Tipo di fibra e analisi subcellulare specifica del contenuto di goccioline lipidiche nel muscolo scheletrico

Prove crescenti indicano che l'eccessiva infiltrazione di lipidi all'interno del muscolo scheletrico provoca lipotossicità e diabete. Qui, presentiamo un protocollo completo, che include l'elaborazione dei tessuti, la colorazione con Bodipy, l'acquisizione di immagini e l'analisi, per quantificare le dimensioni, la densità e la distribuzione subcellulare delle goccioline lipidiche in un modo specifico per il tipo di fibra.

L'infiltrazione lipidica del muscolo scheletrico, nota come miosteatosi, aumenta con l'obesità e l'invecchiamento. La miosteatosi è stata anche recentemente scoperta come fattore prognostico negativo per molti altri disturbi come le malattie cardiovascolari e il cancro. L'eccessiva infiltrazione lipidica diminuisce la massa muscolare e la forza. Si traduce anche in lipotossicità e insulino-resistenza a seconda del contenuto lipidico intramiocellulare totale, della morfologia delle goccioline lipidiche (LD) e della distribuzione subcellulare. Anche il tipo di fibra (ossidativo vs glicolitico) è importante, poiché le fibre ossidative hanno una maggiore capacità di utilizzare i lipidi. A causa delle loro implicazioni cruciali in fisiopatologia, sono giustificati studi approfonditi sulla dinamica e la funzione della LD in un modo specifico per tipo di fibra.

Qui viene presentato un protocollo completo per la quantificazione del contenuto lipidico intramiocellulare e l'analisi della morfologia della LD e della distribuzione subcellulare in modo specifico per tipo di fibra. A tal fine, le criosezioni muscolari seriali sono state colorate con il colorante fluorescente Bodipy e anticorpi contro le isoforme a catena pesante della miosina. Questo protocollo consente l'elaborazione simultanea di diversi muscoli, risparmiando tempo ed evitando possibili artefatti e, grazie a una macro personalizzata creata nelle Fiji, è anche possibile l'automatizzazione dell'analisi LD.

L'infiltrazione lipidica del muscolo scheletrico, nota come miosteatosi, aumenta con l'obesità e l'invecchiamento. La miosteatosi è correlata negativamente con la massa e la forza muscolare e con la sensibilità all'insulina¹. Inoltre, studi recenti indicano che il grado di miosteatosi potrebbe essere utilizzato come fattore prognostico per altre condizioni come la malattia cardiovascolare², la steatosi epatica non alcolica³ o il cancro⁴. I lipidi possono accumularsi nel muscolo scheletrico tra le fibre muscolari come lipidi extramiocellulari o all'interno delle fibre, come lipidi intramiocellulari (IMCL). Gli IMCL sono prevalentemente immagazzinati come trigliceridi in goccioline lipidiche (LD) che vengono utilizzate come combustibile metabolico durante l'esercizio fisico ^5,6. Tuttavia, quando l'offerta lipidica supera la domanda, o quando i mitocondri diventano disfunzionali, gli IMCL saranno implicati nella resistenza all'insulina muscolare, come si vede in individui metabolicamente malsani e obesi e nei pazienti con diabete di tipo 2⁷. Curiosamente, gli atleti di resistenza hanno livelli simili, se non più alti, di IMCL a quelli trovati nei pazienti obesi con diabete mellito di tipo 2, pur mantenendo un'elevata sensibilità all'insulina. Questo fenomeno è descritto come il "paradosso dell'atleta"^8,9, ed è spiegato da una valutazione più sfumata degli LCD muscolari, relativi alle loro dimensioni, densità, localizzazione, dinamica e composizione delle specie lipidiche.

In primo luogo, la dimensione della LD è inversamente correlata alla sensibilità all'insulina e alla forma fisica^10,11. In effetti, le LD più piccole mostrano una superficie relativamente maggiore per l'azione della lipasi e, quindi, potenzialmente hanno una maggiore capacità di mobilitare i lipidi¹². In secondo luogo, la densità LD (numero/superficie) svolge un ruolo controverso nell'azione dell'insulina ^8,10; tuttavia, sembra essere aumentato negli atleti. In terzo luogo, la localizzazione subcellulare delle LD è importante, poiché le LD situate appena sotto la membrana superficiale (subsarcolemmale o periferica) esercitano un effetto più deleterio sulla sensibilità all'insulina rispetto a quelle centrali ^8,9,13. Questi ultimi forniscono carburante ai mitocondri centrali, che hanno una maggiore attività respiratoria e sono più specializzati per soddisfare l'elevata domanda di energia richiesta per la contrazione¹⁴. Al contrario, le LD periferiche forniscono mitocondri subsarcolemmali, che sono coinvolti nei processi correlati alla membrana⁸. Infine, oltre ai trigliceridi, specifici lipidi complessi all'interno del muscolo possono essere più deleteri di altri. Ad esempio, il diacilglicerolo, l'acil-CoA a catena lunga e le ceramidi possono accumularsi nel muscolo quando il tasso di turnover dei trigliceridi è basso, compromettendo così la segnalazione dell'insulina ^9,15. Tornando al "paradosso dell'atleta", gli atleti di resistenza hanno un numero elevato di LD centrali più piccoli con elevati tassi di turnover nelle fibre di tipo I (ossidative), mentre i pazienti obesi e diabetici hanno LD periferici più grandi con bassi tassi di turnover nelle fibre di tipo II (glicolitiche) ^8,15,16. Oltre al loro ruolo nell'immagazzinamento e nel rilascio di energia, gli LCD tramite acidi grassi derivati (FA) e una proteina del mantello (perilipina 5) potrebbero anche funzionare come attori critici coinvolti nella regolazione trascrizionale dell'ossidazione fa e della biogenesi mitocondriale⁸. A causa delle loro implicazioni cruciali in fisiologia e fisiopatologia, sono giustificati studi approfonditi sulla dinamica e le funzioni dei LD.

Sebbene esistano diverse tecniche per studiare le IMCL, non sono tutte adatte a quantificare con precisione le dimensioni, la densità e la distribuzione dei LD in modo specifico per le fibre. Ad esempio, la valutazione delle IMCL mediante spettroscopia di risonanza magnetica, pur essendo non invasiva, offre un livello di risoluzione che non è sufficiente per studiare le dimensioni e la posizione precisa degli LCD all'interno della fibra, e non è specifico per il tipo di fibra^17,18. Allo stesso modo, le tecniche biochimiche eseguite su omogeneizzati muscolari interi¹⁹ non possono valutare la posizione e le dimensioni dei lipidi. Di conseguenza, il metodo più adeguato per analizzare la morfologia e la posizione della LD è la microscopia elettronica a trasmissione quantitativa¹³, ma questa tecnica è costosa e richiede tempo. Pertanto, l'imaging a fluorescenza confocale su preparati con coloranti come Oil Red O (ORO)^20,21, monodansylpentane (MDH)²² o Bodipy 23,24,25, è emerso come lo strumento migliore per questi studi.

Qui viene descritto un protocollo completo, che include il campionamento e l'elaborazione dei tessuti, la colorazione di Bodipy e l'acquisizione e l'analisi di immagini confocali per quantificare le dimensioni, il numero e la localizzazione di LD nelle criosezioni muscolari del topo. Poiché gli IMCL non sono distribuiti uniformemente tra fibre ossidative e glicolitiche e ogni tipo di fibra regola la dinamica LD in modo diverso, lo studio delle IMML deve essere specifico per il tipo di fibra 16,25,26,27. Pertanto, questo protocollo utilizza l'immunofluorescenza su sezioni seriali per identificare le isoforme a catena pesante della miosina (MyHC) espresse da ciascuna fibra. Un altro vantaggio di questo protocollo è l'elaborazione simultanea di un muscolo glicolitico (estensore digitorum longus, EDL) e di un muscolo ossidativo (soleo) posti fianco a fianco prima del congelamento (Figura 1). Questa elaborazione simultanea non solo consente di risparmiare tempo, ma evita anche la variabilità dovuta all'elaborazione separata dei campioni.

