نوع الألياف والتحليل الخاص بالخلايا لمحتوى قطرات الدهون في العضلات الهيكلية

تشير الأدلة المتزايدة إلى أن التسلل المفرط للدهون داخل العضلات الهيكلية يؤدي إلى السمية الدهنية ومرض السكري. هنا ، نقدم بروتوكولا كاملا ، بما في ذلك معالجة الأنسجة ، والتلطيخ باستخدام Bodipy ، والحصول على الصور ، وتحليلها ، لتحديد حجم وكثافة وتوزيع قطرات الدهون تحت الخلوية بطريقة محددة من نوع الألياف.

يزداد تسلل الدهون في العضلات الهيكلية ، والمعروف باسم myosteatosis ، مع السمنة والشيخوخة. كما تم اكتشاف Myosteatosis مؤخرا كعامل تنبؤي سلبي للعديد من الاضطرابات الأخرى مثل أمراض القلب والأوعية الدموية والسرطان. التسلل المفرط للدهون يقلل من كتلة العضلات وقوتها. كما أنه يؤدي إلى السمية الشحمية ومقاومة الأنسولين اعتمادا على إجمالي محتوى الدهون داخل الخلايا ، ومورفولوجيا قطرات الدهون (LD) ، والتوزيع دون الخلوي. نوع الألياف (المؤكسد مقابل تحلل السكر) مهم أيضا ، لأن الألياف المؤكسدة لديها قدرة أكبر على استخدام الدهون. بسبب آثارها الحاسمة في الفيزيولوجيا المرضية ، هناك ما يبرر إجراء دراسات متعمقة حول ديناميكيات LD ووظيفتها بطريقة خاصة بنوع الألياف.

هنا ، يتم تقديم بروتوكول كامل لتحديد كمية محتوى الدهون intramyocellular وتحليل مورفولوجيا LD والتوزيع دون الخلوي بطريقة خاصة بنوع الألياف. تحقيقا لهذه الغاية ، تم تلطيخ عمليات تبريد العضلات التسلسلية بصبغة الفلورسنت Bodipy والأجسام المضادة ضد متساوي السلسلة الثقيلة الميوسين. يتيح هذا البروتوكول المعالجة المتزامنة للعضلات المختلفة ، وتوفير الوقت وتجنب القطع الأثرية المحتملة ، وبفضل ماكرو شخصي تم إنشاؤه في فيجي ، أصبح من الممكن أيضا أتمتة تحليل LD.

يزداد تسلل الدهون في العضلات الهيكلية ، والمعروف باسم myosteatosis ، مع السمنة والشيخوخة. يرتبط Myosteatosis سلبا بكتلة العضلات وقوتها ومع حساسية الأنسولين¹. علاوة على ذلك ، تشير الدراسات الحديثة إلى أنه يمكن استخدام درجة تنخر العظم العضلي كعامل تنبؤي لحالات أخرى مثل أمراض القلب والأوعية الدموية² أو مرض الكبد الدهني غير الكحولي³ أو السرطان⁴. يمكن أن تتراكم الدهون في العضلات الهيكلية بين ألياف العضلات كدهون خارج الخلية أو داخل الألياف ، مثل الدهون داخل الخلايا (IMCLs). يتم تخزين IMCLs في الغالب كدهون ثلاثية في قطرات الدهون (LDs) التي تستخدم كوقود استقلابي أثناء التمرين البدني ^5,6. ومع ذلك ، عندما يتجاوز عرض الدهون الطلب ، أو عندما تصبح الميتوكوندريا مختلة وظيفيا ، فإن IMCLs سوف تكون متورطة في مقاومة الأنسولين العضلي ، كما هو موضح في الأفراد غير الأصحاء والسمنة الأيضية وفي مرضى السكري من النوع 2⁷. ومن المثير للاهتمام ، أن رياضيي التحمل لديهم مستويات مماثلة ، إن لم تكن أعلى ، من IMCLs لتلك الموجودة في المرضى الذين يعانون من السمنة المفرطة مع داء السكري من النوع 2 ، مع الحفاظ على حساسية عالية للأنسولين. توصف هذه الظاهرة بأنها "مفارقة الرياضي"^8,9 ، ويتم تفسيرها من خلال تقييم أكثر دقة ل LDs العضلات ، المتعلقة بحجمها وكثافتها وتوطينها وديناميكياتها وتكوين أنواع الدهون.

أولا ، يرتبط حجم LD عكسيا بحساسية الأنسولين واللياقة البدنية^10,11. في الواقع ، تظهر LDs الأصغر مساحة سطح أكبر نسبيا لعمل الليباز ، وبالتالي ، من المحتمل أن يكون لها قدرة أكبر على تعبئة الدهون¹². ثانيا ، تلعب كثافة LD (العدد / السطح) دورا مثيرا للجدل في عمل الأنسولين ^8,10 ؛ ومع ذلك ، يبدو أنه يزداد في الرياضيين. ثالثا ، يعد التوطين تحت الخلوي ل LDs مهما ، لأن LDs الموجودة أسفل الغشاء السطحي مباشرة (تحت الساركوليمال أو المحيطي) تمارس تأثيرا أكثر ضررا على حساسية الأنسولين من تلك المركزية ^8,9,13. وتوفر هذه الأخيرة الوقود للميتوكوندريا المركزية، التي لديها نشاط تنفسي أكبر وأكثر تخصصا لتلبية الطلب المرتفع على الطاقة اللازم للانكماش¹⁴. وعلى النقيض من ذلك، توفر LDs الطرفية الميتوكوندريا تحت الساركوليمالية، التي تشارك في العمليات المتعلقة بالأغشية⁸. أخيرا ، بالإضافة إلى الدهون الثلاثية ، قد تكون الدهون المعقدة المحددة داخل العضلات أكثر ضررا من غيرها. على سبيل المثال ، قد يتراكم diacylglycerol و acyl-CoA طويل السلسلة والسيراميد في العضلات عندما يكون معدل دوران الدهون الثلاثية منخفضا ، مما يضعف إشارات الأنسولين ^9,15. بالعودة إلى "مفارقة الرياضي" ، فإن رياضيي التحمل لديهم عدد كبير من LDs المركزية الأصغر حجما مع معدلات دوران مرتفعة في ألياف النوع الأول (المؤكسد) ، في حين أن مرضى السمنة والسكري لديهم LDs محيطية أكبر مع معدلات دوران منخفضة في ألياف النوع الثاني (السكري)⁸،^15،16. بالإضافة إلى دورها في تخزين الطاقة وإطلاقها ، يمكن أن تعمل LDs عبر الأحماض الدهنية المشتقة (FA) وبروتين المعطف (perilipin 5) أيضا كلاعبين حاسمين يشاركون في التنظيم النسخي لأكسدة FA والتكوين الحيوي للميتوكوندريا⁸. بسبب آثارها الحاسمة في علم وظائف الأعضاء والفيزيولوجيا المرضية ، هناك ما يبرر إجراء دراسات متعمقة حول ديناميكيات ووظائف LDs.

على الرغم من وجود العديد من التقنيات لدراسة IMCLs ، إلا أنها ليست جميعها مناسبة لتحديد حجم LD وكثافته وتوزيعه بدقة بطريقة خاصة بالألياف. على سبيل المثال ، يوفر تقييم IMCLs بواسطة التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي ، على الرغم من كونه غير غازي ، مستوى من الدقة لا يكفي لدراسة حجم LDs وموقعها الدقيق داخل الألياف ، وليس من نوع الألياف المحدد^17,18. وبالمثل ، لا يمكن للتقنيات الكيميائية الحيوية التي يتم إجراؤها على متجانسات العضلات بأكملها¹⁹ تقييم موقع وحجم الدهون. وبالتالي ، فإن الطريقة الأكثر ملاءمة لتحليل مورفولوجيا LD وموقعها هي المجهر الإلكتروني للإرسال الكمي¹³ ، ولكن هذه التقنية مكلفة وتستغرق وقتا طويلا. لذلك ، برز التصوير الفلوري البؤري على المستحضرات ذات الأصباغ مثل Oil Red O (ORO) 20,21 أو monodansylpentane (MDH)²² أو Bodipy ^23,24,25 كأفضل أداة لهذه الدراسات.

هنا ، يتم وصف بروتوكول كامل ، بما في ذلك أخذ عينات الأنسجة ومعالجتها ، وتلطيخ Bodipy ، والحصول على الصور البؤرية وتحليلها لتحديد حجم LD وعددها وتوطينها في عمليات تبريد عضلات الفأر. نظرا لأن IMCLs لا يتم توزيعها بالتساوي بين الألياف المؤكسدة وتحلل السكر ، وينظم كل نوع من أنواع الألياف ديناميكيات LD بشكل مختلف ، يجب أن تكون دراسة IMCLs محددة من نوع الألياف ^16,25,26,27. لذلك ، يستخدم هذا البروتوكول التألق المناعي على الأقسام التسلسلية لتحديد متساوي (أشكال) سلسلة الميوسين الثقيلة (MyHC) التي تعبر عنها كل ألياف. ميزة أخرى لهذا البروتوكول هي المعالجة المتزامنة ل glycolytic (الباسطة digitorum longus ، EDL) وعضلة مؤكسدة (وحيد) موضوعة جنبا إلى جنب قبل التجميد (الشكل 1). هذه المعالجة المتزامنة لا توفر الوقت فحسب ، بل تتجنب أيضا التباين بسبب المعالجة المنفصلة للعينات.

