטן הנוזלי שנותר עם מלקחיים עד שכל הנפח הופך שוב לנוזלי.
5. לטבול מחדש את הטמבלר בחנקן הנוזלי עד איזופנטן יוצר חלוקי נחל לבנים בכל רחבי החלק התחתון והקצוות של הטמבלר (איור 2G,H).
   הערה: שלב קירור שני זה מבטיח את טמפרטורת ההקפאה המתאימה של האיזופנטן.
6. מוציאים את הטמבלר מהחנקן הנוזלי ומטבלים במהירות את השרירים בתחתית הטמבלר, אוחזים את הפקק בפינצטה של שן חולדה. סובבו את הפקק במשך 15 שניות באיזופנטן ואחסנו אותו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לעיבוד (איור 2I).
   הערה: לאחסון לטווח קצר, ניתן לשמור את הדגימות במקפיא של -20 מעלות צלזיוס. הפרוטוקול המלא להקפאה מהירה של שרירי השלד כבר פורסם במקום אחר. להפניות מפורטות ולפתרון בעיות, ראו: Meng et ^al.29, Kumar et ^al.30, ו- Leiva-Cepas et ^al.31.

3. קריוזקציה

1. הביאו את הדגימות לחדר של קריוסטאט שהתקרר בעבר ל-20 מעלות צלזיוס- וטמפרטורת הלהב נקבעה ל-25 מעלות צלזיוס.
   הערה: להעביר דגימות מהמקפיא של -20 °C / -80 °C לקריוסטט בקופסת פוליסטירן מלאה בקרח יבש ולאפשר לדגימות להתאזן לפחות 20-30 דקות לטמפרטורת החדר לפני החיתוך.
2. מוציאים את הפלסטיק מהפקק עם פינצטה עדינה ומניחים את דיסק הדגימה הקריוסטטית על צלחת ההקפאה המהירה כדי להתקרר. לאחר שהצלחת הגיעה ל -50 מעלות צלזיוס, הניחו מעט OCT על הדיסק והניחו במהירות את הפקק על גבי הדיסק, תוך לחיצה חזקה. המתן עד שה- OCT יתמצק והפקק יתוקן היטב על הדיסק.
3. מניחים את הדיסק על ראש העצם בכיוון החיתוך הרצוי (איור 2J,K) וחותכים את גוש השרירים מעבר לפחות ל-1/3 מאורך השרירים ועד ששני החתכים של השרירים נראים לעין.
4. הגדר את עובי החיתוך ל-10 מיקרומטר והנח קטע אחד על שקופית הידבקות כדי לבדוק את הכיוון הנכון של הסיבים במיקרוסקופ שדה בהיר.
   הערה: בדיקת הכיוון הרוחבי של הסיבים היא קריטית. אם הסיבים אינם מכוונים כראוי, התאם את זווית ראש האובייקט, חתך קטע אחר ובדוק שוב.
5. הניחו שני חתכים סדרתיים על שתי שקופיות הדבקה עם תווית מוקדמת: שקופית אחת לקביעת סוגי סיבים, והשנייה לכימות תכולת השומנים (איור 2L).
   הערה: ניתן לקבל חתכים טוריים נוספים ולשמור אותם בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למחקרים היסטולוגיים אחרים. עם זאת, כדי להימנע משינוי תכולת השומנים והמורפולוגיה התוך תאית²⁴, חיוני לעבד את שתי השקופיות הראשונות מיד לאחר החיתוך כדי למנוע ייבוש אוויר. להקפאה ולהפשרה של השקופיות לצורך כימות LD תהיה השפעה זהה ולכן היא מאוד לא רצויה.

4. הקלדת סיבים וצביעת בודיפי

1. זיהוי אימונוהיסטוכימי של סוג סיבי השריר
   הערה: עבור הפרוטוקול הבא, נפח תמיסה כולל של 250 μL מספיק כדי לכסות את כל חלק השרירים מוקף במעגל שצויר עם עט הידרופובי בגודל משוער של מטבע של 1 סנט.
   1. הקיפו את המקטעים בקווי מתאר שצוירו בעט הידרופובי ושטפו עם מלח קר כקרח 0.1 מ' עם מאגר פוספט (PBS) למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר (RT). הניחו את המגלשה בתא לח ובחסימה למשך 90 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתמיסת חסימה (10% סרום עזים רגיל (NGS) ו-1:30 עכבר על עכבר (MOM) שחוסם ריאגנט ב-PBS).
   2. הסר את תמיסת החסימה ודגירה של השקופיות למשך 90 דקות ב- 37 °C עם התמיסה המכילה את הנוגדנים העיקריים (5% NGS, 1:30 MOM חוסם מגיב, הנוגדנים העיקריים של העכבר כדי לזהות את סוג I (IgG2b, בשעה 1:10), סוג IIa (IgG1, בשעה 1:10), וסוג IIx (IgM, בשעה 1:5) סיבים ואנטי-למינין של חולדה (שרשרת α2, 1:1,000) ב-PBS.
   3. שטפו את השקופיות עם PBS 3 x 5 דקות ב-RT.
   4. דגירה של המגלשות בחושך במשך שעה אחת ב-RT עם התמיסה המכילה את הנוגדנים המשניים (עזים נגד IgG2b AF405 (1:500), עזים נגד IgG1 AF488 (1:500), עזים נגד IgM AF568 (1:1,000), ועיזים נגד למינין AF647 (1:500) ב-PBS).
      אזהרה: במשך שאר הפרוטוקול, הקפידו להרחיק את השקופיות מהאור כדי לשמר את הפלואורסצנציה.
   5. יש לשטוף שוב 3 x 5 דקות ב-PBS, לשטוף ב-H₂O מזוקק כפול, להסיר עודפי מים ולהרכיב עם מגיב אנטיפאדה.
      הערה: אחסן את השקופיות בטמפרטורה של 4 °C (75 °F), מוגן מפני אור כדי לשמר את הפלואורסצנציה עד לרכישת התמונה. מכיוון שהשקופיות אינן קבועות, מומלץ להשתמש בפתרונות טריים לכל ניסוי, autoclave את ה- PBS, ולרכוש את התמונות בהקדם האפשרי כדי למנוע זיהום של החלקים.
2. צביעה של LDs עם Bodipy
   הערה: בדומה לשלב 4.1., נפח תמיסה כולל של 250 μL מספיק כדי לכסות את כל חלק השרירים המוקף בעיגול המצויר בעט הידרופובי בגודל משוער של מטבע של 1 סנט.
   1. הקיפו את החלקים בקווי מתאר שצוירו על ידי עט הידרופובי ושטפו ב-0.1 M PBS קר כקרח למשך 10 דקות ב-RT. השתמשו ב-PBS קר כקרח לכל השטיפות והשטיפות.
   2. תקן עם פרפורמלדהיד קר של 4% (PFA) ללא מתנול למשך 10 דקות ב- RT. לאחר שטיפה מהירה ראשונה, שטפו את המגלשות עם PBS 3 x 5 דקות ב-RT.
      אזהרה: בצעו שלב זה מתחת למכסה המנוע הכימי.
   3. מקם את המגלשה בתא לח ובחסם למשך שעה אחת ב- RT עם 5% NGS ב- PBS.
   4. הדגירו את השקופיות למשך 90 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם התמיסה של הנוגדן העיקרי (2% NGS ואנטי-למינין של חולדות (שרשרת α2, 1:1,000) ב-PBS). שטפו את השקופיות עם PBS 3 x 5 דקות ב-RT.
      אזהרה: במשך שאר הפרוטוקול, הקפידו להרחיק את השקופיות מהאור כדי לשמר את הפלואורסצנציה.
   5. דגירה במשך שעה אחת ב-RT עם תמיסת הנוגדן המשנית המכילה נוגדן נגד עזים נגד חולדה-AF647 (1:500) ב-PBS. שטפו את השקופיות עם PBS 3 x 5 דקות ב-RT.
   6. דגירה למשך 20 דקות ב-RT עם תמיסה של 4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI, 0.5 מיקרוגרם/מ"ל) ו-BODIPY (1 מיקרוגרם/מ"ל) ב-PBS.
      הערה: כדי להכין תמיסת מלאי BODIPY, להמיס אותה ב- DMSO בריכוז של 1 מ"ג / מ"ל. פורמולציות שונות של Bodipy זמינות באופן מסחרי עבור צביעת LD. בהתאם לבחירה שנעשתה, שיטת ההכתמה זהה (אותם צעדים, ריכוז וזמן דגירה); עם זאת, שיטת הרכישה תהיה שונה במקצת.
   7. לאחר שטיפה מהירה ראשונה, שטפו את המגלשות עם PBS 3 x 5 דקות ב-RT, שטפו ב-H₂O מזוקק כפול, הסירו עודפי מים והרכיבו עם ריאגנט אנטיפאדה.
      הערה: אחסן את השקופיות בטמפרטורה של 4 °C (75 °F), המוגנות מפני אור, כדי לשמר את הפלואורסצנציה עד לרכישת התמונה.