Figura 1: Panoramica schematica della procedura. Dopo la dissezione muscolare (1), i muscoli selezionati di dimensioni simili vengono preparati e congelati insieme (2). Le sezioni trasversali seriali di 10 μm sono ottenute utilizzando un criostato e montate direttamente su vetrini di adesione (3). Da due vetrini seriali, il primo (4A) è immunomarcato per la laminina e colorato con Bodipy per riconoscere gli LD e il secondo (4B) è immunocolorato con anticorpi contro i MyHC per il riconoscimento dei tipi di fibre muscolari. Le immagini vengono acquisite utilizzando un microscopio confocale per Bodipy (5A) e un microscopio a epifluorescenza per i tipi di fibre muscolari (5B). Le immagini vengono analizzate nelle Figi applicando una soglia e quantificando le particelle (6A) per ottenere il numero, la dimensione media, la densità e la percentuale dell'area totale occupata da LD (7) o celle di conteggio (6B) per ottenere la percentuale di fibre di ciascun tipo nella sezione (7). Abbreviazioni: LDs = goccioline lipidiche; EDL = estensore digitorum longus; MyHC = isoforme a catena pesante della miosina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tutte le procedure condotte sui topi sono state approvate dal Comitato etico per la sperimentazione animale del settore medico dell'Université Catholique de Louvain (2019 / UCL / MD / 013).

1. Dissezione e preparazione dei campioni per il congelamento

1. Etichettare un pezzo di sughero di 3 mm di spessore per ogni paio di muscoli.
2. Attraverso una piccola incisione realizzata con una lama al centro del tappo, inserire perpendicolarmente un pezzo rettangolare di plastica rigida (0,5 cm W, 1 cm H) che servirà da supporto (Figura 2B).
   NOTA: La dimensione del pezzo di plastica rettangolare dipenderà dalla dimensione del muscolo. Qui, le dimensioni descritte sono adattate alle dimensioni del soleo (~ 9 mg, 1 cm L, 2-3 mm W) e EDL (~ 5 mg, 1 cm L, 2-3 mm W) di un topo maschio C57BL / 6J di 3 mesi.
3. Al momento della dissezione, rimuovere il soleo e l'EDL dell'arto posteriore del topo. Per evitare che i campioni si secchino durante la dissezione, metterli su un impacco leggermente inumidito con soluzione salina in una capsula di Petri posta su ghiaccio.
   NOTA: Vedi Wang et ^al.28 per le spiegazioni su come sezionare questi due muscoli degli arti.
4. Posizionare una piccola goccia di composto OCT (Optimal Cutting Temperature) sulla giunzione di sughero/plastica, evitando bolle d'aria.
5. Eliminare l'umidità in eccesso dai campioni asciugandoli delicatamente con un tovagliolo di carta (Figura 2A) e posizionare entrambi i muscoli sulla plastica perpendicolare al tappo (Figura 2C).
6. Controllare l'orientamento delle miofibre muscolari al microscopio stereo (Figura 2D).
   NOTA: È importante non coprire il muscolo con OCT, poiché il suo effetto isolante impedirebbe il congelamento rapido e produrrà artefatti di congelamento.

2. Congelamento di campioni di muscolo scheletrico per la criosezione

ATTENZIONE: Il congelamento del muscolo deve essere effettuato sotto un cappuccio chimico, indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (vedere la Tabella dei materiali).

1. Utilizzare un tumbler in acciaio inossidabile (~8 cm H, 6 cm Ø) con due cinghie laterali attaccate ad esso lunghe almeno 25 cm (Figura 2F) e riempire il tumbler fino a 2/3 della sua capacità con isopentano.
2. Afferrando il tumbler per le cinghie, immergerlo delicatamente in una scatola di polistirolo riempita con azoto liquido in modo che il livello di azoto all'esterno del contenitore sia superiore al livello di isopentano all'interno (Figura 2F,G).
   ATTENZIONE: Quando il tumbler entra in contatto con l'azoto, lo shock termico può causare vortici. Assicurarsi che il tumbler sia sufficientemente immerso, ma evitare l'ingresso di azoto in quanto ciò causerebbe precipitazioni isopentane. Se ciò accade, lasciare raffreddare l'isopentano, riempire il tumbler con nuovo isopentano e ricominciare da capo.
3. Quando l'interno del tumbler è completamente coperto da uno strato solido bianco di isopentano, estrarlo dalla scatola di azoto liquido (Figura 2H).
   NOTA: La temperatura di fusione dell'isopentano è -159 °C, i bordi del tumbler diventeranno bianchi quando fa abbastanza freddo.
4. Mescolare delicatamente i pezzi di isopentano solido nell'isopentano liquido rimanente con una pinza fino a quando l'intero volume diventa di nuovo liquido.
5. Immergere nuovamente il tumbler nell'azoto liquido fino a formare ciottoli bianchi su tutto il fondo e sui bordi del tumbler (Figura 2G,H).
   NOTA: Questa seconda fase di raffreddamento garantisce la temperatura di congelamento appropriata dell'isopentano.
6. Rimuovere il tumbler dall'azoto liquido e immergere rapidamente i muscoli nella parte inferiore del tumbler, tenendo il tappo con una pinzetta a denti di ratto. Ruotare il tappo per 15 s nell'isopentano e conservarlo a -80 °C fino alla lavorazione (Figura 2I).
   NOTA: per la conservazione a breve termine, i campioni possono essere conservati in un congelatore a -20 °C. Il protocollo completo per il congelamento rapido del muscolo scheletrico è già stato pubblicato altrove. Per riferimenti dettagliati e risoluzione dei problemi, vedere: Meng et ^al.29, Kumar et ^al.30 e Leiva-Cepas et ^al.31.

3. Criosezione

1. Portare i campioni nella camera di un criostato precedentemente raffreddato a -20 °C e la temperatura della lama impostata a -25 °C.
   NOTA: Trasportare i campioni dal congelatore -20 °C/-80 °C al criostato in una scatola di polistirolo riempita con ghiaccio secco e lasciare che i campioni si equilibrino per almeno 20-30 minuti alla temperatura della camera prima del taglio.
2. Rimuovere la plastica dal tappo con una pinzetta fine e posizionare il disco del campione di criostato sulla piastra di congelamento rapido per raffreddare. Una volta che la piastra ha raggiunto -50 °C, posizionare un po' di OCT sul disco e posizionare rapidamente il tappo sopra il disco, premendo con decisione. Attendere che l'OCT si solidifichi e che il tappo sia ben fissato sul disco.
3. Posizionare il disco sulla testa dell'oggetto nell'orientamento di taglio desiderato (Figura 2J, K) e tagliare il blocco muscolare oltre almeno 1/3 della lunghezza dei muscoli e fino a quando entrambe le sezioni trasversali dei muscoli sono visibili.
4. Impostare lo spessore di taglio a 10 μm e posizionare una sezione su un vetrino di adesione per verificare il corretto orientamento delle fibre su un microscopio a campo luminoso.
   NOTA: Il controllo dell'orientamento trasversale delle fibre è fondamentale. Se le fibre non sono adeguatamente orientate, regolare l'angolo della testa dell'oggetto, tagliare un'altra sezione e controllare di nuovo.
5. Posizionare due sezioni trasversali seriali su due vetrini di adesione premarcati: un vetrino per determinare i tipi di fibre, l'altro per quantificare il contenuto lipidico (Figura 2L).
   NOTA: Ulteriori sezioni trasversali seriali possono essere ottenute e mantenute a -80 °C per altri studi istologici. Tuttavia, per evitare di alterare il contenuto lipidico e la morfologia intracellulare²⁴, è essenziale elaborare i primi due vetrini subito dopo il taglio per evitare l'essiccazione all'aria. Il congelamento e lo scongelamento dei vetrini per la quantificazione LD avrebbero lo stesso effetto ed è quindi altamente sconsigliabile.