الشكل 1: نظرة عامة تخطيطية على الإجراء. بعد تشريح العضلات (1) ، يتم تحضير العضلات المختارة ذات الحجم المماثل وتجميدها معا (2). يتم الحصول على مقاطع عرضية تسلسلية من 10 ميكرومتر باستخدام cryostat ومثبتة مباشرة على شرائح الالتصاق (3). من شريحتين تسلسليتين ، الأولى (4A) مناعية للأمينين وملطخة ب Bodipy للتعرف على LDs والثانية (4B) ملطخة بالمناعة بالأجسام المضادة ضد MyHCs للتعرف على أنواع الألياف العضلية. يتم الحصول على الصور باستخدام مجهر متحد البؤرة ل Bodipy (5A) ومجهر epifluorescence لأنواع ألياف العضلات (5B). يتم تحليل الصور في فيجي من خلال تطبيق عتبة وتحديد كمية الجسيمات (6A) للحصول على العدد ومتوسط الحجم والكثافة والنسبة المئوية من المساحة الإجمالية التي تشغلها LDs (7) أو خلايا العد (6B) للحصول على النسبة المئوية للألياف من كل نوع في القسم (7). الاختصارات: LDs = قطرات الدهون. EDL = الباسطة الرقمية طويلة ؛ MyHCs = الميوسين سلسلة متساوية الثقيلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي أجريت على الفئران من قبل اللجنة الأخلاقية للتجارب على الحيوانات من القطاع الطبي في الجامعة الكاثوليكية في لوفان (2019/UCL/MD/013).

1. تشريح وإعداد العينات للتجميد

1. ضع علامة على قطعة من الفلين بسماكة 3 مم لكل زوج من العضلات.
2. من خلال شق صغير مصنوع من شفرة في وسط الفلين ، أدخل بشكل عمودي قطعة مستطيلة من البلاستيك الصلب (0.5 سم عرض ، 1 سم ارتفاع) ستكون بمثابة دعم (الشكل 2B).
   ملاحظة: يعتمد حجم القطعة البلاستيكية المستطيلة على حجم العضلات. هنا ، يتم تكييف الأبعاد الموصوفة مع حجم النعل (~ 9 ملغ ، 1 سم لتر ، 2-3 مم عرض) و EDL (~ 5 ملغ ، 1 سم لتر ، 2-3 مم عرض) من فأر ذكر C57BL / 6J عمره 3 أشهر.
3. في وقت التشريح ، قم بإزالة النعل و EDL من الطرف الخلفي للماوس. لمنع العينات من الجفاف أثناء التشريح ، ضعها على ضغط مبلل قليلا بمحلول ملحي في طبق بتري يوضع على الثلج.
   ملاحظة: انظر Wang et ^al.28 للحصول على تفسيرات حول كيفية تشريح هاتين العضلتين الطرفيتين.
4. ضع قطرة صغيرة من مركب درجة حرارة القطع الأمثل (OCT) عند تقاطع الفلين / البلاستيك ، وتجنب فقاعات الهواء.
5. تخلص من الرطوبة الزائدة من العينات عن طريق تجفيفها بلطف بمنشفة ورقية (الشكل 2A) ووضع كلتا العضلتين على البلاستيك عموديا على الفلين (الشكل 2C).
6. تحقق من اتجاه الألياف العضلية العضلية تحت مجهر ستيريو (الشكل 2D).
   ملاحظة: من المهم عدم تغطية العضلات ب OCT ، لأن تأثيرها العازل سيمنع التجميد السريع وسينتج عنه قطع أثرية مجمدة.

2. تجميد عينات العضلات الهيكلية للاستئصال بالتبريد

تحذير: يجب أن يتم تجميد العضلات تحت غطاء كيميائي ، وارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (انظر جدول المواد).

1. استخدم بهلوان من الفولاذ المقاوم للصدأ (~ 8 سم ارتفاع ، 6 سم Ø) مع شريطين جانبيين متصلين به بطول 25 سم على الأقل (الشكل 2F) ، واملأ البهلوان حتى 2/3 من سعته بالأيزوبنتان.
2. أمسك البهلوان من الأشرطة ، واغمره بلطف في صندوق بوليسترين مملوء بالنيتروجين السائل بحيث يكون مستوى النيتروجين خارج الحاوية أعلى من مستوى الأيزوبنتان في الداخل (الشكل 2F ، G).
   تنبيه: عندما يتلامس البهلوان مع النيتروجين ، قد تتسبب الصدمة الحرارية في الدوران. تأكد من أن البهلوان مغمور بما فيه الكفاية ولكن تجنب دخول النيتروجين لأن هذا من شأنه أن يسبب هطول الأمطار isopentane. إذا حدث هذا ، دع الأيزوبنتان يبرد ، واملأ البهلوان بالأيزوبنتان الجديد وابدأ من جديد.
3. عندما يكون الجزء الداخلي من البهلوان مغطى بالكامل بطبقة صلبة بيضاء من الأيزوبنتان ، أخرجه من صندوق النيتروجين السائل (الشكل 2H).
   ملاحظة: درجة حرارة انصهار الأيزوبنتان هي -159 درجة مئوية ، وسوف تتحول حواف البهلوان إلى اللون الأبيض عندما يكون الجو باردا بما فيه الكفاية.
4. حرك بلطف قطع الأيزوبنتان الصلبة في الأيزوبنتان السائل المتبقي مع ملقط حتى يصبح الحجم بأكمله سائلا مرة أخرى.
5. أعد غمر البهلوان في النيتروجين السائل حتى يشكل الأيزوبنتان حصى بيضاء في جميع أنحاء الجزء السفلي وحواف البهلوان (الشكل 2G ، H).
   ملاحظة: تضمن خطوة التبريد الثانية هذه درجة حرارة التجميد المناسبة للأيزوبنتان.
6. قم بإزالة البهلوان من النيتروجين السائل وقم بغمس العضلات بسرعة في الجزء السفلي من البهلوان ، مع الاحتفاظ بالفلين باستخدام ملاقط أسنان الفئران. قم بتدوير الفلين لمدة 15 ثانية في الأيزوبنتان وخزنه عند -80 درجة مئوية حتى المعالجة (الشكل 2I).
   ملاحظة: بالنسبة للتخزين على المدى القصير ، يمكن الاحتفاظ بالعينات في ثلاجة -20 درجة مئوية. تم بالفعل نشر البروتوكول الكامل للتجميد السريع للعضلات الهيكلية في مكان آخر. للاطلاع على المراجع التفصيلية واستكشاف الأخطاء وإصلاحها، انظر: Meng et ^al.29, Kumar et al.30, and Leiva-Cepas et ^al.31.

3. التقسيم بالتبريد

1. أحضر العينات إلى حجرة كريوستات تم تبريدها مسبقا إلى -20 درجة مئوية وضبطت درجة حرارة الشفرة على -25 درجة مئوية.
   ملاحظة: انقل العينات من الفريزر -20 درجة مئوية/-80 درجة مئوية إلى كريوستات في صندوق بوليسترين مملوء بالثلج الجاف واسمح للعينات بالتوازن لمدة 20-30 دقيقة على الأقل إلى درجة حرارة الغرفة قبل القطع.
2. قم بإزالة البلاستيك من الفلين باستخدام ملاقط دقيقة وضع قرص عينة cryostat على لوحة التجميد السريع ليبرد. بمجرد أن تصل اللوحة إلى -50 درجة مئوية ، ضع بعض OCT على القرص وضع الفلين بسرعة أعلى القرص ، مع الضغط بإحكام. انتظر حتى يتصلب OCT ويتم تثبيت الفلين جيدا على القرص.
3. ضع القرص على رأس الكائن في اتجاه القطع المطلوب (الشكل 2J ، K) وقم بتقليم كتلة العضلات إلى ما بعد 1/3 على الأقل من طول العضلات وحتى يصبح كلا المقطعين العرضيين للعضلات مرئيين.
4. اضبط سمك القطع على 10 ميكرومتر وضع قسم واحد على شريحة التصاق للتحقق من الاتجاه الصحيح للألياف على مجهر ساطع.
   ملاحظة: يعد التحقق من الاتجاه العرضي للألياف أمرا بالغ الأهمية. إذا لم تكن الألياف موجهة بشكل كاف ، فاضبط زاوية رأس الكائن ، وقطع قسم آخر وتحقق مرة أخرى.
5. ضع مقطعين عرضيين تسلسليين على شريحتين للالتصاق مصنفتين مسبقا: شريحة واحدة لتحديد أنواع الألياف ، والأخرى لتحديد محتوى الدهون (الشكل 2L).
   ملاحظة: يمكن الحصول على مقاطع عرضية تسلسلية إضافية والاحتفاظ بها عند -80 درجة مئوية للدراسات النسيجية الأخرى. ومع ذلك ، لتجنب تغيير محتوى الدهون والتشكل داخل الخلايا²⁴ ، من الضروري معالجة أول شريحتين مباشرة بعد القطع لمنع تجفيف الهواء. إن تجميد وإذابة الشرائح من أجل تحديد كمية LD سيكون له نفس التأثير وبالتالي فهو غير مستصوب للغاية.