5. רכישת תמונות

הערה: לאחר השלמת פרוטוקולי ההכתמה, חשוב להמשיך מיד לרכישת התמונה (בתוך 24 השעות הבאות), לא רק כדי למנוע זיהום אלא גם כדי לשמר את המורפולוגיה, הגודל והמספר של LDs.

1. רכישת תמונות להערכת סוגי הסיבים של כל שריר שנדגם
   הערה: ניתן להשיג שלב זה באמצעות מיקרוסקופ סריקה פלואורסצנטית של שקופית שלמה או עם מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי קונבנציונלי. עם האחרון, תפירה ידנית או אוטומטית של התמונות חייבת להיעשות כדי לשחזר את הקטע.
   1. לזיהוי מסוג סיבים, השתמש במיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי עם מטרה של 10x/0.3. בחר מסנני עירור עבור DAPI (405 ננומטר), FITC, TRITC ו- Cy5 כדי לזהות סיבי I, IIa, IIx ולמינין מסוג I, בהתאמה.
      הערה: סיבים מסוג IIb לא יהיו בעלי תווית חיסונית. הם יוכרו כסיבים המוכתמים על ידי למינין על גבולות הסרקולמה עם סרקופלזמה שחורה.
   2. התאם את זמן החשיפה המתאים לכל ערוץ.
   3. בעת שימוש במיקרוסקופ אפיפלואורסצנציה קונבנציונלי, תמיד לרכוש את התמונות של השריר כולו בעקבות אותו סדר כדי להקל על שחזור השריר. ודא שהסיבים בקצה הימני של תמונה אחת מופיעים גם בקצה השמאלי של התמונה הבאה. כנ"ל לגבי החלק העליון והתחתון של התמונות (איור 3A).
      הערה: כהפניה, עבור קטע של EDL או הסולאוס המנותח מעכבר בן 3 חודשים, ממוצע של שש ושמונה תמונות, בהתאמה, יכסה את כל חתך השרירים.
   4. לאחר סריקת השריר, העלו את התמונות הדיגיטליות שנתפסו לכל תוכנת עיבוד תמונה לשחזור (תפירה), בהתבסס על מורפולוגיית הסיבים (למינין) וההיסטולוגיה של מקטע השרירים, ושמרו אותו כקובץ TIFF, PNG או JPG עם כל הערוצים (הצבעים) הממוזגים (איור 3A).
2. רכישת תמונות עם לכתם משותף של laminin ו- Bodipy
   הערה: כדי לזהות את סוג הסיבים ולהעריך את מספר הסיבים עבור כל סוג שנלכד, חיוני שהחלק מסוג סיבים כבר ייסרק והשרירים ישוחזרו לפני שתתחיל ברכישת התמונה של Bodipy-laminin (איור 3B).
   1. עבור תצפית ורכישה של תמונת Bodipy, השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי עם עדשה אובייקטיבית של טבילת שמן 40x עם מפתח צמצם מספרי של 1.4.
   2. השתמש בהגדרות הבאות: חור הצמדה ברזולוציה של 1 AU, רזולוציה של 2,048 פיקסלים x 2,048 פיקסלים, גודל פיקסל ב- 0.08 מיקרומטר, מצב חד-כיווני, מהירות סריקה ב- 4 (~ 4 μs/pixel), ממוצע שורות המוגדר ל- 4x וזום דיגיטלי המוגדר ל- 1.
   3. כדי להימנע משיחות צולבות בין Bodipy-558/568 לבין laminin-AF647, השתמש במצב הסריקה הרציפה בתוכנת הקונפוקל.
      הערה: כאשר הצבע שנבחר הוא Bodipy-493/503, סריקת לייזר קונפוקלית סימולטנית אפשרית ללא הצלבה בין ערוץ Bodipy לערוץ laminin-AF647. זה יאיץ את רכישת התמונות.
   4. הפעל את Bodipy-493/503 באמצעות קו לייזר 488 ננומטר או קו לייזר ארגון, והלהיב את Bodipy-555/568 באמצעות קו הלייזר של דיודה 561 ננומטר. לבסוף, זהה למינין-AF647 עם קו לייזר דיודה של 640 ננומטר.
      אזהרה: זכור כי מולקולות Bodipy רגישות מאוד להלבנת תמונות, לכן הימנע מסריקת לייזר מיותרת. כדי לזהות סיבים, השתמש רק בלייזר עבור laminin.
   5. בהתאם לצבע שנבחר, הגדר את טווחי הפליטה על 570-650 ננומטר עבור Bodipy-493/503²⁴ וב- 565-620 ננומטר עבור Bodipy-558/568. הגדר את טווח הפליטה עבור למינין על 656-700 ננומטר.
   6. הגדר את הרווח ואת הרווח הדיגיטלי בהתאם כך שלא יזוהו פיקסלים רוויים במחוון הטווח. תקן את אות הרקע על-ידי התאמת ההסטה.
      הערה: יש למטב את בחירת המסנן ופרמטרים אחרים של סריקה שהוזכרו לעיל עבור כל מיקרוסקופ קונפוקלי. חשוב שכל ההגדרות הנ"ל יישמרו קבועות להשוואה בין כל התמונות שנלכדו מדגימות.
   7. כדי לזהות את סוג הסיבים בקרב אלה המוצגים במיקרוסקופ הקונפוקלי, השתמשו במחשב נייד אישי שעליו נבדקת התמונה של הקטע ששוחזר לאחר אבחנה חיסונית מסוג סיבים (איור 3B).
   8. לאחר שקבוצת סיבים מזוהה כראוי, רכוש את התמונה עם תעלות Bodipy ו laminin.
      הערה: מומלץ לציין את שם התמונה Bodipy-laminin על אזור השריר שבו סיבים אלה ממוקמים על התמונה שנרכשה עבור זיהוי MyHC כדי להקל על ניתוח מאוחר יותר ספציפי סיבים של LDs.