4. Tipizzazione delle fibre e colorazione Bodipy

1. Rilevazione immunoistochimica del tipo di fibra muscolare
   NOTA: Per il seguente protocollo, un volume totale di soluzione di 250 μL è sufficiente a coprire l'intera sezione muscolare circondata da un cerchio disegnato con una penna idrofobica delle dimensioni approssimative di una moneta da 1 centesimo.
   1. Circondare le sezioni con un contorno disegnato con una penna idrofoba e risciacquare con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) da 0,1 M ghiacciata per 1 minuto a temperatura ambiente (RT). Posizionare il vetrino in una camera umida e bloccare per 90 minuti a 37 °C in soluzione bloccante (10% di siero di capra normale (NGS) e 1:30 di reagente bloccante topo su topo (MOM) in PBS).
   2. Rimuovere la soluzione bloccante e incubare i vetrini per 90 minuti a 37 °C con la soluzione contenente gli anticorpi primari (5% NGS, reagente bloccante MOM 1:30, gli anticorpi primari del topo per riconoscere le fibre di tipo I (IgG2b, a 1:10), di tipo IIa (IgG1, a 1:10) e di tipo IIx (IgM, a 1:5) e un antilaminina di ratto (catena α2, 1:1.000) in PBS.
   3. Lavare le diapositive con PBS 3 x 5 min a RT.
   4. Incubare i vetrini al buio per 1 ora a RT con la soluzione contenente gli anticorpi secondari (anti-IgG2b AF405 di capra (1:500), anti-IgG1 AF488 di capra (1:500), anti-IgM di capra AF568 (1:1.000) e anti-laminina di capra AF647 (1:500) in PBS).
      ATTENZIONE: Per il resto del protocollo, assicurarsi di tenere le diapositive lontane dalla luce per preservare la fluorescenza.
   5. Lavare nuovamente 3 x 5 minuti in PBS, risciacquare in H₂O a doppia distillazione, rimuovere l'acqua in eccesso e montare con un reagente antifalda.
      NOTA: Conservare le diapositive a 4 °C, al riparo dalla luce per preservare la fluorescenza fino all'acquisizione dell'immagine. Poiché le diapositive non sono fisse, si consiglia di utilizzare soluzioni appena fatte per ogni esperimento, autoclave il PBS e acquisire le immagini il prima possibile per evitare la contaminazione delle sezioni.
2. Colorazione di LD con Bodipy
   NOTA: Simile al passaggio 4.1., un volume totale di soluzione di 250 μL è sufficiente per coprire l'intera sezione muscolare circondata da un cerchio disegnato con una penna idrofoba delle dimensioni approssimative di una moneta da 1 centesimo.
   1. Circondare le sezioni con un contorno disegnato da una penna idrofoba e risciacquare con PBS 0,1 M ghiacciato per 10 minuti a RT. Utilizzare PBS ghiacciato per tutti i risciacqui e lavaggi.
   2. Fissare con paraformaldeide fredda al 4% (PFA) senza metanolo per 10 minuti a RT. Dopo un primo risciacquo rapido, lavare i vetrini con PBS 3 x 5 min a RT.
      ATTENZIONE: eseguire questo passaggio sotto un cappuccio chimico.
   3. Posizionare la slitta in una camera umida e bloccare per 1 ora a RT con il 5% di NGS in PBS.
   4. Incubare i vetrini per 90 min a 37 °C con la soluzione dell'anticorpo primario (2% NGS e antilaminina di ratto (catena α2, 1:1.000) in PBS). Lavare le diapositive con PBS 3 x 5 min a RT.
      ATTENZIONE: Per il resto del protocollo, assicurarsi di tenere le diapositive lontane dalla luce per preservare la fluorescenza.
   5. Incubare per 1 ora a RT con la soluzione anticorpale secondaria contenente anticorpo anti-ratto-AF647 di capra (1:500) in PBS. Lavare le diapositive con PBS 3 x 5 min a RT.
   6. Incubare per 20 minuti a RT con una soluzione di 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI, 0,5 μg/mL) e BODIPY (1 μg/mL) in PBS.
      NOTA: Per preparare la soluzione madre BODIPY, scioglierla in DMSO ad una concentrazione di 1 mg/mL. Diverse formulazioni di Bodipy sono disponibili in commercio per la colorazione LD. A seconda della scelta effettuata, il metodo di colorazione è lo stesso (stessi passaggi, concentrazione e tempo di incubazione); tuttavia, il metodo di acquisizione sarà leggermente diverso.
   7. Dopo un primo risciacquo rapido, lavare i vetrini con PBS 3 x 5 min a RT, risciacquare in H₂O a doppio distillato, rimuovere l'acqua in eccesso e montare con un reagente antideflagrante.
      NOTA: Conservare le diapositive a 4 °C, al riparo dalla luce, per preservare la fluorescenza fino all'acquisizione dell'immagine.

5. Acquisizione di immagini

NOTA: Una volta completati i protocolli di colorazione, è importante procedere immediatamente all'acquisizione delle immagini (entro le successive 24 ore), non solo per evitare la contaminazione ma anche per preservare la morfologia, le dimensioni e il numero di LD.