4. كتابة الألياف وتلطيخ Bodipy

1. الكشف عن المناعة النسيجية الكيميائية لنوع الألياف العضلية
   ملاحظة: بالنسبة للبروتوكول التالي ، يكفي حجم محلول إجمالي يبلغ 250 ميكرولتر لتغطية قسم العضلات بأكمله المحاط بدائرة مرسومة بقلم مسعور الحجم التقريبي لعملة 1 سنت.
   1. أحط الأقسام بمخطط مرسوم بقلم مسعور وشطف بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة (RT). ضع الشريحة في غرفة رطبة وكتلة لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية في محلول الحجب (10٪ مصل الماعز العادي (NGS) و 1:30 ماوس على كاشف مانع الماوس (MOM) في PBS).
   2. قم بإزالة محلول الحجب واحتضن الشرائح لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية باستخدام المحلول الذي يحتوي على الأجسام المضادة الأولية (5٪ NGS ، كاشف حجب MOM 1:30 MOM ، الأجسام المضادة الأولية للفأر للتعرف على النوع الأول (IgG2b ، في 1:10) ، النوع IIa (IgG1 ، في 1:10) ، والنوع IIx (IgM ، في 1:5) الألياف والفئران المضادة للصفح (سلسلة α2 ، 1:1,000) في PBS.
   3. اغسل الشرائح باستخدام PBS 3 × 5 دقائق في RT.
   4. احتضان الشرائح في الظلام لمدة ساعة واحدة في RT باستخدام المحلول الذي يحتوي على الأجسام المضادة الثانوية (الماعز المضاد IgG2b AF405 (1:500) ، الماعز المضاد IgG1 AF488 (1:500) ، الماعز المضاد IgM AF568 (1:1000) ، والماعز المضاد للصفيحة AF647 (1:500) في PBS).
      تنبيه: بالنسبة لبقية البروتوكول، تأكد من إبقاء الشرائح بعيدا عن الضوء للحفاظ على التألق.
   5. اغسل مرة أخرى 3 × 5 دقائق في PBS ، واشطف في H₂O مزدوج التقطير ، وأزل الماء الزائد ، وقم بالتركيب باستخدام كاشف مضاد للتلاشي.
      ملاحظة: قم بتخزين الشرائح عند 4 درجات مئوية، محمية من الضوء للحفاظ على التألق حتى الحصول على الصورة. نظرا لأن الشرائح غير ثابتة ، فمن المستحسن استخدام حلول حديثة الصنع لكل تجربة ، وتعقيم PBS ، والحصول على الصور في أقرب وقت ممكن لتجنب تلوث الأقسام.
2. تلطيخ LDs مع Bodipy
   ملاحظة: على غرار الخطوة 4.1.، يكفي حجم محلول إجمالي يبلغ 250 ميكرولتر لتغطية قسم العضلات بأكمله المحاط بدائرة مرسومة بقلم مسعور الحجم التقريبي لعملة معدنية من فئة 1 سنت.
   1. أحط الأقسام بمخطط رسمه قلم مسعور واشطفه بالثلج 0.1 M PBS لمدة 10 دقائق في RT. استخدم PBS البارد المثلج لجميع الشطف والغسيل.
   2. إصلاح مع الباردة 4٪ بارافورمالديهايد (PFA) دون الميثانول لمدة 10 دقائق في RT. بعد الشطف السريع الأول ، اغسل الشرائح باستخدام PBS 3 × 5 دقائق في RT.
      تنبيه: نفذ هذه الخطوة تحت غطاء محرك كيميائي.
   3. ضع الشريحة في غرفة رطبة وكتلة لمدة 1 ساعة في RT مع 5٪ NGS في PBS.
   4. احتضن الشرائح لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية بمحلول الجسم المضاد الأساسي (2٪ NGS والفئران المضادة للأمينين (سلسلة α2 ، 1: 1000) في PBS). اغسل الشرائح باستخدام PBS 3 × 5 دقائق في RT.
      تنبيه: بالنسبة لبقية البروتوكول، تأكد من إبقاء الشرائح بعيدا عن الضوء للحفاظ على التألق.
   5. احتضان لمدة 1 ساعة في RT مع محلول الأجسام المضادة الثانوية التي تحتوي على الماعز المضادة المضادة للفئران AF647 (1:500) في PBS. اغسل الشرائح باستخدام PBS 3 × 5 دقائق في RT.
   6. احتضان لمدة 20 دقيقة في RT بمحلول 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 0.5 μg/mL) وBODIPY (1 ميكروغرام/مل) في PBS.
      ملاحظة: لتحضير محلول المرق BODIPY ، قم بإذابته في DMSO بتركيز 1 ملغ / مل. تتوفر تركيبات Bodipy مختلفة تجاريا لتلطيخ LD. اعتمادا على الاختيار الذي تم إجراؤه ، فإن طريقة التلطيخ هي نفسها (نفس الخطوات والتركيز ووقت الحضانة) ؛ ومع ذلك ، فإن طريقة الاستحواذ ستكون مختلفة قليلا.
   7. بعد الشطف السريع الأول ، اغسل الشرائح باستخدام PBS 3 × 5 دقائق في RT ، واشطفها في H₂O مزدوج التقطير ، وأزل الماء الزائد ، وقم بالتركيب باستخدام كاشف مضاد للتلاشي.
      ملاحظة: قم بتخزين الشرائح عند 4 درجات مئوية، محمية من الضوء، للحفاظ على التألق حتى الحصول على الصورة.

5. الحصول على الصور

ملاحظة: بمجرد الانتهاء من بروتوكولات التلطيخ ، من المهم المتابعة الفورية للحصول على الصور (خلال 24 ساعة التالية) ، ليس فقط لتجنب التلوث ولكن أيضا للحفاظ على مورفولوجيا وحجم وعدد LDs.