6. ניתוח תמונות

1. ניתוח סוגי הסיבים על כל דגימת שריר
   1. בפיג'י (או ImageJ)³², פתח את קובץ ה- TIFF, PNG או JPG עם השריר המשוחזר המתקבל ממיזוג של כל הערוצים המשמשים לאיתור האיזופורמים של הסיבים.
   2. כדי להפעיל את הכלי ספירת תאים , לחץ על תוספים | לנתח | | מונה תאים מונה תאים.
   3. בחלון מונה התאים , לחץ על פעולות | אתחל.
   4. תחת מונים באותו חלון, בחר סוג 1.
   5. בחלון הראשי של פיג'י, בחר בכלי שרביט .
   6. כדי לכמת את מספר הסיבים של כל סוג, לחץ על כל סיב מאותו סוג, כך שהתוכנית מתעדת את מספר הסיבים שנלחצו.
   7. לאחר שתסיים, בחר את הסוג הבא של סיבים וחזור על אותם שלבים.
   8. כאשר כל הסיבים של התמונה הוקצו לסוג סיב נתון, לחץ על תוצאות בחלון מונה התאים כדי להציג את התוצאות בטבלה.
   9. שמור טבלה זו כטבלת גיליון אלקטרוני על-ידי לחיצה על קובץ | שמור בשם בחלון תוצאות .
   10. שמור וטען מחדש את הבחירות באותה תמונה בכל עת על-ידי לחיצה על שמור סמנים או טען סמני טעינה, בהתאמה, בחלון ספירת תאים .
2. ניתוח של טיפות שומנים באופן התלוי בסיבים
   1. נתח את התמונות של Bodipy ו laminin שהושגו על confocal באמצעות פיג'י עבור כימות של LDs.
      הערה: המחברים תכננו מאקרו מותאם אישית כדי להפוך את הניתוח לאוטומטי. מאקרו זה, יחד עם הסבר שלב אחר שלב על אופן השימוש בו, זמין כקובץ משלים 1 וקובץ משלים 2, בהתאמה.
   2. פתח כל תמונה בעזרת יבואן ביו-פורמטים מפיג'י. תחת האפשרות הצג מחסנית עם , בחר Hyperstack | מצב צבע, ברירת מחדל. ודא שהאפשרות 'שינוי גודל אוטומטי ' נבחרה.
      הערה: השלבים הבאים יתארו את הפרוטוקול לניתוח של סיב אחד בתמונה, אך יש לחזור עליו מספר פעמים רבות ככל שמספר הסיבים השלמים מופיע בתמונה.
   3. השתמשו בכלי הבחירה ביד חופשית כדי לבחור באופן ידני את הסרקולמה של הסיבים בהתבסס על תעלת הלמין (איור 4A) ולחצו על T על המקלדת כדי להקליט את הבחירה או אזור העניין (ROI) בחלון ההחזר על ההשקעה .
   4. עבור אל החלון הראשי של פיג'י ולחץ על נתח | הגדר מדידות, ובחלון הקופץ, בחר אזור וקוטר של Feret. השאר את התיבות הנותרות ללא סימון ופרמטרים אחרים כפי שהם מופיעים כברירת מחדל.
   5. לחץ על מדידה בחלון ההחזר על ההשקעה כדי לקבל את האזור ואת קוטר ה-MF המינימלי של הסיבים שנבחרו, ושים לב אליהם לשימוש מאוחר יותר.
      הערה: בעת ניתוח LDs, חשוב לזכור כי גודלם וצפיפותם משתנים בין המרכז לבין הפריפריה (אזור תת-סרקולמלי-SS) של הסיבים. לכן, הניתוח חייב להיעשות בנפרד.
   6. חשב את הערך של 1/6 של ה- MF כדי לתחום את החלק המרכזי של הסיב.
      הערה: במאקרו, ערך ה- MF המוגדר כברירת מחדל מוגדר ל- 6, כלומר ההפחתה שהוחלה תוגדר כ- 1/6 של ה- MF. ערך זה נבחר על סמך הנתונים האמפיריים שהתקבלו מסוליית בעלי חיים שניזונו מתזונה עתירת שומן. עם זאת, כל חוקר חייב לשנות מספר זה בהתבסס על הנתונים האמפיריים והשרירים שנותחו, סוג הסיבים ומצב בעלי החיים.
   7. בחלון החזר ההשקעה , לחץ על הוסף כדי לקבל שכפול של ההחזר על ההשקעה הראשון ובחר את ההחזר השני שמופיע בחלון.
   8. בחלון הראשי של פיג'י, לחץ על ערוך | | בחירה הגדל והצג את הערך שחושב בעבר (משלב 6.2.6.) עם סימן חיסור לפני המספר ולחץ על אישור. בחלון ההחזר על ההשקעה, לחץ על הוסף[t] (החזר השקעה שלישי חייב להופיע) ומחק, כדי למחוק את ההחזר על ההשקעה השני.
      הערה: החוקר יכול לבדוק את התוצאות על-ידי לחיצה על התיבה הצג הכל בחלון ההחזר על ההשקעה . בשלב זה, שני ROIs חייבים להופיע, אחד שמקיף את כל היקף הסיב (איור 4B) והשני שממוקם במרכז (איור 4C).
   9. בחר את שני ה- ROIs בחלון ההחזר על ההשקעה ולחץ על עוד | | XOR הוסף[ט]. המתן להופעת החזר השקעה שלישי, התואם את שולי הסיבים (איור 4D).
   10. שמור את ה- ROIs על ידי לחיצה על עוד | שמור כדי לשמור את ה- ROIs למקרה שיהיה צורך בניתוח מחדש מאוחר יותר של אותם סיבים.
   11. בחר את ערוץ Bodipy ופתח את הכלי סף על-ידי לחיצה על תמונה | התאמת | סף בחלון הראשי של פיג'י.
   12. בחלון המוקפץ Threshold , הגדר את הערכים ל- 70/255, בחר ין | שיטת B&W, ולחץ על | רקע כהה הגש בקשה.
       הערה: הערכים המוחלים על הסף עשויים להשתנות בהתאם לתנאי הניסוי ויש להגדיר את הסף כראוי כדי למטב את הניתוח. חלון B&W עם אות Bodipy מעל גבול הסף המוצג בלבן והרקע בשחור חייב להופיע (השווה את התמונה המקורית של Bodipy באיור 4E לזו שבאיור 4F).
   13. עבור אל החלון הראשי של פיג'י ולחץ על נתח | הגדר מדידות ובחלון המוקפץ, בחר אזור, שבר אזור והגבלה לסף. השאר את התיבות הנותרות ללא סימון ופרמטרים אחרים כפי שהם מופיעים כברירת מחדל.
       הערה: אם החוקר רוצה לנתח את ה"מעגליות" של LDs, שהיא אינדקס של המורפולוגיה הכדורית שנעה בין 1 עבור כדור מושלם ל-0 עבור שורה, לחץ על התיבה מתארי צורה של החלון הקופץ Set Measurements .
   14. עבור אל חלון ההחזר על ההשקעה ובחר את ההחזר על ההשקעה הראשון. בחלון הראשי של פיג'י, לחץ על נתח | כלי ניתוח חלקיקים.
       הערה: כלי זה מכמת את המספר, הגודל, השטח המכוסה ואחוז השטח הכולל המכוסה על ידי חלקיקים בכל בחירה ושומר את התוצאות כקובץ גיליון אלקטרוני.
   15. הגדר את הערכים מ - 2 ל - Infinity (2-Infinity) בחלון ניתוח חלקיקים , סמן את התיבה פיקסלים , שמור על ערכי המעגליות המוגדרים כברירת מחדל, בחר סכם ולחץ על אישור.
       הערה: כדי לבדוק את התוצאות בסיב, תחת האפשרות הצג , בחר בכל אחת מהאפשרויות הזמינות. כדי שהמידע של כל LD יוכר בבחירה בטבלה, עיין באפשרות הצג תוצאות בחלון ניתוח חלקיקים . התוצאות מניתוח השטח הכולל של הסיבים ממוצעות ומסוכמות בטבלה עם מספר עמודות (ספירה, שטח כולל, גודל ממוצע, % שטח; אלה תואמות את מספר החלקיקים [LDs], השטח שנכבש על ידי חלקיקים אלה, גודלם הממוצע, ואחוז השטח הכולל של הברירה תפוס על ידי חלקיקים, בהתאמה). כדי לחשב את הצפיפות, חלקו את מספר החלקיקים בשטח הכולל של כל בחירה.
   16. כדי לקבל את ערכי המרכז ואת הפריפריה של הסיב, חזור על שלבים 6.2.14 ו- 6.2.15, ובחר את השני (מרכז) ואת ההחזר על ההשקעה השלישי (פריפריה) בכל פעם.
   17. שמור את התוצאות על-ידי לחיצה על קובץ | שמור כמו בחלון סיכום .
       הערה: כלול את סוג הסיבים, את המצב ואת שם התמונה בשם שהוקצה של התוצאות כדי להקל על איחוד וניתוח סטטיסטי מאוחר יותר של הנתונים. כדי לנתח את שאר הסיבים באותה תמונה, חזור על שלבים 6.2.3 עד 6.2.17. עבור הניתוח הסטטיסטי, לפחות 10-15 סיבים מכל סוג חייב להיות מנותח לכל בעל חיים.