1. Acquisizione di immagini per valutare i tipi di fibre di ciascun muscolo campionato
   NOTA: Questo passaggio potrebbe essere ottenuto con un microscopio a scansione a fluorescenza a vetrino intero o con un microscopio a epifluorescenza convenzionale. Con quest'ultimo, la cucitura manuale o automatizzata delle immagini deve essere fatta per ricostruire la sezione.
   1. Per il riconoscimento del tipo di fibra, utilizzare un microscopio a epifluorescenza con un obiettivo 10x/0,3. Selezionare i filtri di eccitazione per DAPI (405 nm), FITC, TRITC e Cy5 per rilevare rispettivamente le fibre di tipo I, IIa, IIx e laminina.
      NOTA: le fibre di tipo IIb non saranno immunoamarcate. Saranno riconosciute come fibre macchiate dalla laminina sui limiti del sarcolemma con un sarcoplasma nero.
   2. Regolare il tempo di esposizione appropriato per ciascun canale.
   3. Quando si utilizza un microscopio a epifluorescenza convenzionale, acquisire sempre le immagini dell'intero muscolo seguendo lo stesso ordine per facilitare la ricostruzione muscolare. Assicurarsi che le fibre sul bordo destro di un'immagine vengano visualizzate anche sul bordo sinistro dell'immagine seguente. Lo stesso vale per le parti superiore e inferiore delle immagini (Figura 3A).
      NOTA: Come riferimento, per una sezione dell'EDL o del soleo sezionato da un topo di 3 mesi, una media di sei e otto immagini, rispettivamente, coprirà l'intera sezione trasversale muscolare.
   4. Dopo che il muscolo è stato scansionato, caricare le immagini digitali acquisite in qualsiasi software di elaborazione delle immagini per la ricostruzione (cucitura), in base alla morfologia della fibra (laminina) e all'istologia della sezione muscolare, e salvarlo come file TIFF, PNG o JPG con tutti i canali (colori) uniti (Figura 3A).
2. Acquisizione di immagini con laminina e co-colorazione Bodipy
   NOTA: Per riconoscere il tipo di fibra e avere una stima del numero di fibre per ogni tipo catturato, è essenziale avere la sezione del tipo di fibra già scansionata e i muscoli ricostruiti prima di iniziare l'acquisizione dell'immagine di Bodipy-laminina (Figura 3B).
   1. Per l'osservazione e l'acquisizione di immagini Bodipy, utilizzare un microscopio confocale con un obiettivo ad immersione in olio 40x con un'apertura numerica di 1,4.
   2. Utilizzare le seguenti impostazioni: foro stenopeico a 1 UA, risoluzione di 2.048 pixel x 2.048 pixel, dimensione dei pixel a 0,08 μm, modalità unidirezionale, velocità di scansione a 4 (~ 4 μs / pixel), media della linea impostata su 4x e zoom digitale impostato su 1.
   3. Per evitare il cross-talk tra Bodipy-558/568 e laminin-AF647, utilizzare la modalità di scansione sequenziale sul software confocale.
      NOTA: Quando il colorante scelto è Bodipy-493/503, è possibile la scansione laser confocale simultanea senza diafonia tra il canale Bodipy e il canale laminina-AF647. Ciò accelererà l'acquisizione delle immagini.
   4. Eccita Bodipy-493/503 utilizzando la linea laser a 488 nm o la linea laser ad argon ed eccita Bodipy-555/568 utilizzando la linea laser a diodi da 561 nm. Infine, rileva la laminina-AF647 con una linea laser a diodi da 640 nm.
      ATTENZIONE: Tieni presente che le molecole di Bodipy sono molto sensibili al fotosbiancamento, quindi evita inutili scansioni laser. Per riconoscere le fibre, utilizzare solo il laser per la laminina.
   5. A seconda del colorante scelto, impostare gli intervalli di emissione a 570-650 nm per Bodipy-493/503²⁴ e a 565-620 nm per Bodipy-558/568. Impostare l'intervallo di emissione per la laminina a 656-700 nm.
   6. Impostare il guadagno e il guadagno digitale in modo appropriato in modo che non vengano rilevati pixel saturi sull'indicatore dell'intervallo. Correggere il segnale di sfondo regolando l'offset.
      NOTA: la selezione del filtro e altri parametri di scansione sopra menzionati devono essere ottimizzati per ciascun microscopio confocale. È importante che tutte le impostazioni sopra menzionate siano mantenute costanti per tutte le immagini acquisite dai campioni da confrontare.
   7. Per identificare il tipo di fibra tra quelle visualizzate al microscopio confocale, utilizzare un laptop personale su cui viene controllata l'immagine della sezione ricostruita dopo l'immunodetezione di tipo fibra (Figura 3B).
   8. Una volta identificato correttamente un gruppo di fibre, acquisire l'immagine con i canali Bodipy e laminina.
      NOTA: Si consiglia di notare il nome dell'immagine Bodipy-laminin sulla regione del muscolo in cui si trovano queste fibre sull'immagine acquisita per il riconoscimento MyHC per facilitare la successiva analisi specifica della fibra di LDs.

6. Analisi delle immagini

1. Analisi dei tipi di fibre su ciascun campione muscolare
   1. In Fiji (o ImageJ)³², apri il file TIFF, PNG o JPG con il muscolo ricostruito ottenuto dalla fusione di tutti i canali utilizzati per rilevare le isoforme della fibra.
   2. Per avviare lo strumento Conteggio celle , fare clic su Plugin | Analizza | Contatore di celle | Contatore di celle.
   3. Nella finestra Contatore di celle , fare clic su Azioni | Inizializza.
   4. In Contatori nella stessa finestra selezionare Tipo 1.
   5. Nella finestra principale delle Figi, seleziona lo strumento Bacchetta .
   6. Per quantificare il numero di fibre di ciascun tipo, fare clic su ciascuna fibra dello stesso tipo, in modo che il programma registri il numero di fibre cliccate.
   7. Una volta terminato, selezionare il prossimo tipo di fibra e ripetere gli stessi passaggi.
   8. Quando tutte le fibre dell'immagine sono state assegnate a un determinato tipo di fibra, fare clic su Risultati nella finestra Contatore celle per visualizzare i risultati in una tabella.
   9. Salva questa tabella come tabella di foglio di calcolo facendo clic su File | Salva con nome nella finestra Risultati .
   10. Salva e ricarica le selezioni sulla stessa immagine in qualsiasi momento facendo clic su Salva marcatori o Carica marcatori, rispettivamente, nella finestra Conteggio celle .
2. Analisi delle goccioline lipidiche in modo dipendente dal tipo di fibra
   1. Analizza le immagini di Bodipy e laminina ottenute sulla confocale usando Fiji per la quantificazione degli LD.
      NOTA: gli autori hanno progettato una macro personalizzata per automatizzare l'analisi. Questa macro, insieme a una spiegazione dettagliata su come utilizzarla, è disponibile rispettivamente come file supplementare 1 e file supplementare 2.
   2. Apri ogni immagine con l'aiuto dell'importatore di bioformati dalle Figi. Sotto l'opzione Visualizza stack con , selezionare Hyperstack | Modalità colore, predefinito. Assicurarsi che la finestra Ridimensiona automatica sia selezionata.
      NOTA: i seguenti passaggi descriveranno il protocollo per l'analisi di una fibra sull'immagine, ma deve essere ripetuto tutte le volte che il numero di fibre intere appare sull'immagine.
   3. Utilizzare lo strumento di selezione a mano libera per selezionare manualmente il sarcolemma della fibra in base al canale della laminina (Figura 4A) e premere T sulla tastiera per registrare la selezione o la regione di interesse (ROI) nella finestra ROI .
   4. Vai alla finestra principale delle Figi e fai clic su Analizza | Impostare Misure e, nella finestra pop-up, selezionare Area e diametro di Feret. Lasciare deselezionate le caselle rimanenti e altri parametri come appaiono per impostazione predefinita.
   5. Fare clic su Misura nella finestra ROI per ottenere l'area e il diametro minimo di Feret (MF) della fibra selezionata e annotarli per un uso successivo.
      NOTA: Quando si analizzano gli LCD, è importante tenere presente che le loro dimensioni e densità variano tra il centro e la periferia (regione subsarcolemmale-SS) della fibra. Pertanto, l'analisi deve essere eseguita separatamente.
   6. Calcola il valore di 1/6 del MF per delimitare la parte centrale della fibra.
      Nota : nella macro, il valore MF predefinito è impostato su 6, il che significa che la riduzione applicata verrà impostata come 1/6 della MF. Questo valore è stato scelto sulla base dei dati empirici ottenuti dal soleo di animali alimentati con una dieta ricca di grassi. Tuttavia, ogni ricercatore deve modificare questo numero in base ai dati empirici e al muscolo analizzato, al tipo di fibra e alle condizioni dell'animale.
   7. Nella finestra ROI , fai clic su Aggiungi per avere un duplicato del primo ROI e seleziona il secondo ROI che appare nella finestra.
   8. Nella finestra principale delle Figi, fai clic su Modifica | | di selezione Ingrandire e introdurre il valore calcolato in precedenza (dal passaggio 6.2.6.) con un segno meno prima del numero e fare clic su OK. Nella finestra ROI, fai clic su Aggiungi[t] (deve apparire un terzo ROI) ed Elimina, per eliminare il secondo ROI.
      NOTA: il ricercatore può controllare i risultati facendo clic sulla casella Mostra tutto nella finestra ROI . A questo punto devono apparire due ROI, uno che circonda l'intero perimetro della fibra (Figura 4B) e un altro che è posto al centro (Figura 4C).
   9. Seleziona entrambi i ROI nella finestra ROI e fai clic su Altro | | XOR Aggiungi[t]. Attendere che appaia un terzo ROI, che corrisponde alla periferia della fibra (Figura 4D).
   10. Salva il ROI facendo clic su Altre | Salva per salvare i ROI nel caso in cui sia necessaria una successiva rianalisi delle stesse fibre.
   11. Seleziona il canale Bodipy e apri lo strumento Soglia facendo clic su Immagine | Regolare | Soglia sulla finestra principale delle Figi.
   12. Nella finestra pop-up Soglia , imposta i valori su 70/255, seleziona Yen | Metodo B&W e fare clic su Sfondo scuro | Applica.
       NOTA: I valori applicati sulla Soglia possono variare a seconda delle condizioni dell'esperimento e la soglia deve essere opportunamente impostata per ottimizzare l'analisi. Deve apparire una finestra in bianco e nero con il segnale Bodipy al di sopra del limite di soglia mostrato in bianco e lo sfondo in nero (confrontare l'immagine originale di Bodipy nella Figura 4E con quella nella Figura 4F).
   13. Vai alla finestra principale delle Figi e fai clic su Analizza | Impostare Misure e nella finestra pop-up selezionare Area, Frazione di area e Limita alla soglia. Lasciare deselezionate le caselle rimanenti e altri parametri come appaiono per impostazione predefinita.
       NOTA: Se il ricercatore vuole analizzare la "circolarità" dei LD, che è un indice della morfologia sferica che va da 1 per una sfera perfetta a 0 per una linea, fare clic sulla casella Descrittori forma della finestra pop-up Imposta misure .
   14. Vai alla finestra ROI e seleziona il primo ROI. Nella finestra principale delle Figi, fai clic su Analizza | Strumento Analizza particelle.
       NOTA: questo strumento quantifica il numero, le dimensioni, l'area coperta e la percentuale dell'area totale coperta dalle particelle in ogni selezione e salva i risultati come file di foglio di calcolo.
   15. Impostare i valori da 2 a Infinito (2-Infinito) nella finestra Analizza particelle, selezionare la casella Pixel , mantenere i valori di circolarità predefiniti, selezionare Riepilogo e fare clic su OK.
       NOTA: per controllare i risultati sulla fibra, sotto l'opzione Mostra selezionare una delle opzioni disponibili. Per far riconoscere le informazioni di ogni LD sulla selezione in una tabella, selezionare l'opzione Visualizza risultati nella finestra Analizza particelle . I risultati dell'analisi dell'area totale della fibra sono mediati e riassunti in una tabella con più colonne (Conteggio, Area totale, Dimensione media, % Area; queste corrispondono al numero di particelle [LD], all'area occupata da queste particelle, alla loro dimensione media e alla percentuale dell'area totale della selezione occupata dalle particelle, rispettivamente). Per calcolare la densità, dividere il numero di particelle per l'area totale di ciascuna selezione.
   16. Per ottenere i valori del centro e della periferia della fibra, ripetere i passaggi 6.2.14 e 6.2.15, selezionando ogni volta il secondo (centro) e il terzo ROI (periferia).
   17. Salva i risultati facendo clic su File | Salva con nome nella finestra Riepilogo .
       NOTA: includere il tipo di fibra, la condizione e il nome dell'immagine sul nome assegnato dei risultati per facilitare la successiva unificazione e l'analisi statistica dei dati. Per analizzare il resto delle fibre nella stessa immagine, ripetere i passaggi da 6.2.3 a 6.2.17. Per l'analisi statistica, devono essere analizzate almeno 10-15 fibre di ciascun tipo per animale.