1. الحصول على صور لتقييم أنواع الألياف لكل عضلة تم أخذ عينات منها
   ملاحظة: يمكن تحقيق هذه الخطوة باستخدام مجهر المسح الضوئي الفلوري كامل الشريحة أو باستخدام مجهر التألق التقليدي. مع هذا الأخير ، يجب إجراء خياطة يدوية أو آلية للصور لإعادة بناء القسم.
   1. للتعرف على نوع الألياف ، استخدم مجهر epifluorescence مع هدف 10x / 0.3. حدد مرشحات الإثارة ل DAPI (405 نانومتر) و FITC و TRITC و Cy5 للكشف عن ألياف النوع I و IIa و IIx و laminin ، على التوالي.
      ملاحظة: لن تكون الألياف من النوع IIb مناعية. سيتم التعرف عليها على أنها ألياف ملطخة باللامينين على حدود ساركوليما مع ساركوبلازما سوداء.
   2. اضبط وقت التعرض المناسب لكل قناة.
   3. عند استخدام مجهر epifluorescence التقليدي ، احصل دائما على صور العضلة بأكملها باتباع نفس الترتيب لتسهيل إعادة بناء العضلات. تأكد من أن الألياف الموجودة على الحافة اليمنى لصورة واحدة تظهر أيضا على الحافة اليسرى للصورة التالية. وينطبق الشيء نفسه على الأجزاء العلوية والسفلية من الصور (الشكل 3A).
      ملاحظة: كمرجع، بالنسبة لقسم من EDL أو النعل الذي تم تشريحه من فأر عمره 3 أشهر، سيغطي متوسط ست وثماني صور، على التوالي، المقطع العرضي للعضلات بأكمله.
   4. بعد مسح العضلات، قم بتحميل الصور الرقمية الملتقطة في أي برنامج لمعالجة الصور لإعادة الإعمار (الخياطة)، استنادا إلى مورفولوجيا الألياف (laminin) وعلم الأنسجة لقسم العضلات، واحفظها كملف TIFF أو PNG أو JPG مع دمج جميع القنوات (الألوان) (الشكل 3A).
2. الحصول على الصور مع اللامينين و Bodipy تلطيخ مشترك
   ملاحظة: للتعرف على نوع الألياف والحصول على تقدير لعدد الألياف لكل نوع تم التقاطه ، من الضروري إجراء مسح ضوئي لقسم الألياف بالفعل وإعادة بناء العضلات قبل البدء في الحصول على صورة Bodipy-laminin (الشكل 3B).
   1. لمراقبة الصورة واقتنائها من Bodipy، استخدم مجهرا متحد البؤرة مع عدسة هدف غمر الزيت 40x مع فتحة عددية تبلغ 1.4.
   2. استخدم الإعدادات التالية: ثقب عند 1 وحدة فلكية، ودقة 2,048 بكسل × 2,048 بكسل، وحجم البكسل عند 0.08 ميكرومتر، والوضع أحادي الاتجاه، وسرعة المسح الضوئي عند 4 (~4 ميكروثانية/بكسل)، وضبط متوسط الخط على 4x، وضبط التكبير/التصغير الرقمي على 1.
   3. لتجنب الحديث المتبادل بين Bodipy-558/568 و laminin-AF647، استخدم وضع المسح المتسلسل على البرنامج البؤري.
      ملاحظة: عندما تكون الصبغة المختارة هي Bodipy-493/503 ، يكون المسح الضوئي بالليزر البؤري المتزامن ممكنا بدون محادثة متقاطعة بين قناة Bodipy وقناة laminin-AF647. هذا سوف يسرع من الحصول على الصور.
   4. إثارة Bodipy-493/503 باستخدام خط الليزر 488 نانومتر أو خط ليزر الأرجون ، وإثارة Bodipy-555/568 باستخدام خط ليزر الصمام الثنائي 561 نانومتر. أخيرا ، اكتشف laminin-AF647 باستخدام خط ليزر الصمام الثنائي 640 نانومتر.
      تنبيه: ضع في اعتبارك أن جزيئات Bodipy حساسة جدا للتبييض الضوئي ، لذا تجنب المسح الضوئي بالليزر غير الضروري. للتعرف على الألياف ، استخدم الليزر فقط للأمينين.
   5. اعتمادا على الصبغة المختارة ، اضبط نطاقات الانبعاثات على 570-650 نانومتر ل Bodipy-493/503²⁴ وعند 565-620 نانومتر ل Bodipy-558/568. اضبط نطاق انبعاث اللامينين عند 656-700 نانومتر.
   6. اضبط الكسب والكسب الرقمي بشكل مناسب حتى لا يتم اكتشاف وحدات بكسل مشبعة على مؤشر النطاق. قم بتصحيح إشارة الخلفية عن طريق ضبط الإزاحة.
      ملاحظة: يجب تحسين اختيار المرشح ومعلمات المسح الضوئي الأخرى المذكورة أعلاه لكل مجهر متحد البؤرة. من المهم أن تظل جميع الإعدادات المذكورة أعلاه ثابتة لجميع الصور التي تم التقاطها من العينات المراد مقارنتها.
   7. لتحديد نوع الألياف بين تلك التي تم تصورها على المجهر البؤري ، استخدم جهاز كمبيوتر محمول شخصي أعيد بناء صورة القسم عليه بعد فحص الكشف المناعي من نوع الألياف (الشكل 3B).
   8. بمجرد تحديد مجموعة من الألياف بشكل صحيح ، احصل على الصورة باستخدام قنوات Bodipy و laminin.
      ملاحظة: يوصى بتدوين اسم صورة Bodipy-laminin على منطقة العضلات حيث توجد هذه الألياف على الصورة التي تم الحصول عليها للتعرف على MyHC لتسهيل التحليل اللاحق للألياف الخاصة ب LDs.

6. تحليل الصور

1. تحليل أنواع الألياف على كل عينة عضلية
   1. في فيجي (أو ImageJ)³² ، افتح ملف TIFF أو PNG أو JPG مع العضلات المعاد بناؤها التي تم الحصول عليها من دمج جميع القنوات المستخدمة للكشف عن أشكال الألياف.
   2. لبدء أداة عد الخلايا ، انقر فوق المكونات الإضافية | تحليل | | عداد الخلايا عداد الخلايا.
   3. في نافذة عداد الخلايا ، انقر فوق الإجراءات | تهيئة.
   4. ضمن عدادات في نفس النافذة، حدد النوع 1.
   5. في النافذة الرئيسية في فيجي، حدد أداة العصا .
   6. لتحديد عدد الألياف من كل نوع ، انقر فوق كل ألياف من نفس النوع ، بحيث يسجل البرنامج عدد الألياف التي تم النقر عليها.
   7. بمجرد الانتهاء ، حدد النوع التالي من الألياف وكرر نفس الخطوات.
   8. عندما يتم تعيين جميع ألياف الصورة إلى نوع معين من الألياف ، انقر فوق النتائج في نافذة عداد الخلايا لعرض النتائج في جدول.
   9. احفظ هذا الجدول كجدول بيانات بالنقر فوق ملف | حفظ باسم في نافذة النتائج .
   10. احفظ التحديدات وأعد تحميلها على نفس الصورة في أي وقت بالنقر فوق حفظ العلامات أو علامات التحميل، على التوالي، في نافذة عد الخلايا .
2. تحليل قطرات الدهون بطريقة تعتمد على نوع الألياف
   1. تحليل صور Bodipy و laminin التي تم الحصول عليها على البؤرة باستخدام فيجي لتحديد كمية LDs.
      ملاحظة: صمم المؤلفون ماكرو مخصص لأتمتة التحليل. يتوفر هذا الماكرو، إلى جانب شرح خطوة بخطوة حول كيفية استخدامه، كملف تكميلي 1 وملف تكميلي 2، على التوالي.
   2. افتح كل صورة بمساعدة مستورد التنسيقات الحيوية من فيجي. ضمن الخيار عرض المكدس باستخدام ، حدد Hyperstack | وضع اللون، افتراضي. تأكد من تحديد نافذة القياس التلقائي .
      ملاحظة: ستصف الخطوات التالية بروتوكول تحليل ألياف واحدة على الصورة، ولكن يجب تكرارها عدة مرات مثل عدد الألياف الكاملة التي تظهر على الصورة.
   3. استخدم أداة التحديد الحر لتحديد ساركوليما الألياف يدويا استنادا إلى قناة laminin (الشكل 4A) واضغط على T على لوحة المفاتيح لتسجيل التحديد أو منطقة الاهتمام (ROI) في نافذة عائد الاستثمار.
   4. انتقل إلى النافذة الرئيسية في فيجي وانقر على تحليل | اضبط القياسات، وفي النافذة المنبثقة، حدد المنطقة وقطر Feret. اترك المربعات المتبقية دون تحديد والمعلمات الأخرى كما تظهر بشكل افتراضي.
   5. انقر فوق قياس في نافذة عائد الاستثمار للحصول على المساحة وقطر الحد الأدنى من Feret (MF) للألياف المحددة ، وقم بتدوينها لاستخدامها لاحقا.
      ملاحظة: عند تحليل LDs ، من المهم أن تضع في اعتبارك أن حجمها وكثافتها تختلف بين المركز ومحيط الألياف (المنطقة تحت الساركوليمالية-SS). لذلك ، يجب أن يتم التحليل بشكل منفصل.
   6. احسب قيمة 1/6 من MF لتحديد الجزء المركزي من الألياف.
      ملاحظة: في الماكرو، يتم تعيين قيمة MF الافتراضية إلى 6، مما يعني أنه سيتم تعيين التخفيض المطبق ك 1/6 من MF. تم اختيار هذه القيمة بناء على البيانات التجريبية التي تم الحصول عليها من وحيد الحيوانات التي تتغذى على نظام غذائي عالي الدهون. ومع ذلك ، يجب على كل باحث تغيير هذا الرقم بناء على البيانات التجريبية والعضلات التي تم تحليلها ، ونوع الألياف ، وحالة الحيوان.
   7. في نافذة عائد الاستثمار ، انقر فوق إضافة للحصول على نسخة مكررة من عائد الاستثمار الأول وحدد عائد الاستثمار الثاني الذي يظهر على النافذة.
   8. في النافذة الرئيسية لفيجي ، انقر فوق تحرير | | الاختيار قم بتكبير القيمة المحسوبة مسبقا وتقديمها (من الخطوة 6.2.6.) باستخدام علامة ناقص قبل الرقم وانقر فوق موافق. في نافذة عائد الاستثمار، انقر فوق إضافة[t] (يجب أن يظهر عائد استثمار ثالث) وحذف، لحذف عائد الاستثمار الثاني.
      ملاحظة: يمكن للباحث التحقق من النتائج من خلال النقر على المربع إظهار الكل في نافذة عائد الاستثمار . عند هذه النقطة ، يجب أن يظهر عائد استثمار ، أحدهما يحيط بمحيط الألياف بالكامل (الشكل 4B) والآخر يتم وضعه في الوسط (الشكل 4C).
   9. حدد كل من عائد الاستثمار في نافذة عائد الاستثمار وانقر على المزيد من | | XOR إضافة[ر]. انتظر حتى يظهر عائد استثمار ثالث ، والذي يتوافق مع محيط الألياف (الشكل 4D).
   10. احفظ عائد الاستثمار من خلال النقر على مزيد من | حفظ لحفظ عائد الاستثمار في حالة الحاجة إلى إعادة تحليل لاحقة لنفس الألياف.
   11. حدد قناة Bodipy وافتح أداة العتبة بالنقر فوق صورة | ضبط | عتبة على النافذة الرئيسية في فيجي.
   12. في النافذة المنبثقة العتبة ، اضبط القيم على 70/255، وحدد الين | طريقة B&W، وانقر على الخلفية الداكنة | تطبيق.
       ملاحظة: قد تختلف القيم المطبقة على العتبة وفقا لظروف التجربة ويجب تعيين العتبة بشكل مناسب لتحسين التحليل. يجب أن تظهر نافذة B&W التي تحتوي على إشارة Bodipy أعلى من حد العتبة الموضح باللون الأبيض والخلفية باللون الأسود (قارن صورة Bodipy الأصلية في الشكل 4E بالصورة الموجودة في الشكل 4F).
   13. انتقل إلى النافذة الرئيسية في فيجي وانقر على تحليل | قم بتعيين القياسات وفي النافذة المنبثقة، حدد المساحة وجزء المساحة والحد إلى العتبة. اترك المربعات المتبقية دون تحديد والمعلمات الأخرى كما تظهر بشكل افتراضي.
       ملاحظة: إذا أراد الباحث تحليل "دائرية" LDs ، وهو مؤشر للمورفولوجيا الكروية التي تتراوح من 1 للكرة المثالية إلى 0 لخط ، فانقر فوق مربع واصفات الشكل في النافذة المنبثقة مجموعة القياسات .
   14. انتقل إلى نافذة عائد الاستثمار وحدد عائد الاستثمار الأول. في النافذة الرئيسية لفيجي ، انقر فوق تحليل | أداة تحليل الجسيمات.
       ملاحظة: تحدد هذه الأداة عدد المساحة الإجمالية التي تغطيها الجسيمات في كل تحديد وحجمها ومساحتها المغطاة ونسبتها المئوية وتحفظ النتائج كملف جدول بيانات.
   15. اضبط القيم من 2 إلى ما لا نهاية (2-إنفينيتي) في نافذة تحليل الجسيمات، وحدد مربع البيكسلات، واحتفظ بقيم الدائرية الافتراضية، وحدد تلخيص، وانقر فوق موافق.
       ملاحظة: للتحقق من النتائج على الألياف، ضمن الخيار إظهار ، حدد أيا من الخيارات المتاحة. للتعرف على معلومات كل LD على التحديد في جدول، حدد خيار عرض النتائج في نافذة تحليل الجسيمات . يتم حساب متوسط نتائج تحليل المساحة الكلية للألياف وتلخيصها في جدول يحتوي على عدة أعمدة (العد ، المساحة الكلية ، متوسط الحجم ، النسبة المئوية للمساحة ؛ هذه تتوافق مع عدد الجسيمات [LDs] ، المساحة التي تشغلها هذه الجسيمات ، متوسط حجمها ، والنسبة المئوية للمساحة الكلية للاختيار الذي تشغله الجسيمات ، على التوالي). لحساب الكثافة، اقسم عدد الجسيمات على المساحة الإجمالية لكل اختيار.
   16. للحصول على قيم مركز الألياف ومحيطها، كرر الخطوتين 6.2.14 و6.2.15، مع تحديد الثاني (الوسط) والعائد على الاستثمار الثالث (المحيط) في كل مرة.
   17. احفظ النتائج بالنقر فوق ملف | حفظ باسم في نافذة الملخص .
       ملاحظة: قم بتضمين نوع الألياف والحالة واسم الصورة على الاسم المعين للنتائج لتسهيل التوحيد اللاحق والتحليل الإحصائي للبيانات. لتحليل بقية الألياف في نفس الصورة، كرر الخطوات من 6.2.3 إلى 6.2.17. للتحليل الإحصائي ، يجب تحليل ما لا يقل عن 10-15 ألياف من كل نوع لكل.