הפרוטוקול המתואר כאן מספק שיטה יעילה לכימות קל של LDs בסוג סיבים ובאופן תת-תאי ספציפי. הוא מראה כיצד, על ידי הקפאת שני שרירים בגודל דומה, כגון ה- EDL והסולאוס, הזמן והמשאבים המושקעים בשלבים הבאים מצטמצמים בחצי.

פרוטוקול מלא מסופק עבור חיסון, רכישת תמונה וניתוח של האיזופורמים השונים של MyHC המתבטאים בשרירי עכברים בוגרים. פרוטוקול זה מבוסס על זה שתוכנן לראשונה על ידי Schiaffino et al. בשנת 1989³³, עם כמה התאמות כגון שימוש בנוגדן נוסף כדי לתייג למינין. שינוי מאוחר זה הוא קריטי עבור המיקום של סיבי IIb מסוג IIb, אשר יהיה שחור כפי שהם לא מוכתמים עם כל נוגדנים. כפי שניתן לראות באיור 5, פרוטוקול אימונוהיסטוכימי זה לא רק מאפשר זיהוי של סיבים בעלי חמצון איטי של עכברים (מסוג I ו-IIa) ומהיר-גליקוליטיים (מסוג IIx ו-IIb), אלא גם נוכחות של סיבים היברידיים (ראו כוכבית באיור 5D). יתר על כן, קיום החתכים של שני השרירים על אותה שקופית מאפשר את השוואת הפרופורציות של כל סוג סיבים בין שני השרירים שנבחרו, ומבטיח שתנאי הניסוי היו זהים בשני החלקים.

עבור תיוג LD, התוצאות המוצגות כאן מבוססות על השימוש ב- Bodipy-558/568 C₁₂ כצבע שומנים; עם זאת, הקורא מופנה למאמר פרוטוקול מצוין המפרט את השימוש בצבע הקלאסי Bodipy-493/503 בקטעי שרירים²³. הפרוטוקול שהוצג שילב צביעה של LDs בהתבסס על אימונוהיסטוכימיה נגד α2-laminin כדי להבחין בין סרקולמה הסיבים. כמו בניסוי מסוג סיבים, שלב זה חיוני, לא רק לזיהוי של סיבים בודדים, אלא גם לניתוח מאוחר יותר של שומנים הן באזורים המרכזיים והן באזורים ההיקפיים של הסיבים (איור 4). אחד השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה הוא זיהוי ותיוג של אותם סיבים בשתי השקופיות. כפי שהוסבר קודם לכן, חשוב לסרוק את השקופית עם סוגי סיבים ולערוך שחזור של חתכי שרירים עם הצבעים הממוזגים לפני רכישת תמונות עבור LDs (איור 3B). מבנים מדהימים של כל מקטע שריר, כגון זרדים של אקסון או צירי שרירים, הם ציוני דרך טובים שיכולים לעזור לחוקר לאתר את אותם סיבים בשתי השקופיות (איור 6). זכור כי מכיוון שהשקופית ממוקמת במהופך על רוב המיקרוסקופים הקונפוקליים, מומלץ להפוך את התמונה המשוחזרת מסוג סיבים במחשב האישי כדי להקל על משימת המיקום.

