Análise de tempo de permanência de molécula única de clivagem de DNA mediada por endonuclease de restrição

Usando DNA marcado com ponto quântico e microscopia de fluorescência de reflexão interna total, podemos investigar o mecanismo de reação das endonucleases de restrição ao usar proteína não marcada. Essa técnica de molécula única permite a observação massivamente multiplexada de interações proteína-DNA individuais, e os dados podem ser agrupados para gerar distribuições de tempo de permanência bem povoadas.

Este novo ensaio baseado em microscopia de fluorescência de reflexão interna total facilita a medição simultânea da duração do ciclo catalítico para centenas de moléculas individuais de endonuclease de restrição (REase) em um experimento. Este ensaio não requer marcação de proteínas e pode ser realizado com um único canal de imagem. Além disso, os resultados de vários experimentos individuais podem ser agrupados para gerar distribuições de tempo de permanência bem preenchidas. A análise das distribuições de tempo de permanência resultantes pode ajudar a elucidar o mecanismo de clivagem do DNA, revelando a presença de etapas cinéticas que não podem ser observadas diretamente. Exemplos de dados coletados usando este ensaio com a bem estudada REase, EcoRV - uma endonuclease de restrição dimérica do Tipo IIP que cliva a sequência palindrômica GAT↓ATC (onde ↓ é o local do corte) - estão de acordo com estudos anteriores. Esses resultados sugerem que existem pelo menos três etapas no caminho para a clivagem do DNA que é iniciada pela introdução de magnésio após o EcoRV se ligar ao DNA em sua ausência, com uma taxa média de 0,17 ^s-1 para cada etapa.

As endonucleases de restrição (REases) são enzimas que afetam quebras de fita dupla específicas da sequência no DNA. A descoberta das REases na década de 1970 levou ao desenvolvimento da tecnologia de DNA recombinante, e essas enzimas são agora ferramentas laboratoriais indispensáveis para modificação e manipulação genética¹. As REases do tipo II são as enzimas mais utilizadas nesta classe, pois clivam o DNA em um local fixo dentro ou perto de sua sequência de reconhecimento. No entanto, há uma grande variação entre as REases do Tipo II, e elas são divididas em vários subtipos com base em propriedades enzimáticas particulares, em vez de serem classificadas de acordo com suas relações evolutivas. Entre cada subtipo, há exceções frequentes ao esquema de classificação, e muitas enzimas pertencem a vários subtipos². Milhares de REases do Tipo II foram identificadas, e centenas delas estão disponíveis comercialmente.

No entanto, apesar da diversidade entre as REases do tipo II, muito poucas REases foram estudadas em detalhes. De acordo com o REBASE, o banco de dados de enzimas de restrição estabelecido por Sir Richard Roberts em 1975³, os dados cinéticos publicados estão disponíveis para menos de 20 dessas enzimas. Além disso, embora algumas REases tenham sido observadas diretamente no nível de molécula única enquanto se difundiam ao longo do DNA antes de encontrar e se ligar à sua sequência de reconhecimento 4,5,6,7, existem muito poucos estudos de molécula única de sua cinética de reação de clivagem. Os estudos existentes não relatam estatísticas adequadas para realizar uma análise detalhada da variação nos tempos em que ocorrem eventos de clivagem única ^8,9,10 ou não são capazes de capturar a distribuição completa dos tempos de clivagem¹¹. Esse tipo de análise pode revelar a presença de intermediários cinéticos de vida relativamente longa e pode levar a uma melhor compreensão dos mecanismos de clivagem do DNA mediada por REase.

No nível de uma única molécula, os processos bioquímicos são estocásticos - o tempo de espera para que uma única instância do processo ocorra, τ, é variável. No entanto, pode-se esperar que muitas medições de τ obedeçam a uma distribuição de probabilidade, p(τ), que é indicativa do tipo de processo que está ocorrendo. Por exemplo, um processo de etapa única, como a liberação de uma molécula de produto de uma enzima, obedecerá à estatística de Poisson, e p(τ) assumirá a forma de uma distribuição exponencial negativa:

onde β é o tempo médio de espera. Observe que a taxa do processo, k, será igual a 1/β, o inverso do tempo médio de espera. Para processos que requerem mais de uma etapa, p(τ) será a convolução das distribuições exponenciais únicas para cada uma das etapas individuais. Uma solução geral para a convolução de N funções de decaimento exponencial único com tempos de espera médios idênticos, β, é a distribuição de probabilidade gama:

onde Γ(N) é a função gama, que descreve a interpolação do fatorial de N-1 para valores não inteiros de N. Embora esta solução geral possa ser usada como uma aproximação quando os tempos médios de espera de etapas individuais são semelhantes, deve-se entender que a presença de etapas relativamente rápidas será mascarada por etapas com tempos de espera significativamente mais longos. Em outras palavras, o valor de N representa um limite inferior no número de etapas¹². Com um número adequado de medições de tempo de espera, os parâmetros β e N podem ser estimados agrupando os eventos e ajustando a distribuição gama ao histograma resultante ou usando uma abordagem de estimativa de máxima verossimilhança. Esse tipo de análise pode, portanto, revelar a presença de etapas cinéticas que não podem ser facilmente resolvidas em ensaios de conjunto e requer um grande número de observações para estimar os parâmetros com precisão^12,13.