يوفر البروتوكول الموصوف هنا طريقة فعالة لتحديد كمية LDs بسهولة في نوع الألياف وبطريقة خاصة بالخلايا الفرعية. ويبين كيف أنه من خلال تجميد عضلتين متشابهتين في الحجم، مثل مؤسسة كهرباء لبنان والوحيد، يتم تقليل الوقت والموارد التي تنفق على الخطوات التالية بمقدار النصف.

يتم توفير بروتوكول كامل للتلطيخ المناعي ، والحصول على الصور ، وتحليل الأشكال المختلفة MyHC المعبر عنها في عضلات الفئران البالغة. يعتمد هذا البروتوكول على البروتوكول الذي صممه Schiaffino et al. لأول مرة في عام 1989³³ ، مع بعض التعديلات مثل استخدام جسم مضاد إضافي لتسمية laminin. هذا التعديل اللاحق أمر بالغ الأهمية لموقع ألياف النوع IIb ، والتي ستكون سوداء لأنها ليست ملطخة بأي جسم مضاد. وكما هو مبين في الشكل 5، فإن هذا البروتوكول الكيميائي النسيجي المناعي لا يسمح فقط بالتعرف على ألياف الفئران البطيئة الأكسدة (النوع الأول والثاني أ) والألياف سريعة تحلل السكر (النوع IIx و IIb)، ولكن أيضا بوجود ألياف هجينة (انظر العلامة النجمية في الشكل 5D). علاوة على ذلك ، فإن وجود المقاطع العرضية لكلتا العضلتين على نفس الشريحة يسمح بمقارنة نسب كل نوع من الألياف بين العضلتين المختارتين ، مما يضمن أن الظروف التجريبية كانت متطابقة في كلا القسمين.

بالنسبة لوضع العلامات LD ، تستند النتائج المعروضة هنا إلى استخدام Bodipy-558/568 C₁₂ كصبغة دهنية. ومع ذلك ، تتم إحالة القارئ إلى ورقة بروتوكول ممتازة توضح بالتفصيل استخدام الصبغة الكلاسيكية Bodipy-493/503 على أقسام العضلات²³. جمع البروتوكول المقدم بين تلطيخ LDs على أساس الكيمياء النسيجية المناعية ضد α2-laminin لتمييز ساركوليما الألياف. كما هو الحال مع تجربة نوع الألياف ، هذه الخطوة ضرورية ، ليس فقط للتعرف على الألياف الفردية ، ولكن أيضا للتحليل اللاحق للدهون في كل من المناطق المركزية والطرفية للألياف (الشكل 4). واحدة من الخطوات الحاسمة لهذا البروتوكول هي تحديد ووضع علامات على نفس الألياف على الشريحتين. كما هو موضح من قبل ، من المهم مسح الشريحة بأنواع الألياف وإعادة بناء المقاطع العرضية للعضلات بالألوان المدمجة قبل الحصول على صور ل LDs (الشكل 3B). تعد الهياكل الرائعة لكل قسم عضلي ، مثل أغصان المحور العصبي أو مغزل العضلات ، من المعالم الجيدة التي يمكن أن تساعد الباحث في تحديد موقع نفس الألياف على كلتا الشريحتين (الشكل 6). تذكر أنه نظرا لأن الشريحة توضع رأسا على عقب على معظم المجاهر البؤرية ، فمن المستحسن عكس الصورة المعاد بناؤها من نوع الألياف على الكمبيوتر الشخصي لتسهيل مهمة الموقع.

تسمح الإعدادات الموصوفة للحصول على تلطيخ Bodipy-laminin بواسطة المجهر البؤري بالتصور والتحليل اللاحق لحجم وعدد وتوزيع LDs من ثلاثة إلى ستة ألياف في وقت واحد (الشكل 6 والشكل 7). كما يتم توفير بروتوكول مفصل خطوة بخطوة لتحليل LDs باستخدام برنامج تحليل الصور فيجي هنا. كما هو موضح في البروتوكول ، فإن التحليل الكامل لكل من الألياف الموجودة على الصورة طويل وممل. ومع ذلك ، تتمتع فيجي بميزة السماح بتصميم برامج مخصصة ، تسمى وحدات الماكرو ، استنادا إلى لغة جافا. صمم المؤلفون ماكرو يتيح أتمتة سلسلة الأوامر الفردية الموضحة أعلاه والتي يتم تشغيلها تلقائيا في حلقة لتحليلها في بضع دقائق - ليس فقط كل من الألياف الموجودة على صورة ولكن أيضا مجموعة كبيرة من الصور. المدخلات الوحيدة من الباحث هي الاختيار اليدوي لمحيط الألياف المراد تحليلها في كل مرة ، واختيار نوع الألياف ، والفحص البصري للصورة الناتجة بعد تطبيق العتبة وتحديد كمية الجسيمات.