ההגדרות המתוארות לרכישת צביעת בודיפי-למינין על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית מאפשרות הדמיה וניתוח מאוחר יותר של הגודל, המספר וההתפלגות של LDs משלושה עד שישה סיבים בו זמנית (איור 6 ואיור 7). פרוטוקול מפורט שלב אחר שלב לניתוח LDs עם תוכנת ניתוח התמונות פיג'י מסופק גם כאן. כפי שמוצג בפרוטוקול, הניתוח המלא של כל אחד מהסיבים הקיימים בתמונה הוא ארוך ומייגע. עם זאת, לפיג'י יש את היתרון של התרת עיצוב של תוכניות מותאמות אישית, הנקראות פקודות מאקרו, המבוססות על שפת Java. המחברים עיצבו מאקרו המאפשר אוטומציה של סדרת הפקודות הבודדות שתוארו לעיל, המופעלת באופן אוטומטי בלולאה לניתוח תוך מספר דקות - לא רק כל אחד מהסיבים הקיימים בתמונה אלא גם קבוצה גדולה של תמונות. הקלט היחיד של החוקר הוא הבחירה הידנית של היקף הסיב שיש לנתח בכל פעם, בחירת סוג הסיבים, והבדיקה החזותית של התמונה המתקבלת לאחר החלת הסף וכימות החלקיקים.

כאן, ניתוח של LDs באופן תלוי מיקום מיושם. על-ידי מדידה קודמת של השטח וקוטר ה-MF של הסיב, מופעלת הפחתה תלוית-גודל (לא קבועה כפי שתואר על-ידי Strauss et ^al.25) כדי לקבל את האזורים המרכזיים וההיקפיים של כל סיב (איור 4 ואיור 7). כפי שניתן לראות בהיסטוגרמות של איור 7, שיטה זו מאפשרת כימות של שלושה פרמטרים חשובים: אחוז שטח הסיבים שתופסים LDs (איור 7E), הצפיפות של LDs - מספר ה-LDs למיקרומטר² (איור 7F) והגודל הממוצע של LDs (איור 7G). כתוצאה מכך, בעכברים בני 3 חודשים (N = 5), סיבים מסוג IIa (מתווה ירוק) וסוג IIx (מתאר אדום) מציגים את החלק הגדול ביותר של שטח תפוס על ידי LDs בפריפריה (איור 7E). ביחס לצפיפות החלקיקים, סיבי EDL מראים תמיד צפיפות גבוהה יותר מסיבי סולאוס ללא תלות במיקום התת-תאי (איור 7F). לבסוף, הגודל הממוצע של אותם LDs תמיד גדול יותר בפריפריה מאשר במרכז (איור 7G).

השיטות השונות המשמשות קבוצות אחרות להערכת הצטברות של LDs בשרירי השלד של מכרסמים^34,35 מקשות על השוואת תוצאות אלה לאלה של מחקרים קודמים. עם זאת, בהתאם לתוצאות של Komiya et ^al.34, אחוז שטח הסיבים תפוס על ידי LDs הוא גבוה יותר בסיבי soleus מסוג IIa ו- EDL מסוג IIx. והכי חשוב, סיבי IIb מסוג IIb הציגו את האחוז הנמוך ביותר של שטח תפוס על ידי LDs (איור 7E, היסטוגרמות אפורות). מאחר שסוג הסיבים IIb הוא סוג הסיבים השולט ביותר ב-EDL (75%, איור 5E), התוצאות האלה מאשרות את מה שקבוצות אחרות תיארו בעבר: ההצטברות הכוללת של שומנים נמוכה יותר ב-EDL מאשר בסולאוס^34,35.

בניגוד למה שתואר בבני אדם²⁵, וגם בהתאם לתוצאות של Komiya et ^al.34, התוצאות שהוצגו כאן מראות כי הצטברות LDs בסיבי soleus Type I נמוכה יחסית. ניתן להסביר זאת על ידי הבדלים בין-מיניים מסוג סיבים בין עכברים לבני אדם³⁶, שכן התכונות המטבוליות של סיבים מסוג I אנושי דומות יותר לאלה של מכרסמים מסוג IIa ו- IIx, בעוד שאלו של סיבי IIx מסוג IIx מסוג אנושי קרובים לסוג מכרסמים IIb³⁷. לסיכום, הטכניקות השונות המתוארות כאן מספקות שיטה ניתנת לשחזור, אמינה וחסכונית בזמן כדי לחקור ולהשוות מספר פרמטרים הקשורים ל-LDs ולהתפלגותם בתוך התא באופן התלוי בסוג הסיבים.

ניסויים לא אופטימליים
אם הליך ההקפאה לא מבוצע כראוי ואיזופנטן אינו נמצא בטמפרטורה הנכונה, גבישי קרח ייווצרו בתוך הסיבים (איור 8A). ממצאי הקפאה אלה ניתנים לזיהוי רק לאחר ההכנה ההיסטולוגית של הדגימה וניתן לזהותם כחורים בסיבים. לצורך כימות נכון של LDs, יש להימנע מממצאים אלה. הוכח כי הפשרה והקפאה מחדש של גוש השרירים כראוי יכולים להפחית באופן משמעותי את הממצאים הללו²⁹.

בעיה נוספת נתקלת כאשר סיבים אינם נחתכים בניצב לציר האורך (איור 8B). כימות LD והשוואה בין סיבים, שרירים או בעלי חיים אינם יכולים להיעשות כאשר מקטעים אינם רוחביים. מסיבה זו, חיוני למקם את השרירים בצורה נכונה על הפקק בעזרת מיקרוסקופ סטריאו לפני הקפאה ויש להם מיקרוסקופ שדה בהיר קרוב לקריוסטט. זה האחרון יאפשר לחוקר למצוא את היישור הנכון של הדגימה על cryostat.

במקרים נדירים מסוימים, התווית של איזופורמים של MyHC חלשה מאוד בסוג סיבים אחד או יותר (איור 8C). אם זה יקרה, הניתוח של LDs יהיה לא שלם. במקרה זה, יש לחזור על הניסוי החל מחיתוך השרירים. לבסוף, בודיפי יכול להצטבר בפריפריה של חתך השרירים (איור 8D). אם זה יקרה, הכתם יהיה חזק מאוד על אותם סיבים לייצר תוצאה artifactual. הימנע מרכישת תמונות מסיבים אלה.