Il protocollo qui descritto fornisce un metodo efficiente per quantificare facilmente gli LCD in un tipo di fibra e in modo specifico subcellulare. Mostra come, congelando insieme due muscoli di dimensioni simili, come l'EDL e il soleo, il tempo e le risorse spesi per i passaggi successivi si riducono della metà.

Viene fornito un protocollo completo per l'immunocolorazione, l'acquisizione di immagini e l'analisi delle diverse isoforme di MyHC espresse nei muscoli del topo adulto. Questo protocollo si basa su quello progettato per la prima volta da Schiaffino et al. nel 1989^{3 3}, con alcuni aggiustamenti come l'uso di un anticorpo aggiuntivo per etichettare la laminina. Questa modifica successiva è fondamentale per la posizione delle fibre di tipo IIb, che saranno nere in quanto non sono macchiate con alcun anticorpo. Come mostrato in Figura 5, questo protocollo immunoistochimico consente non solo il riconoscimento delle fibre slow-ossidative di topo (tipo I e IIa) e fast-glycolytic (tipo IIx e IIb), ma anche la presenza di fibre ibride (vedi asterisco in Figura 5D). Inoltre, avere le sezioni trasversali di entrambi i muscoli sullo stesso vetrino consente il confronto delle proporzioni di ciascun tipo di fibra tra i due muscoli selezionati, assicurando che le condizioni sperimentali fossero identiche su entrambe le sezioni.

Per l'etichettatura LD, i risultati qui presentati si basano sull'uso di Bodipy-558/568 C₁₂ come colorante lipidico; tuttavia, il lettore è riferito a un eccellente documento di protocollo che dettaglia l'uso del colorante classico Bodipy-493/503 sulle sezioni muscolari²³. Il protocollo presentato combinava la colorazione di LDs basata sull'immunoistochimica contro l'α2-laminina per distinguere il sarcolemma delle fibre. Come per l'esperimento del tipo di fibra, questo passaggio è essenziale, non solo per il riconoscimento delle singole fibre, ma anche per la successiva analisi dei lipidi sia nella regione centrale che in quella periferica delle fibre (Figura 4). Uno dei passaggi critici di questo protocollo è l'identificazione e l'etichettatura delle stesse fibre sulle due diapositive. Come spiegato in precedenza, è importante scansionare il vetrino con i tipi di fibre e avere la ricostruzione delle sezioni trasversali muscolari con i colori uniti prima dell'acquisizione di immagini per LD (Figura 3B). Le strutture notevoli di ogni sezione muscolare, come ramoscelli assonali o fusi muscolari, sono buoni punti di riferimento che potrebbero aiutare il ricercatore a localizzare le stesse fibre su entrambe le diapositive (Figura 6). Ricorda che, poiché il vetrino è posizionato a testa in giù sulla maggior parte dei microscopi confocali, si consiglia di invertire l'immagine ricostruita in fibra sul personal computer per facilitare l'attività di localizzazione.

Le impostazioni descritte per l'acquisizione della colorazione Bodipy-laminina mediante microscopia confocale consentono la visualizzazione e la successiva analisi delle dimensioni, del numero e della distribuzione degli LCD da tre a sei fibre contemporaneamente (Figura 6 e Figura 7). Un protocollo dettagliato passo-passo per analizzare gli LCD con il software di analisi delle immagini Fiji è anche fornito qui. Come mostrato nel protocollo, l'analisi completa di ciascuna delle fibre presenti su un'immagine è lunga e noiosa. Tuttavia, Fiji ha il vantaggio di consentire la progettazione di programmi personalizzati, chiamati macro, basati sul linguaggio Java. Gli autori hanno progettato una macro che consente l'automazione della serie di singoli comandi sopra descritti che viene eseguita automaticamente in loop per analizzare in pochi minuti, non solo ciascuna delle fibre presenti su un'immagine ma anche un ampio set di immagini. L'unico input del ricercatore è la selezione manuale del perimetro della fibra da analizzare ogni volta, la selezione del tipo di fibra e l'ispezione visiva dell'immagine risultante dopo aver applicato la soglia e quantificato le particelle.