هنا ، يتم تنفيذ تحليل LDs بطريقة تعتمد على الموقع. من خلال قياس المساحة وقطر MF للألياف سابقا ، يتم تطبيق تقليل يعتمد على الحجم (غير ثابت كما هو موضح من قبل Strauss et ^al.25) للحصول على المناطق المركزية والطرفية لكل ألياف (الشكل 4 والشكل 7). وكما هو مبين في المدرج التكراري للشكل 7، تسمح هذه الطريقة بالتحديد الكمي لثلاثة بارامترات هامة: النسبة المئوية لمساحة الألياف التي تشغلها LDs (الشكل 7E)، وكثافة LDs - عدد LDs لكل ميكرومتر² (الشكل 7F)، ومتوسط حجم LDs (الشكل 7G). ونتيجة لذلك، في الفئران البالغة من العمر 3 أشهر (N = 5)، تمثل ألياف النوع IIa (المخطط الأخضر) والنوع IIx (المخطط الأحمر) أكبر نسبة من المساحة التي تشغلها LDs في المحيط (الشكل 7E). وفيما يتعلق بكثافة الجسيمات، تظهر ألياف EDL دائما كثافة أعلى من الألياف المنفردة بشكل مستقل عن الموقع دون الخلوي (الشكل 7F). وأخيرا، فإن متوسط حجم هذه ال LDs يكون دائما أكبر في المحيط منه في الوسط (الشكل 7G).

الطرق المختلفة التي تستخدمها المجموعات الأخرى لتقييم تراكم LDs في العضلات الهيكلية للقوارض^34,35 تجعل من الصعب مقارنة هذه النتائج مع تلك الموجودة في الدراسات السابقة. ومع ذلك، وتمشيا مع النتائج المستخلصة من Komiya et ^al.34، فإن النسبة المئوية لمساحة الألياف التي تشغلها LDs أعلى في ألياف النوع IIa و EDL من النوع IIx. والأهم من ذلك، أن الألياف من النوع IIb تمثل أدنى نسبة مئوية من المساحة التي تشغلها LDs (الشكل 7E، المدرج التكراري الرمادي). نظرا لأن الألياف من النوع IIb هو أكثر أنواع الألياف شيوعا في EDL (75٪ ، الشكل 5E) ، فإن هذه النتائج تؤكد ما وصفته المجموعات الأخرى سابقا: التراكم الكلي للدهون أقل في EDL منه في النعل^34,35.

على عكس ما تم وصفه في البشر²⁵ ، وأيضا تمشيا مع نتائج Komiya et ^al.34 ، تظهر النتائج المعروضة هنا أن تراكم LDs في ألياف النوع الأول المنفرد منخفض نسبيا. يمكن تفسير ذلك من خلال الاختلافات بين الأنواع من نوع الألياف بين الفئران والبشر³⁶ ، لأن الخصائص الأيضية للألياف البشرية من النوع الأول تشبه إلى حد كبير خصائص القوارض من النوع IIa و IIx ، في حين أن خصائص ألياف النوع IIx البشرية قريبة من القوارض من النوع IIb³⁷. باختصار ، توفر التقنيات المختلفة الموضحة هنا طريقة قابلة للتكرار وموثوقة وفعالة من حيث الوقت لدراسة ومقارنة العديد من المعلمات المتعلقة ب LDs وتوزيعها داخل الخلية بطريقة تعتمد على نوع الألياف.

تجارب دون المستوى الأمثل
إذا لم يتم تنفيذ إجراء التجميد بشكل صحيح ولم يكن الأيزوبنتان في درجة الحرارة المناسبة ، فسوف تتشكل بلورات الجليد داخل الألياف (الشكل 8A). لا يمكن اكتشاف هذه القطع الأثرية المتجمدة إلا بعد التحضير النسيجي للعينة ويمكن التعرف عليها كثقوب في الألياف. من أجل تحديد كمي مناسب ل LDs ، يجب تجنب هذه القطع الأثرية. وقد ثبت أن إذابة وإعادة تجميد كتلة العضلات بشكل مناسب يمكن أن تقلل بشكل كبير من هذه القطع الأثرية²⁹.

تصادف مشكلة أخرى عندما لا يتم قطع الألياف عموديا على المحور الطولي (الشكل 8B). لا يمكن إجراء قياس LD الكمي والمقارنة بين الألياف أو العضلات أو الحيوانات عندما لا تكون الأقسام مستعرضة. لهذا السبب ، من الضروري وضع العضلات بشكل صحيح على الفلين بمساعدة مجهر ستيريو قبل التجميد والحصول على مجهر ساطع بالقرب من cryostat. سيسمح هذا الأخير للباحث بالعثور على المحاذاة الصحيحة للعينة على cryostat.

في بعض الحالات النادرة ، يكون وضع العلامات على أشكال MyHC ضعيفا جدا على نوع واحد أو أكثر من الألياف (الشكل 8C). إذا حدث هذا ، فسيكون تحليل LDs غير مكتمل. في هذه الحالة ، يجب تكرار التجربة بدءا من قطع العضلات. وأخيرا، يمكن أن يتراكم بوديبي في محيط المقطع العرضي للعضلات (الشكل 8D). إذا حدث هذا ، فسيكون التلطيخ قويا جدا على تلك الألياف مما ينتج عنه نتيجة مصطنعة. تجنب الحصول على الصور من هذه الألياف.