איור 2: הכנת הדגימות להקפאה ולקריוזקציה. (A-D) סולאוס עכבר ושרירי EDL מנותחים ומונחים על פקק המוחזק על ידי פלסטיק קשיח עם טיפה של OCT. (E-G) טמבלר נירוסטה מלא באיזופנטן ומקורר לטמפרטורת ההיתוך שלו בחנקן נוזלי. (ח,א) הטמבלר עם האיזופנטן הקר הוצא מהחנקן הנוזלי, והדגימה שקועה עד לתחתית הטמבלר, מסתחררת במשך 15 שניות (J-L) הפקק עם הדגימות ממוקם על דיסק מחזיק הקריוסטט ללא תמיכת הפלסטיק, וקטעים רוחביים סדרתיים של 10 מיקרומטר מותקנים ישירות על מגלשות הידבקות. שני חתכי רוחב טוריים סמוכים מעובדים באופן מיידי לצורך צביעת LDs וזיהוי של MyHCs. קיצורים: LDs = טיפות שומנים; EDL = extensor digitorum longus; MyHCs = איזופורמים של שרשרת כבדה של מיוזין; OCT = טמפרטורת חיתוך אופטימלית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 3: רכישת תמונה של Bodipy לאחר זיהוי סוג הסיבים מהתמונה המורכבת המשוחזרת שנראתה במחשב אחר. (A) שחזור של כל מקטע הסולאוס עם תווית חיסונית עבור סוג סיבים (MyHCs) משבע תמונות ממוזגות עצמאיות (מלבנים מקווקווים) שנתפרו יחד באמצעות תוכנת עיבוד תמונה. החצים הלבנים והמספרים מייצגים את הסדר שנעשה במהלך בדיקת התמונה באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי קונבנציונלי. (B) עבור רכישת תמונה של Bodipy, (1) שדה המכיל את חתך השרירים המוכתם במערכת החיסון של למינין-AF647 ו-Bodipy-555/568 מוצג על מסך של מחשב המחובר למיקרוסקופ הקונפוקלי. (2) סיבים אלה ממוקמים על התמונה המשוחזרת של חתך השרירים המוכתם באופן חיסוני כדי לזהות את סוג הסיבים (MyHCs). (3) התמונה נרכשת באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. קיצורים: LDs = טיפות שומנים; DAPI = 4',6-diamidino-2-פנילינדול; MyHCs = איזופורמים של שרשרת כבדה של מיוזין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 4: ניתוח של טיפות שומנים עם פיג'י. (A,B) הסרקולמה של הסיבים מוכרת על סמך תמונת הלמינין ונבחרת כ-ROI. השטח הכולל וה- MF נמדדים. (C) כדי לזהות את החלק המרכזי של הסיב, הבחירה מופחתת ב-1/6 מערך ה-MF. (D) השטח שבין הבחירה המרכזית לסך הכל מוגדר כפריפריה או כאזור התת-סרקולמלי. (E) לצורך ניתוח של LDs המוכתמים ב-Bodipy, מוחל סף, (F) והכלי Analyze Particles משמש לכימות פרמטרים שונים הקשורים ל-LDs (ראו טבלה). ערכים אלה מתקבלים עבור הסיב השלם (All), עבור החלק המרכזי (מרכז) ועבור האזור התת-סרקולמלי (פריפריה), באופן עצמאי. סרגלי קנה מידה = 12 מיקרומטר. קיצורים: LDs = טיפות שומנים; ROI = אזור עניין; MF = קוטר מינימלי של Feret. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 5: חיסון מייצג של סוגי סיבים בשריר עכבר EDL (גליקוליטי) וסולאוס (חמצוני). מיזוג תמונות פלואורסצנטיות של EDL (A,B) וסולאוס (C,D) שהתקבלו עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי דיגיטלי עם שקופיות שלמות. נעשה שימוש בנוגדנים נגד סוג I (כחול-AF405), סוג IIa (ירוק-AF488), סוג IIx (אדום-AF568) ולמינין (לבן-AF647). סיבים שחורים מתאימים לסוג הסיבים IIb. B ו- D מראים פרטים של הסיבים בתוך המלבנים הלבנים של לוחות A ו- C, בהתאמה. הכוכבית (*) בפאנל D מציגה סיב היברידי IIa/IIx. (ה,ו) כימות מייצג של התפלגות סוג הסיבים ב-EDL ובסולאוס מעכברים בני 3 חודשים (N=5). EDL הורכב בעיקר מסיבי IIb מסוג IIb, ולאחר מכן מסיבי IIx ו-IIa (כ-75%, 15% ו-5%, בהתאמה). לעומת זאת, סולאוס הורכב בעיקר מסיבים מסוג IIa (>50%) וסיבים מסוג I (30%). הפרופורציות של סיבי IIx מסוג IIx היו דומות למדי בשני השרירים, בעוד אלה של סיבים היברידיים היו נמוכות מאוד. סרגלי קנה מידה = 200 מיקרומטר (A,C), 100 מיקרומטר (B,D). קיצור: EDL = extensor digitorum longus. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 6: צביעה מייצגת של LDs עם Bodipy על חתכים טוריים שבעבר סומנו עבור איזופורמים של MyHC. פלואורסצנציה מיזגה תמונות של עכבר EDL (A) וסולאוס (B) שנרכשו באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי המציג את סוג I (כחול), IIa (ירוק), IIx (אדום), IIb (שחור) סיבים, ולמינין (אות לבן המקיף את הסיבים). (ג-ו) תמונות פלואורסצנטיות קונפוקליות מה-EDL (C,D) והסולאוס (E,F) מסומנות יחד עם למינין (ציאן) ובודיפי (אדום). שים לב שהסיבים המוצגים ב- C-F זהים לאלה שבתוך המלבנים הלבנים בלוחות A ו- B. בפינה הימנית של המלבן הלבן ב-A, ניתן להבחין בזרד אקסון (ראש חץ לבן). סרגלי קנה מידה = 200 מיקרומטר (A,B), 20 מיקרומטר (C-F). קיצורים: LDs = טיפות שומנים; EDL = extensor digitorum longus; MyHCs = איזופורמים של שרשרת כבדה של מיוזין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 7: כימות של LDs באופן ספציפי לסוג סיבים ותת-תאיים. תמונות קונפוקליות פלואורסצנטיות מייצגות של סיבים מסוג I וסוג IIa מסיבי סולאוס (A,B) וסיבים מסוג IIx וסוג IIb מ-EDL (C,D) המתקבלות לאחר תיוג משותף עם Bodipy (אדום) ו-α2-laminin (לא מוצג). תכולת LD (% מהשטח שנכבש על ידי Bodipy והצפיפות) והמורפולוגיה (הגודל) נותחו באופן תת-תאי ספציפי. היקף הסיבים הוגדר על ידי צביעת למינין והאזורים המרכזיים או ההיקפיים נקבעו על בסיס קוטר ה-MF. אחוז שטח הסיבים שנכבש על ידי Bodipy (LDs) (E), צפיפות LD (מספר/μm²) (F), או גודל LD ממוצע (G) באזורים מרכזיים או היקפיים עבור כל סוג סיבים. התוצאות מיוצגות כממוצע ± SEM. סרגלי קנה מידה = 10 מיקרומטר. קיצורים: LDs = טיפות שומנים; EDL = extensor digitorum longus; C = מרכזי; P = היקפי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 8: תמונות המתאימות לתוצאות לא אופטימליות. (A) תמונת ברייטפילד של חתך שריר מוכתם בהמטוקסילין-אאוזין המציגה גבישי קרח שנוצרו במהלך תהליך ההקפאה. (B) פלואורסצנציה התמזגה תמונה של חתך סולאוס המוכתם באופן חיסוני עבור MyHCs ולמינין, ומראה כי רוב הסיבים נחתכים לאורך ציר האורך. (C) תמונה פלואורסצנטית של חתך EDL מוכתם באופן חיסוני עבור MyHCs ולמינין. הכתם החלש של IIa מסוג סיבים (ירוק) מעכב את הכימות הנכון של כל סוג סיבים. (D) תמונה קונפוקלית המציגה צביעה חזקה של Bodipy (אדום) על סיבים הממוקמים בשולי חתך השרירים. סרגלי קנה מידה = 50 מיקרומטר (A,B), 200 מיקרומטר (C,D). קיצורים: EDL = extensor digitorum longus; MyHCs = איזופורמים של שרשרת כבדה של מיוזין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור משלים S1: צביעת LD עם O אדום שמן על חתכי שרירים. (א,ב) תמונות קונפוקליות המציגות את תבנית הכתם המתקבלת עם שמן אדום O בסולאוס וב- EDL, בהתאמה. הפרוטוקול המשמש לצביעה זו מתואר בפירוט על ידי Prats et ^al.24. שים לב כי הצטברות של LDs גבוהה יותר באזור התת-סארקולמלי של המיופיברים, כפי שתואר בעבר עבור Bodipy. סרגלי קנה מידה = 20 מיקרומטר. קיצורים: LD = טיפת שומנים; EDL = extensor digitorum longus. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S2: צביעה משותפת של LDs ומיטוכונדריה בשריר הסולאוס. (A) תמונה ממוזגת קונפוקלית המציגה את האימונו-לבלינג של Tomm20, חלבון הנמצא על הממברנה המיטוכונדרית (ירוק), DAPI (כחול) ו- Bodipy-558/568 מסומן LDs (אדום). הכניסה ב-A מראה מספר מיטוכונדריה (ירוקה) הקשורה ל-LDs (אדום). תמונה זו התקבלה על ידי יישום מיקרוסקופיית-על קונפוקלית Airyscan. (ב,ג) תמונות חד-ערוציות תואמות של LDs ומיטוכונדריה, בהתאמה. סרגלי קנה מידה = 10 מיקרומטר (A-C), 5 מיקרומטר (A, inset). קיצורים: LDs = טיפות שומנים; DAPI = 4',6-diamidino-2-פנילינדול. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 1: מאקרו פיג'י לניתוח אוטומטי של LDs על מספר תמונות למינין +Bodipy. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 2: הסבר שלב אחר שלב כיצד לעבוד עם המאקרו Bodipy_JoVE.ijm. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