Qui viene implementata l'analisi dei LD in modo dipendente dalla posizione. Misurando in precedenza l'area e il diametro MF della fibra, viene applicata una riduzione dipendente dalla dimensione (non fissa come descritto da Strauss et ^al.25) per ottenere le aree centrali e periferiche di ciascuna fibra (Figura 4 e Figura 7). Come si vede negli istogrammi della Figura 7, questo metodo consente la quantificazione di tre parametri importanti: la percentuale dell'area della fibra occupata dagli LD (Figura 7E), la densità degli LD, il numero di LD per μm² (Figura 7F) e la dimensione media degli LD (Figura 7G). Di conseguenza, nei topi di 3 mesi (N = 5), le fibre di tipo IIa (contorno verde) e di tipo IIx (contorno rosso) presentano la più grande percentuale di area occupata da LD nella periferia (Figura 7E). Per quanto riguarda la densità delle particelle, le fibre EDL mostrano sempre una densità maggiore rispetto alle fibre soleus indipendentemente dalla posizione subcellulare (Figura 7F). Infine, la dimensione media di questi LD è sempre più grande nella periferia che al centro (Figura 7G).

I diversi metodi utilizzati da altri gruppi per valutare l'accumulo di LD nel muscolo scheletrico^{dei roditori 34,35} rendono difficile confrontare questi risultati con quelli di studi precedenti. Tuttavia, in linea con i risultati di Komiya et ^al.34, la percentuale di area delle fibre occupata dagli LD è più alta nelle fibre soleus di tipo IIa e EDL di tipo IIx. Ancora più importante, le fibre di tipo IIb presentavano la percentuale più bassa di area occupata da LD (Figura 7E, istogrammi grigi). Poiché la fibra di tipo IIb è il tipo di fibra più predominante dell'EDL (75%, Figura 5E), questi risultati confermano ciò che altri gruppi hanno precedentemente descritto: l'accumulo complessivo di lipidi è inferiore nell'EDL rispetto al soleo^34,35.

Contrariamente a quanto descritto^{nell'uomo 25}, e anche in linea con i risultati di Komiya et ^al.34, i risultati qui presentati mostrano che l'accumulo di LD nelle fibre del soleo di tipo I è relativamente basso. Ciò potrebbe essere spiegato dalle differenze interspecie di tipo fibra tra topi e^{umani 36}, poiché le proprietà metaboliche delle fibre umane di tipo I sono più simili a quelle dei roditori di tipo IIa e IIx, mentre quelle delle fibre IIx di tipo umano sono vicine al tipo IIb³⁷ del roditore. In sintesi, le diverse tecniche qui descritte forniscono un metodo riproducibile, affidabile ed efficiente in termini di tempo per studiare e confrontare diversi parametri relativi agli LCD e alla loro distribuzione all'interno della cellula in modo dipendente dal tipo di fibra.

Esperimenti non ottimali
Se la procedura di congelamento non viene eseguita correttamente e l'isopentano non è alla giusta temperatura, i cristalli di ghiaccio si formeranno all'interno delle fibre (Figura 8A). Questi artefatti di congelamento sono rilevabili solo dopo la preparazione istologica del campione e possono essere riconosciuti come fori nelle fibre. Per una corretta quantificazione dei LD, questi artefatti devono essere evitati. È stato dimostrato che lo scongelamento e il ricongelamento appropriato del blocco muscolare possono ridurre significativamente questi artefatti²⁹.

Un altro problema si riscontra quando le fibre non vengono tagliate perpendicolarmente all'asse longitudinale (Figura 8B). La quantificazione della LD e il confronto tra fibre, muscoli o animali non possono essere fatti quando le sezioni non sono trasversali. Per questo motivo, è essenziale posizionare correttamente i muscoli sul tappo con l'aiuto di uno stereomicroscopio prima del congelamento e avere un microscopio a campo luminoso vicino al criostato. Quest'ultimo permetterà al ricercatore di trovare il corretto allineamento del campione sul criostato.

In alcune rare occasioni, l'etichettatura delle isoforme MyHC è molto debole su uno o più tipi di fibre (Figura 8C). Se ciò accade, l'analisi dei LD sarà incompleta. In questo caso, l'esperimento deve essere ripetuto a partire dal taglio dei muscoli. Infine, Bodipy potrebbe accumularsi nella periferia della sezione trasversale muscolare (Figura 8D). Se ciò accade, la colorazione sarà molto forte su quelle fibre producendo un risultato artefatto. Evitare l'acquisizione di immagini da queste fibre.