الشكل 2: إعداد العينات للتجميد والتقسيم بالتبريد. (A-D) يتم تشريح عضلات الماوس وعضلات EDL ووضعها على الفلين الذي يحمله البلاستيك الصلب مع قطرة من OCT. (E-G) يتم ملء بهلوان الفولاذ المقاوم للصدأ مع الأيزوبنتان وتبريده إلى درجة حرارة انصهاره في النيتروجين السائل. (H,I) يتم إخراج البهلوان مع الأيزوبنتان البارد من النيتروجين السائل ، ويتم غمر العينة حتى أسفل البهلوان ، وتدور لمدة 15 ثانية. (J-L) يتم وضع الفلين مع العينات على قرص حامل cryostat بدون دعم بلاستيكي ، ويتم تثبيت المقاطع العرضية التسلسلية من 10 ميكرومتر مباشرة على شرائح الالتصاق. تتم معالجة مقطعين عرضيين تسلسليين متجاورين على الفور لتلطيخ LDs والكشف عن MyHCs. الاختصارات: LDs = قطرات الدهون. EDL = الباسطة الرقمية طويلة ؛ MyHCs = الميوسين سلسلة متساوية السلسلة الثقيلة; OCT = درجة حرارة القطع المثلى. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: الحصول على صورة Bodipy بعد تحديد نوع الألياف من الصورة المركبة المعاد بناؤها التي شوهدت على كمبيوتر آخر. (أ) إعادة بناء قسم النعل بأكمله المناعي لنوع الألياف (MyHCs) من سبع صور مدمجة مستقلة (مستطيلات متقطعة) مخيطة معا باستخدام برنامج معالجة الصور. تمثل الأسهم البيضاء والأرقام الترتيب المتبع أثناء التقاط الصور باستخدام مجهر epifluorescence التقليدي. (ب) للحصول على صورة بوديبي، (1) يتم تصور حقل يحتوي على قسم العضلات الملطخ بالمناعة باستخدام laminin-AF647 و Bodipy-555/568 على شاشة جهاز كمبيوتر متصل بالمجهر البؤري. (2) توجد هذه الألياف على الصورة المعاد بناؤها لقسم العضلات المناعي للكشف عن نوع الألياف (MyHCs). (3) يتم الحصول على الصورة باستخدام المجهر البؤري. الاختصارات: LDs = قطرات الدهون. DAPI = 4',6-دياميدينو-2-فينيليندول; MyHCs = الميوسين سلسلة متساوية الثقيلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: تحليل قطرات الدهون مع فيجي. (أ ، ب) يتم التعرف على ساركوليما الألياف بناء على صورة اللامينين واختيارها كعائد استثمار. يتم قياس المساحة الإجمالية و MF. (ج) للتعرف على الجزء المركزي من الألياف ، يتم تقليل الاختيار بمقدار 1/6 من قيمة MF. (د) يتم تعيين المنطقة الواقعة بين الاختيار المركزي والكلي على أنها محيط أو منطقة تحت الساركوليمال. (ه) لتحليل LDs الملطخة ب Bodipy ، يتم تطبيق عتبة ، (F) وتستخدم أداة تحليل الجسيمات لتحديد كمي المعلمات المختلفة المتعلقة ب LDs (انظر الجدول). يتم الحصول على هذه القيم للألياف الكاملة (الكل) ، للجزء المركزي (المركز) ، وللمنطقة تحت الساركوليمالية (المحيط) ، بشكل مستقل. أشرطة المقياس = 12 ميكرومتر. الاختصارات: LDs = قطرات الدهون. عائد الاستثمار = منطقة الاهتمام؛ MF = الحد الأدنى من قطر فيريت. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: التلطيخ المناعي التمثيلي لأنواع الألياف في EDL (تحلل السكر) ووحيد (مؤكسد) عضلة الفأر. تم الحصول على صور التألق المدمجة ل EDL (A ، B) والنعل (C ، D) باستخدام مجهر فلوري رقمي كامل الشريحة. تم استخدام الأجسام المضادة ضد النوع الأول (أزرق-AF405) ، والنوع IIa (أخضر-AF488) ، والنوع IIx (أحمر-AF568) ، ولامينين (أبيض-AF647). الألياف السوداء تتوافق مع الألياف من النوع IIb. يعرض B و D تفاصيل الألياف داخل المستطيلات البيضاء للألواح A و C ، على التوالي. تظهر العلامة النجمية (*) في اللوحة D ألياف IIa/IIx هجينة. (E,F) تقدير كمي تمثيلي لتوزيع نوع الألياف في EDL و soleus من الفئران البالغة من العمر 3 أشهر (N = 5). كانت EDL تتكون بشكل أساسي من ألياف النوع IIb ، ثم IIx ، و IIa (~ 75٪ و 15٪ و 5٪ على التوالي). على النقيض من ذلك ، كان النعل يتكون أساسا من النوع IIa (>50٪) وألياف النوع الأول (30٪). كانت نسب ألياف النوع IIx متشابهة إلى حد ما في كلتا العضلتين ، في حين أن نسب الألياف الهجينة كانت منخفضة للغاية. أشرطة المقياس = 200 ميكرومتر (A,C)، 100 ميكرومتر (B,D). اختصار: EDL = الباسطة الرقمية longus. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: تلطيخ تمثيلي ل LDs مع Bodipy على مقاطع عرضية تسلسلية تم تصنيفها سابقا على أنها مناعية لأشكال MyHC المتساوية. دمج التألق صورا للفأر EDL (A) و soleus (B) تم الحصول عليها باستخدام مجهر epifluorescence يظهر ألياف من النوع الأول (الأزرق) و IIa (الأخضر) و IIx (الأحمر) و IIb (الأسود) و laminin (الإشارة البيضاء المحيطة بالألياف). (C-F) صور التألق البؤري من EDL (C ، D) والنعل (E ، F) التي تحمل علامة مشتركة مع laminin (سماوي) و Bodipy (أحمر). لاحظ أن الألياف الموضحة في C-F هي نفسها الموجودة داخل المستطيلات البيضاء على اللوحتين A و B. في الزاوية اليمنى من المستطيل الأبيض في A ، يمكن تمييز غصن محوري (رأس سهم أبيض). أشرطة المقياس = 200 ميكرومتر (A,B), 20 ميكرومتر (C-F). الاختصارات: LDs = قطرات الدهون. EDL = الباسطة الرقمية طويلة ؛ MyHCs = الميوسين سلسلة متساوية الثقيلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 7: التحديد الكمي ل LDs بطريقة خاصة بالألياف وتحت الخلوية. صور متحدة البؤرة التألق التمثيلية لألياف النوع الأول والنوع IIa من ألياف النعل (A و B) والنوع IIx وألياف النوع IIb من EDL (C ، D) التي تم الحصول عليها بعد وضع العلامات المشتركة مع Bodipy (الأحمر) و α2-laminin (غير المعروض). تم تحليل محتوى LD (٪ من المساحة التي يشغلها Bodipy والكثافة) والمورفولوجيا (الحجم) بطريقة خاصة دون الخلوية. تم تحديد محيط الألياف عن طريق تلطيخ اللامينين وتم تعيين المناطق المركزية أو الطرفية بناء على قطر MF. النسبة المئوية لمساحة الألياف التي يشغلها Bodipy (LDs) (E) أو كثافة LD (العدد / μm²) (F) أو متوسط حجم LD (G) في المناطق الوسطى أو الطرفية لكل نوع من أنواع الألياف. يتم تمثيل النتائج كمتوسط ± SEM. أشرطة المقياس = 10 ميكرومتر. الاختصارات: LDs = قطرات الدهون. EDL = الباسطة الرقمية طويلة ؛ C = مركزي; P = الطرفية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 8: الصور المقابلة للنتائج دون المستوى الأمثل . (أ) صورة برايت فيلد للمقطع العرضي للعضلات الملطخة بالهيماتوكسيلين-إيوسين تظهر بلورات الجليد التي تشكلت أثناء عملية التجميد. (ب) صورة مدمجة للتألق لمقطع نعل ملطخ بالمناعة ل MyHCs و laminin ، مما يدل على أن غالبية الألياف مقطوعة على طول المحور الطولي. (ج) صورة فلورية لقسم EDL ملطخ بالمناعة ل MyHCs و laminin. يعيق التلطيخ الضعيف للألياف من النوع IIa (الأخضر) التحديد الكمي الصحيح لكل نوع من أنواع الألياف. (د) صورة متحدة البؤرة تظهر تلطيخا مصطنعا قويا للبوديبي (الأحمر) على الألياف الموجودة في محيط المقطع العرضي للعضلات. أشرطة المقياس = 50 ميكرومتر (A,B)، 200 ميكرومتر (C,D). الاختصارات: EDL = الباسطة الرقمية longus; MyHCs = الميوسين سلسلة متساوية الثقيلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي S1: تلطيخ LD بالزيت الأحمر O على المقاطع العرضية للعضلات. (أ، ب) صور متحدة البؤرة تظهر نمط التلطيخ الذي تم الحصول عليه باستخدام Oil Red O في النعل و EDL ، على التوالي. تم وصف البروتوكول المستخدم في هذا التلطيخ بالتفصيل بواسطة Prats et ^al.24. لاحظ أن تراكم LDs أعلى في المنطقة تحت الساركوليمالية من الألياف العضلية ، كما هو موضح سابقا ل Bodipy. أشرطة المقياس = 20 ميكرومتر. الاختصارات: LD = قطرة الدهون. EDL = الباسطة الرقمية الطويلة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S2: تلطيخ مشترك ل LDs والميتوكوندريا في العضلة الوحيدة. (أ) صورة مدمجة متحدة البؤرة تظهر الوسم المناعي ل Tomm20 ، وهو بروتين موجود على غشاء الميتوكوندريا (أخضر) ، DAPI (أزرق) ، و Bodipy-558/568 المسمى LDs (أحمر). يظهر الجزء الداخلي في A العديد من الميتوكوندريا (الخضراء) المرتبطة ب LDs (الحمراء). تم الحصول على هذه الصورة عن طريق تطبيق المجهر فائق الدقة البؤري Airysscan. (ب، ج) الصور المقابلة أحادية القناة ل LDs والميتوكوندريا ، على التوالي. أشرطة المقياس = 10 ميكرومتر (A-C) ، 5 ميكرومتر (A ، داخلي). الاختصارات: LDs = قطرات الدهون. DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 1: فيجي الماكرو للتحليل الآلي ل LDs على صور laminin + Bodipy متعددة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: شرح خطوة بخطوة لكيفية العمل مع الماكرو Bodipy_JoVE.ijm. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

يصف البروتوكول المفصل هنا طريقة فعالة لقياس LDs الموسومة ب Bodipy على أساس نوع الألياف وتحت الخلوية. في السنوات الأخيرة ، تم استبدال الأصباغ الدهنية الكلاسيكية ، مثل ORO أو Sudan Black B ، بمجموعة جديدة من الأصباغ الفلورية النفاذة للخلايا والمحبة للدهون التي ترتبط بالدهون المحايدة (على سبيل المثال ، Bodipy). متوفر كمترافقات مختلفة ، وقد أثبت Bodipy فعاليته الكبيرة في وضع علامات LDs لدراسة مورفولوجيتها وديناميكياتها وتفاعلها مع العضيات الأخرى ، ليس فقط في الأنسجة والخلايا الثابتة المختلفة 23,38,39,40 ولكن أيضا في الخلايا الحية ^41,42.