הפרוטוקול המפורט כאן מתאר שיטה יעילה לכימות LDs המתויגים עם Bodipy על בסיס ספציפי לסוג סיבים ותת-תאיים. בשנים האחרונות, צבעי שומנים קלאסיים, כגון ORO או סודן שחור B, הוחלפו במערך חדש של צבעים חדירים לתאים, ליפופיליים, פלואורסצנטיים הנקשרים לשומנים ניטרליים (למשל, Bodipy). Bodipy, הזמין כמצומדים שונים, הוכח כיעיל מאוד בתיוג LDs כדי לחקור את המורפולוגיה, הדינמיקה והאינטראקציה שלהם עם אברונים אחרים, לא רק ברקמות קבועות שונות ובתאים 23,38,39,40 אלא גם בתאים חיים ^41,42.

בתוך הפרוטוקול, ישנם מספר היבטים קריטיים שעל החוקר לשקול כדי להשיג תוצאות אופטימליות. זה חיוני כדי למקם את השרירים שנבחרו כראוי על הפקק כדי להבטיח יישור מושלם וכיוון של myofibers שריר, שכן ברגע קפוא, רק התאמות קלות של המחזיק יכול להיעשות על cryostat. יתר על כן, זה קריטי להתחיל את פרוטוקול immunostaining מיד לאחר חיתוך החלקים, שכן cryosections ייבוש אוויר (במשך 15 דקות בלבד) יש השפעות שליליות חמורות על LDs, וכתוצאה מכך ירידה של 66% בצפיפות LD וירידה של 37% בגודל הממוצע²⁴. באופן דומה, להקפאה ולהפשרה של המגלשות יהיו השפעות שליליות ולכן אינן מומלצות. תכונה חשובה שלישית של פרוטוקול זה קשורה לקיבוע של דגימות. לצורך זיהוי האיזופורמים השונים של MyHC עם הנוגדנים המצוטטים כאן, יש להימנע מקיבוע רקמות מכיוון שהוא משבש את קשירת הנוגדנים שנבחרו לאפיטופים שלהם. אם דגימות השרירים תוקנו בעבר, הקורא מופנה למאמר שפורסם לאחרונה באמצעות נוגדנים שונים⁴³. רק PFA ללא מתנול מומלץ לסימון ולכימות של LDs, מכיוון שהשימוש במתנול או באצטון משבש את המורפולוגיה של LDs^23,44. יתר על כן, שלב חדירה אינו הכרחי לכימות של LDs על שקופיות עם תווית חיסונית עם למינין. מאחר שקבוצות מסוימות הראו כי חדירה עם דטרגנטים כגון TritonX-100, saponin או גליצין יכולה להקטין את הגודל או המספר של LDs^44,45, permeabilization הוא מאוד discouraged. לבסוף, הכוונון העדין של הגדרות המיקרוסקופ הקונפוקלי הוא חיוני כדי לזהות רק את השומנים הנייטרליים הקיימים ב-LDs ולא את אלה שבקרומים של אברונים אחרים²⁴.