Figura 2: Preparazione dei campioni per il congelamento e la criosezione. (A-D) I muscoli del soleo e dell'EDL del topo vengono sezionati e posti su un tappo di sughero tenuto da una plastica rigida con una goccia di OCT. (E-G) Un bicchiere di acciaio inossidabile viene riempito con isopentano e raffreddato alla sua temperatura di fusione in azoto liquido. (H,I) Il tumbler con l'isoptano freddo viene estratto dall'azoto liquido e il campione viene immerso fino al fondo del tumbler, ruotando per 15 s. (J-L) Il tappo con i campioni viene posto sul disco portacrista senza il supporto in plastica e sezioni trasversali seriali di 10 μm sono montate direttamente su vetrini di adesione. Due sezioni trasversali seriali adiacenti vengono immediatamente elaborate per la colorazione di LD e il rilevamento di MyHC. Abbreviazioni: LDs = goccioline lipidiche; EDL = estensore digitorum longus; MyHC = isoforme a catena pesante della miosina; OCT = temperatura di taglio ottimale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Acquisizione dell'immagine corporea dopo aver identificato il tipo di fibra dall'immagine composita ricostruita vista su un altro computer. (A) Ricostruzione dell'intera sezione del soleo immunomarcata per tipo di fibra (MyHC) da sette immagini unite indipendenti (rettangoli tratteggiati) cucite insieme utilizzando un software di elaborazione delle immagini. Le frecce bianche e i numeri rappresentano l'ordine seguito durante l'acquisizione delle immagini utilizzando un microscopio a epifluorescenza convenzionale. (B) Per l'acquisizione di immagini Bodipy, (1) un campo contenente la sezione muscolare immunocolorata con laminina-AF647 e Bodipy-555/568 viene visualizzato sullo schermo di un computer collegato al microscopio confocale. (2) Quelle fibre si trovano sull'immagine ricostruita della sezione muscolare immunocolorata per rilevare il tipo di fibre (MyHC). (3) L'immagine viene acquisita utilizzando un microscopio confocale. Abbreviazioni: LDs = goccioline lipidiche; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo; MyHC = isoforme a catena pesante della miosina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Analisi delle goccioline lipidiche con Fiji. (A,B) Il sarcolemma della fibra viene riconosciuto in base all'immagine della laminina e selezionato come ROI. L'area totale e MF sono misurati. (C) Per riconoscere la parte centrale della fibra, la selezione viene ridotta di 1/6 del valore della MF. (D) L'area tra la selezione centrale e quella totale è impostata come periferia o area subsarcostrummale. (E) Per l'analisi di LD macchiati con Bodipy, viene applicata una soglia, (F) e lo strumento Analizza particelle viene utilizzato per quantificare diversi parametri relativi ai LD (vedi tabella). Questi valori sono ottenuti per la fibra completa (All), per la parte centrale (Centro) e per l'area subsarcommale (Periferia), indipendentemente. Barre di scala = 12 μm. Abbreviazioni: LDs = goccioline lipidiche; ROI = regione di interesse; MF = Diametro minimo di Feret. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Immunocolorazione rappresentativa dei tipi di fibre nel muscolo di topo EDL (glicolitico) e soleo (ossidativo). Immagini di fluorescenza unite di EDL (A,B) e soleo (C,D) ottenute con un microscopio digitale a fluorescenza a vetrino intero. Sono stati utilizzati anticorpi contro il tipo I (blu-AF405), il tipo IIa (verde-AF488), il tipo IIx (rosso-AF568) e la laminina (bianco-AF647). Le fibre nere corrispondono al tipo di fibra IIb. B e D mostrano i dettagli delle fibre all'interno dei rettangoli bianchi dei pannelli A e C, rispettivamente. L'asterisco (*) nel pannello D mostra una fibra ibrida IIa/IIx. (E,F) Quantificazione rappresentativa della distribuzione del tipo di fibra in EDL e soleo da topi di 3 mesi (N = 5). L'EDL era composto principalmente da fibre di tipo IIb, poi IIx e IIa (~ 75%, 15% e 5%, rispettivamente). Al contrario, il soleo era composto principalmente da fibre di tipo IIa (>50%) e di tipo I (30%). Le proporzioni delle fibre di tipo IIx erano piuttosto simili in entrambi i muscoli, mentre quelle delle fibre ibride erano molto basse. Barre di scala = 200 μm (A,C), 100 μm (B,D). Abbreviazione: EDL = extensor digitorum longus. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Colorazione rappresentativa di LD con Bodipy su sezioni trasversali seriali precedentemente immunomarcate per le isoforme di MyHC. La fluorescenza ha unito le immagini di EDL (A) e soleo (B) di topo acquisite utilizzando un microscopio a epifluorescenza che mostra fibre di tipo I (blu), IIa (verde), IIx (rosso), IIb (nero) e laminina (segnale bianco che circonda le fibre). (C-F) Immagini di fluorescenza confocale dall'EDL (C,D) e dal soleo (E,F) co-marcati con laminina (ciano) e Bodipy (rosso). Si noti che le fibre mostrate in C-F sono le stesse di quelle all'interno dei rettangoli bianchi sui pannelli A e B. Nell'angolo destro del rettangolo bianco in A, si può distinguere un ramoscello assonale (punta di freccia bianca). Barre di scala = 200 μm (A,B), 20 μm (C-F). Abbreviazioni: LDs = goccioline lipidiche; EDL = estensore digitorum longus; MyHC = isoforme a catena pesante della miosina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Quantificazione degli LD in modo specifico per tipo di fibra e subcellulare. Immagini confocali rappresentative a fluorescenza di fibre di tipo I e di tipo IIa da soleus (A,B) e fibre di tipo IIx e di tipo IIb da EDL (C,D) ottenute dopo co-etichettatura con Bodipy (rosso) e α2-laminina (non mostrato). Il contenuto di LD (% dell'area occupata da Bodipy e densità) e la morfologia (dimensione) sono stati analizzati in modo subcellulare-specifico. Il perimetro della fibra è stato definito dalla colorazione della laminina e le aree centrali o periferiche sono state impostate in base al diametro MF. Percentuale di area della fibra occupata da Bodipy (LDs) (E), densità LD (numero/μm²) (F) o dimensione media LD (G) in regioni centrali o periferiche per ciascun tipo di fibra. I risultati sono rappresentati come ± SEM. Barre di scala = 10 μm. Abbreviazioni: LDs = goccioline lipidiche; EDL = estensore digitorum longus; C = centrale; P = periferico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Immagini corrispondenti a risultati non ottimali. (A) Immagine a campo luminoso della sezione trasversale muscolare colorata per l'ematossilina-eosina che mostra cristalli di ghiaccio formati durante il processo di congelamento. (B) Immagine unita di fluorescenza di una sezione soleus immunocolorata per MyHC e laminina, mostrando che la maggior parte delle fibre sono tagliate lungo l'asse longitudinale. (C) Immagine di fluorescenza di una sezione EDL immunocolorata per MyHC e laminina. La debole colorazione della fibra di tipo IIa (verde) ostacola la corretta quantificazione di ciascun tipo di fibra. (D) Immagine confocale che mostra una forte colorazione artefatta di Bodipy (rosso) su fibre situate alla periferia della sezione trasversale muscolare. Barre di scala = 50 μm (A,B), 200 μm (C,D). Abbreviazioni: EDL = extensor digitorum longus; MyHC = isoforme a catena pesante della miosina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare S1: Colorazione LD con Olio Rosso O sulle sezioni trasversali muscolari. (A,B) Immagini confocali che mostrano il modello di colorazione ottenuto con Oil Red O nel soleo e nell'EDL, rispettivamente. Il protocollo utilizzato per questa colorazione è descritto in dettaglio da Prats et ^al.24. Si noti che l'accumulo di LD è più alto nella regione subsarcolemmale delle miofibre, come precedentemente descritto per Bodipy. Barre di scala = 20 μm. Abbreviazioni: LD = gocciolina lipidica; EDL = estensore digitorum longus. Fare clic qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S2: Co-colorazione di LD e mitocondri nel muscolo soleo. (A) Immagine confocale unita che mostra l'immunolabeling di Tomm20, una proteina presente sulla membrana mitocondriale (verde), DAPI (blu) e Bodipy-558/568 etichettata LDs (rosso). L'inserto in A mostra diversi mitocondri (verdi) legati alla LD (rosso). Questa immagine è stata ottenuta applicando la microscopia a superrisoluzione confocale Airyscan. (B,C) Corrispondenti immagini a canale singolo di LD e mitocondri, rispettivamente. Barre di scala = 10 μm (A-C), 5 μm (A, inserto). Abbreviazioni: LDs = goccioline lipidiche; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo. Fare clic qui per scaricare questo file.

File supplementare 1: Fiji macro per l'analisi automatizzata di LD su più immagini laminina+ Bodipy. Fare clic qui per scaricare questo file.

File supplementare 2: Spiegazione dettagliata di come utilizzare la macro Bodipy_JoVE.ijm. Fare clic qui per scaricare questo file.

Il protocollo qui dettagliato descrive un metodo efficiente per quantificare gli LD etichettati con Bodipy su una base specifica per tipo di fibra e subcellulare. Negli ultimi anni, i coloranti lipidici classici, come ORO o Sudan Black B, sono stati sostituiti con una nuova serie di coloranti fluorescenti permeabili alle cellule, lipofili e che si legano ai lipidi neutri (ad esempio, Bodipy). Disponibile come diversi coniugati, Bodipy si è dimostrato molto efficace nel taggare gli LD per studiare la loro morfologia, dinamica e interazione con altri organelli, non solo in diversi tessuti e cellule fisse 23,38,39,40 ma anche in cellule viventi^41,42.