ضمن البروتوكول ، هناك العديد من الجوانب الحرجة التي يجب على الباحث مراعاتها للحصول على أفضل النتائج. من الضروري وضع العضلات المختارة بشكل صحيح على الفلين لضمان المحاذاة المثالية وتوجيه الألياف العضلية العضلية ، لأنه بمجرد تجميدها ، لا يمكن إجراء سوى تعديلات طفيفة على الحامل على cryostat. علاوة على ذلك ، من الأهمية بمكان بدء بروتوكول التلطيخ المناعي مباشرة بعد قطع الأقسام ، لأن المقاطع المبردة لتجفيف الهواء (لمدة 15 دقيقة فقط) لها آثار ضارة شديدة على LDs ، مما يؤدي إلى انخفاض بنسبة 66٪ في كثافة LD وانخفاض بنسبة 37٪ في متوسط الحجم²⁴. وبالمثل ، فإن تجميد الشرائح وإذابتها سيكون له آثار ضارة وبالتالي لا ينصح به. وتتعلق ميزة ثالثة هامة لهذا البروتوكول بتثبيت العينات. لتحديد الأشكال المختلفة ل MyHC مع الأجسام المضادة المذكورة هنا ، يجب تجنب تثبيت الأنسجة لأنه يعطل ارتباط الأجسام المضادة المختارة بظهارتها. إذا تم إصلاح عينات العضلات مسبقا ، تتم إحالة القارئ إلى ورقة نشرت مؤخرا باستخدام أجسام مضادة مختلفة⁴³. يوصى فقط PFA بدون ميثانول لوضع العلامات والقياس الكمي ل LDs ، لأن استخدام الميثانول أو الأسيتون يعطل مورفولوجيا LDs^23,44. علاوة على ذلك ، فإن خطوة النفاذية ليست ضرورية لتحديد كمية LDs على الشرائح المناعية مع laminin. نظرا لأن بعض المجموعات أظهرت أن النفاذية باستخدام المنظفات مثل TritonX-100 أو الصابونين أو الجلايسين يمكن أن تقلل من حجم أو عدد LDs^44,45 ، فإن التخلل محبط للغاية. وأخيرا ، فإن الضبط الدقيق لإعدادات المجهر البؤري أمر بالغ الأهمية للتعرف فقط على الدهون المحايدة الموجودة في LDs وليس تلك الموجودة في أغشية العضيات الأخرى²⁴.

هنا ، تم استخدام Bodipy-558/568 C₁₂ كعلامة LD. ومع ذلك ، فإن Bodipy الأكثر استخداما لوضع علامات LDs ودراسة مورفولوجيتها وموقعها داخل الألياف العضلية للعضلات الهيكلية هو Bodipy-493/503. تتشابه كلتا الصبغتين في وقت حضانتهما ، وتركيز العمل ، وأطياف انبعاثاتهما الضيقة ، على الرغم من أن نطاقات الإثارة والانبعاثات الخاصة بهما مختلفة قليلا. للحصول على بروتوكول كامل حول استخدام Bodipy-493/503 ، تتم إحالة القارئ إلى عمل Listenberger و Brown⁴⁶ أو Spangenburg et ^al.23. تم استخدام Bodipy-558/568 C₁₂ لتلطيخ LDs في أنسجة أخرى مثل الأنسجة الدهنية 47 أو الشبكية المتدهورة⁴⁸ أو الكلى الليفية⁴⁹ أو الخلايا الليفية⁵⁰. ينتج عن هذا Bodipy تلطيخ مماثل لتلك التي تم الحصول عليها باستخدام ORO (انظر الشكل التكميلي S1) ولكن مع عبء تقني أقل بكثير وأكثر خصوصية^24,51. وعلاوة على ذلك، فإن Bodipy-558/568 C 12 يتمتع بميزة التمكين من التحديد الكمي للمركبات منخفضة التكلفة بالاقتران مع الكشف عن البروتينات أو العضيات الموسومة بجسم مضاد ثانوي أخضر الطيف (انظر الشكل التكميلي S2 ويان ^{وآخرون.49}) أو مع النماذج المعدلة وراثيا^{GFP 52}. هذان التطبيقان هما أداتان قويتان جدا لكشف ديناميكيات وتفاعلات LDs مع عضيات الخلايا والبروتينات الأخرى. ومع ذلك ، عندما لا يقصد وضع العلامات المشتركة للبروتينات داخل الخلايا ، يوصي المؤلفون باستخدام صبغة LD Bodipy-493/503 الأكثر تميزا.

يرتبط أحد قيود هذا البروتوكول بالحصول على الصور وتحديد الخصائص المورفولوجية LD. أدى التقدم التكنولوجي في مجهر المسح الضوئي بالليزر البؤري إلى تحسين دقة الطائرة بشكل كبير مقارنة بالمجاهر واسعة المجال والسماح بإعادة بناء 3D للأجسام عند مسح العينة في المستوى Z. كان هذا مفيدا جدا لدراسة مورفولوجيا LD²⁴ والتفاعل مع البروتينات الأخرى في الألياف العضلية الهيكلية ^38,53 ، ولكنه زاد من وقت الحصول على الصور ومعالجتها ، حيث تتكون كل صورة معاد بناؤها^3D من عدة صور ثنائية الأبعاد مستقلة. في البروتوكول أعلاه ، تم الحصول على صور متحدة البؤرة بعدسة موضوعية 40x وفقط في 2D. تسمح هذه الطريقة بالحصول على ثلاثة إلى ستة ألياف عضلية لكل صورة بدلا من واحدة فقط كما هو الحال عند استخدام هدف 63x. وهذا يؤدي إلى دقة أقل وتقدير عام لحجم LD ومورفولوجيا غير دقيق تماما. ومع ذلك ، فإنه يسمح بتحليل عدد أكبر من الألياف لكل عينة ، وهي أيضا حقيقة مهمة يجب مراعاتها ، خاصة في التجارب على الحيوانات ، حيث يجب مقارنة عدد كبير من العضلات والظروف.

هنا ، يظهر أنه من خلال تجميد عضلتين متشابهتين في الحجم متجاورين مع بعضهما البعض³⁴ ، يتم تقليل وقت معالجة العينات بشكل كبير ، ويتم تقليل الاختلافات المصطنعة المحتملة المستمدة من معالجتها المستقلة. علاوة على ذلك ، تأخذ هذه الطريقة في تحليل LDs في الاعتبار الاختلافات بين التوزيع تحت الخلوي ل LDs داخل وبين أنواع الألياف⁵⁴. إن اختيار محيط الألياف العضلية وتقليل هذا الاختيار فيما يتعلق بقطر Minimal Feret للألياف يسهل دراسة حجم وكثافة LDs المركزية والطرفية (تحت الساركولية) بشكل مستقل. تطبيق هذه الطريقة مهم للغاية لأنه ثبت أن التراكم تحت الساركوليمال ل LDs يساهم بشكل مباشر في مقاومة الأنسولين. في حين أن بعض التقارير في البشر قد درست LDs بطريقة تعتمد على نوع الألياف والموقع¹¹،^16،25 ، هذه هي المرة الأولى ، على حد علمنا ^، التي يتم فيها تطبيق هذه الطريقة على العضلات من القوارض. وعلاوة على ذلك، فإن التحديد الكمي للأقل نموا بمساعدة ماكرو مصمم ذاتيا لفيجي قلل كثيرا من وقت تحليل الصور وبسطه. يتوفر كل من الماكرو وشرح خطوة بخطوة حول كيفية استخدامه كملف تكميلي 1 وملف تكميلي 2 ، على التوالي.

بشكل عام ، يعتبر المؤلفون أن البروتوكول الموصوف هنا يمكن أن يكون أداة مفيدة للباحثين الآخرين الذين يدرسون استقلاب الدهون في العضلات الهيكلية. يمكن تطبيق التقنيات الموضحة على عضلات مختلفة وفي ظل ظروف متميزة (الصيام / الإفراط في التغذية ، والتدريب / المستقرة ، والشباب / المسنين ، والهزيل / السمنة) ونأمل أن تساعد على فهم أفضل لديناميكيات LDs ، وأهمية تفاعلاتها مع المكونات الأخرى للخلية ، وكيفية تخزين الدهون واستقلابها في الألياف المحللة للسكر والتأكسدي ، ودورها في بداية مقاومة الأنسولين في مرض السكري من النوع 2.

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان.

تم دعم هذا العمل من خلال منح من الصندوق الوطني للبحوث العلمية (FNRS-Crédit de Recherche J.0022.20) والشركة الفرنكوفونية لديابيت (SFD-Roche Diabetes Care).C.M.S. حاصل على زمالة الدكتوراه من FRIA (FNRS). حصل M.A.D.-L.d.C. على زمالة من برنامج Wallonie-Bruxelles الدولي للتميز.

يشكر المؤلفون أليس مونييه على مساهمتها في تطوير هذا البروتوكول وكارولين بوزين على خبرتها ومساعدتها التقنية في عملية الحصول على الصور. كما نشكر منصة التصوير 2IP-IREC للوصول إلى المجهر والمجاهر (منصة التصوير 2IP-IREC ، معهد البحوث التجريبية والسريرية ، الجامعة الكاثوليكية في لوفان ، 1200 بروكسل ، بلجيكا). وأخيرا، يود المؤلفون أن يشكروا نيكولاس دوبويسون ورومان فيرسيل وميشيل أبو سمرة على النقد البناء للمخطوطة. تم إنشاء بعض أرقام هذه المقالة مع BioRender.com.