כאן, Bodipy-558/568 C₁₂ שימש כסמן LD. עם זאת, ה-Bodipy הנפוץ ביותר המשמש לתיוג LDs ולחקר המורפולוגיה והמיקום שלהם בתוך שרירי השלד הוא Bodipy-493/503. שני הצבעים דומים בזמן הדגירה שלהם, בריכוז העבודה ובספקטרום הפליטה הצר שלהם, אם כי טווחי העירור והפליטה שלהם שונים במקצת. לפרוטוקול מלא על השימוש ב- Bodipy-493/503, הקורא מופנה לעבודתם של ליסטנברגר ובראון⁴⁶ או Spangenburg et ^al.23. Bodipy-558/568 C₁₂ שימש להכתמת LDs ברקמות אחרות כגון רקמת שומן⁴⁷, רשתית מנוונת⁴⁸, כליות פיברוטיות⁴⁹, או פיברובלסטים⁵⁰. בודיפי זה מניב צביעה דומה לזו המתקבלת עם ORO (ראו איור משלים S1) אך עם הרבה פחות נטל טכני ויותר ספציפיות^24,51. יתר על כן, ל-Bodipy-558/568 C₁₂ יש יתרון בכך שהוא מאפשר כימות של LDs בשילוב עם זיהוי של חלבונים או אברונים המתויגים עם נוגדן משני בספקטרום ירוק (ראו איור משלים S2 ו-Yan et ^al.49) או עם מודלים מהונדסים גנטית^{GFP 52}. שני יישומים אלה הם כלים רבי עוצמה מאוד כדי לפענח את הדינמיקה והאינטראקציות של LDs עם אברונים וחלבונים אחרים של התא. אף על פי כן, כאשר אין כוונה לקולבלציה של חלבונים בתוך התאים, המחברים ממליצים על שימוש בצבע LD המאופיין בצורה הטובה ביותר Bodipy-493/503.

אחת המגבלות של פרוטוקול זה קשורה לרכישת תמונות ולכימות המאפיינים המורפולוגיים של LD. ההתקדמות הטכנולוגית במיקרוסקופיה של סריקת לייזר קונפוקלית שיפרה מאוד את רזולוציית המישור בהשוואה למיקרוסקופים רחבי שדה ומאפשרת שחזור תלת-ממדי של עצמים בעת סריקת הדגימה במישור Z. זה היה שימושי מאוד לחקר המורפולוגיה של LD²⁴ ואינטראקציה עם חלבונים אחרים במיופיברים שלדיים^38,53, אך הגדיל את זמן רכישת התמונה ועיבודה, שכן כל תמונה משוחזרת בתלת-ממד מורכבת ממספר תמונות דו-ממדיות בלתי תלויות. בפרוטוקול הנ"ל, תמונות קונפוקליות נרכשו עם עדשה אובייקטיבית פי 40 ורק בדו-ממד. שיטה זו מאפשרת רכישה של שלושה עד שישה myofibers לכל תמונה במקום רק אחד כפי שיהיה בעת שימוש במטרה 63x. התוצאה היא רזולוציה נמוכה יותר והערכה כוללת של גודל ה-LD והמורפולוגיה שאינה מדויקת לחלוטין. עם זאת, הוא מאפשר ניתוח של מספר גדול יותר של סיבים לכל מדגם, וזו גם עובדה חשובה שיש לקחת בחשבון, במיוחד בניסויים בבעלי חיים, שבהם יש להשוות מספר גבוה של שרירים ותנאים.

כאן, נראה כי על ידי הקפאת שני שרירים בגודל דומה הסמוכים זה לזה³⁴, זמן העיבוד של הדגימות מצטמצם במידה ניכרת, והבדלים אפשריים הנגזרים מהעיבוד העצמאי שלהם מצטמצמים. יתר על כן, שיטה זו של ניתוח LDs לוקחת בחשבון את ההבדלים בין ההתפלגות התת-תאית של LDs בתוך ובין סוגי סיבים⁵⁴. בחירת ההיקף של המיופייבר והקטנת בחירה זו ביחס לקוטר ה-Feret המינימלי של הסיבים מקלה על חקר הגודל והצפיפות של LDs מרכזיים והיקפיים (תת-סרקולמלים) באופן עצמאי. יישום שיטה זו חשוב ביותר שכן הוכח כי הצטברות תת-סרקולמלית של LDs תורמת ישירות לתנגודת לאינסולין. בעוד שכמה דיווחים בבני אדם חקרו LDs בצורה תלוית סיבים ומקום ^11,16,25, זו הפעם הראשונה, למיטב ידיעתנו, ששיטה זו מיושמת על שרירים ממכרסמים. יתר על כן, הכימות של LDs בעזרת מאקרו שתוכנן באופן עצמי עבור פיג'י הפחית באופן משמעותי ופשט את זמן ניתוח התמונה. גם המאקרו וגם הסבר שלב אחר שלב על אופן השימוש בו זמינים כקובץ משלים 1 וקובץ משלים 2, בהתאמה.

באופן כללי, המחברים סבורים כי הפרוטוקול המתואר כאן יכול להיות כלי שימושי עבור חוקרים אחרים החוקרים את חילוף החומרים של שומנים בשרירי השלד. הטכניקות שהוסברו עשויות להיות מיושמות על שרירים שונים ובתנאים מובחנים (צום/מוגזם, מאומן/יושבני, צעיר/זקן, רזה/שמן) ובתקווה יסייעו להבין טוב יותר את הדינמיקה של LDs, את חשיבות האינטראקציות שלהם עם מרכיבים אחרים של התא, כיצד שומנים מאוחסנים ומיובשים בסיבים גליקוליטיים וחמצוניים, ואת תפקידם בהתפרצות של תנגודת לאינסולין בסוכרת מסוג 2.

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מה-Fonds National de la Recherche Scientifique (FNRS-Crédit de Recherche J.0022.20) ומ-Société Francophone du Diabète (טיפול בסוכרת SFD-Roche).C.M.S. הוא זוכה מלגת דוקטורט מטעם ה-FRIA (FNRS). M.A.D.-L.d.C. קיבל מלגה מתוכנית המצוינות הבינלאומית של וולוני-בריסל.

המחברים מודים לאליס מונייה על תרומתה לפיתוח פרוטוקול זה ולקרוליין בוזין על מומחיותה ועזרתה הטכנית בתהליך רכישת התמונה. אנו מודים גם לפלטפורמת ההדמיה 2IP-IREC על הגישה לקריוסטאט ולמיקרוסקופים (פלטפורמת הדמיה 2IP-IREC, המכון למחקר ניסויי וקליני, אוניברסיטת קתוליק דה לוביין, 1200 בריסל, בלגיה). לבסוף, המחברים מבקשים להודות לניקולס דובייסון, רומן ווסל ומישל אבו-סמרה על הביקורת הבונה על כתב היד. חלק מהדמויות של מאמרים אלה נוצרו עם BioRender.com.