All'interno del protocollo, ci sono diversi aspetti critici che il ricercatore deve considerare per ottenere risultati ottimali. È fondamentale posizionare correttamente i muscoli scelti sul tappo per garantire un perfetto allineamento e orientamento delle miofibre muscolari, poiché una volta congelate, solo lievi riaggiustamenti del supporto possono essere effettuati sul criostato. Inoltre, è fondamentale iniziare il protocollo di immunocolorazione immediatamente dopo il taglio delle sezioni, poiché le criosezioni essiccate all'aria (per soli 15 minuti) hanno gravi effetti avversi sui LD, con conseguente diminuzione del 66% della densità LD e una diminuzione del 37% della dimensione media²⁴. Allo stesso modo, il congelamento e lo scongelamento dei vetrini avrebbero effetti negativi e pertanto non sono raccomandati. Una terza caratteristica importante di questo protocollo è legata alla fissazione dei campioni. Per l'identificazione delle diverse isoforme di MyHC con gli anticorpi qui citati, la fissazione dei tessuti deve essere evitata in quanto interrompe il legame degli anticorpi scelti ai loro epitopi. Se i campioni muscolari sono stati precedentemente fissati, il lettore viene indirizzato a un articolo pubblicato di recente utilizzando diversi anticorpi⁴³. Solo il PFA senza metanolo è raccomandato per l'etichettatura e la quantificazione degli LD, perché l'uso di metanolo o acetone sconvolge la morfologia degli LD^23,44. Inoltre, non è necessaria una fase di permeabilizzazione per la quantificazione degli LCD su vetrini immunomarcati con laminina. Poiché alcuni gruppi hanno dimostrato che la permeabilizzazione con detergenti come TritonX-100, saponina o glicina può ridurre le dimensioni o il numero di LD ^44,45, la permeabilizzazione è altamente scoraggiata. Infine, la messa a punto delle impostazioni del microscopio confocale è fondamentale per riconoscere solo i lipidi neutri presenti nelle LD e non quelli nelle membrane di altri organelli²⁴.

Qui, Bodipy-558/568 C₁₂ è stato usato come marcatore LD. Tuttavia, il bodipy più frequentemente utilizzato per etichettare gli LCD e studiare la loro morfologia e posizione all'interno delle miofibre muscolari scheletriche è Bodipy-493/503. Entrambi i coloranti sono simili nel loro tempo di incubazione, concentrazione di lavoro e spettri di emissione ristretti, sebbene i loro intervalli di eccitazione ed emissione siano leggermente diversi. Per un protocollo completo sull'uso di Bodipy-493/503, il lettore è rimandato al lavoro di Listenberger e Brown⁴⁶ o Spangenburg et ^al.23. Bodipy-558/568 C₁₂ è stato utilizzato per la colorazione di LD in altri tessuti come il tessuto adiposo⁴⁷, la retina⁴⁸ degenerativa, i reni fibrotici⁴⁹ o i fibroblasti⁵⁰. Questo Bodipy produce una colorazione simile a quella ottenuta con ORO (vedi Figura supplementare S1) ma con un onere tecnico notevolmente inferiore e una maggiore specificità^24,51. Inoltre, Bodipy-558/568 C₁₂ ha il vantaggio di consentire la quantificazione di LD in combinazione con la rilevazione di proteine o organelli marcati con un anticorpo secondario a spettro verde (vedi Figura supplementare S2 e Yan et al.49) o con modelli geneticamente modificati GFP⁵². Queste due applicazioni sono strumenti molto potenti per svelare le dinamiche e le interazioni degli LCD con altri organelli cellulari e proteine. Tuttavia, quando non è prevista alcuna colabeling di proteine all'interno delle cellule, gli autori raccomandano l'uso del colorante LD più caratterizzato Bodipy-493/503.

Uno dei limiti di questo protocollo è legato all'acquisizione di immagini e alla quantificazione delle caratteristiche morfologiche del DL. I progressi tecnologici nella microscopia a scansione laser confocale hanno notevolmente migliorato la risoluzione del piano rispetto ai microscopi a campo largo e consentono la ricostruzione 3D di oggetti durante la scansione del campione nel piano Z. Questo è stato molto utile per lo studio della morfologia LD²⁴ e l'interazione con altre proteine nelle miofibre scheletriche ^38,53, ma ha aumentato il tempo di acquisizione ed elaborazione dell'immagine, poiché ogni immagine ricostruita in 3D è composta da diverse immagini 2D indipendenti. Nel protocollo di cui sopra, le immagini confocali sono state acquisite con un obiettivo 40x e solo in 2D. Questo metodo consente l'acquisizione di tre o sei miofibre per immagine invece di una sola come sarebbe quando si utilizza un obiettivo 63x. Ciò si traduce in una risoluzione inferiore e una stima complessiva delle dimensioni e della morfologia della LD che non è completamente accurata. Tuttavia, consente l'analisi di un numero maggiore di fibre per campione, che è anche un fatto importante da considerare, specialmente negli esperimenti sugli animali, in cui è necessario confrontare un numero elevato di muscoli e condizioni.

Qui, si dimostra che, congelando due muscoli di dimensioni simili che sono adiacenti l'uno all'altro³⁴, il tempo di elaborazione dei campioni è notevolmente diminuito e le possibili differenze artefattuali derivate dalla loro elaborazione indipendente sono ridotte. Inoltre, questo metodo di analisi degli LD prende in considerazione le differenze tra la distribuzione subcellulare degli LD all'interno e tra i tipi di fibre⁵⁴. Selezionando il perimetro della miofibra e riducendo questa selezione in relazione al diametro minimo di Feret della fibra, si facilita lo studio indipendente delle dimensioni e della densità degli LCD centrali e periferici (subsarcolemmali). L'applicazione di questo metodo è estremamente importante poiché è stato dimostrato che l'accumulo subsarcolemmale di LD contribuisce direttamente all'insulino-resistenza. Mentre alcuni rapporti sugli esseri umani hanno studiato gli LCD in modo dipendente dal tipo di fibra e dalla posizione 11,16,25, questa è la prima volta, a nostra conoscenza, che questo metodo è stato applicato ai muscoli dei roditori. Inoltre, la quantificazione degli LCD con l'aiuto di una macro auto-progettata per le Figi ha ridotto e semplificato significativamente il tempo di analisi delle immagini. Sia la macro che una spiegazione dettagliata su come utilizzarla sono disponibili rispettivamente come file supplementare 1 e file supplementare 2.

Nel complesso, gli autori ritengono che il protocollo qui descritto potrebbe essere uno strumento utile per altri ricercatori che studiano il metabolismo lipidico nel muscolo scheletrico. Le tecniche spiegate possono essere applicate a diversi muscoli e in condizioni distinte (a digiuno / sovralimentato, addestrato / sedentario, giovane / invecchiato, magro / obeso) e si spera che aiutino a comprendere meglio le dinamiche delle LD, l'importanza delle loro interazioni con altri componenti della cellula, come i lipidi sono immagazzinati e metabolizzati nelle fibre glicolitiche e ossidative e il loro ruolo nell'insorgenza della resistenza all'insulina nel diabete di tipo 2.

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del Fonds National de la Recherche Scientifique (FNRS-Crédit de Recherche J.0022.20) e della Société Francophone du Diabète (SFD-Roche Diabetes Care).C.M.S. è il destinatario di una borsa di dottorato dalla FRIA (FNRS). M.A.D.-L.d.C. ha ricevuto una borsa di studio dal Wallonie-Bruxelles International Excellence Program.

Gli autori ringraziano Alice Monnier per il suo contributo allo sviluppo di questo protocollo e Caroline Bouzin per la sua esperienza e l'aiuto tecnico nel processo di acquisizione delle immagini. Ringraziamo anche la piattaforma di imaging 2IP-IREC per l'accesso al criostato e ai microscopi (2IP-IREC Imaging Platform, Institute of Experimental and Clinical Research, Université Catholique de Louvain, 1200 Bruxelles, Belgio). Infine, gli autori desiderano ringraziare Nicolas Dubuisson, Romain Versele e Michel Abou-Samra per la critica costruttiva del manoscritto. Alcune delle figure di questo articolo sono state create con BioRender.com.