Este artigo descreve um método para usar DNA marcado com pontos quânticos e microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRF) para observar centenas de eventos individuais de clivagem de DNA mediados por REase em paralelo. O design do ensaio torna possível agrupar os resultados de vários experimentos e pode criar distribuições de tempo de permanência contendo milhares de eventos. A alta fotoestabilidade e brilho dos pontos quânticos permitem uma resolução de tempo de 10 Hz sem sacrificar a capacidade de observar eventos de clivagem que ocorrem mesmo muitos minutos após o início do experimento. Boa resolução temporal e uma ampla faixa dinâmica, combinadas com a capacidade de coletar um grande conjunto de dados, permitem uma caracterização precisa das distribuições de tempo de permanência para descobrir a presença de múltiplas etapas cinéticas nas vias de clivagem das REases, que têm taxas de rotatividade na faixa de 1 ^min-1 . No caso do EcoRV, três etapas cinéticas podem ser resolvidas, todas identificadas por outros meios, confirmando que o ensaio é sensível à presença de tais etapas.

Os substratos de DNA duplex contendo a sequência de reconhecimento de interesse são produzidos pelo recozimento de um oligonucleotídeo biotinilado em uma fita complementar marcada com um único ponto quântico de nanocristal semicondutor covalentemente anexado. Esses substratos são introduzidos em um canal de fluxo construído sobre uma lamínula de vidro com um gramado de moléculas de polietilenoglicol (PEG) de alto peso molecular covalentemente ligadas à sua superfície. Os substratos de DNA são capturados por meio de uma ligação biotina-estreptavidina-biotina por uma fração das moléculas de PEG que possuem uma biotina em sua extremidade livre. Na microscopia TIRF, uma onda evanescente que decai exponencialmente com a distância da interface vidro-líquido fornece iluminação; A profundidade de penetração é da ordem do comprimento de onda da luz usada. Nessas condições, apenas os pontos quânticos que estão presos à superfície por uma molécula de DNA que foi capturada na superfície do vidro funcionalizado serão excitados. Os pontos quânticos que estão livres em solução não serão restringidos dentro da região iluminada e, portanto, não serão luminescentes. Se o DNA que amarra um ponto quântico à superfície for clivado, esse ponto quântico estará livre para se difundir para longe da superfície e desaparecerá da imagem de fluorescência.

Embora muitas REases Tipo II sejam conhecidas por se ligarem ao DNA na ausência de magnésio¹⁴, todas requerem magnésio para mediar a clivagem do DNA¹⁵. Essas REases podem se ligar ao DNA imobilizado na superfície na ausência de magnésio. Quando o tampão contendo magnésio flui através de um canal com REase pré-ligada ao DNA, a clivagem começa imediatamente, conforme indicado pelo desaparecimento dos pontos quânticos. A sincronização alcançada pela pré-ligação das moléculas de REase e, em seguida, iniciando a clivagem do DNA pela introdução de magnésio, facilita a medição do tempo de atraso até a conclusão da clivagem do DNA independentemente para cada molécula na população de enzimas observadas em um experimento. A fluoresceína é incluída como um corante marcador no tampão contendo magnésio para indicar a chegada do magnésio ao campo de visão. Como nenhuma enzima está incluída no tampão contendo magnésio, o tempo de atraso desde a chegada do tampão contendo magnésio até o desaparecimento de cada ponto quântico indica o tempo que leva para uma REase que já está ligada ao DNA clivar o DNA e liberar o ponto quântico da superfície do vidro. O desaparecimento do ponto quântico acontece rapidamente e resulta em uma diminuição acentuada na trajetória de intensidade, fornecendo uma indicação clara do tempo em que uma determinada molécula de DNA é clivada. A determinação dos tempos dos eventos é realizada pela análise matemática das trajetórias de intensidade, e um experimento típico resulta em centenas de eventos de clivagem identificáveis. Os resultados de vários experimentos podem ser agrupados para fornecer estatísticas adequadas para permitir a estimativa dos parâmetros, N e β, por análise de mínimos quadrados não lineares ou de máxima verossimilhança.

1. Informações gerais

1. Projeto de oligonucleotídeos
   NOTA: O substrato de DNA de 60 pares de bases (pb) de comprimento é formado por um par de oligonucleotídeos complementares com uma temperatura de fusão duplex de 75 ° C em 100 mM NaCl.
   1. Peça um oligonucleotídeo sintetizado com uma única modificação de biotina 5 'e o outro com uma modificação de tiol 5' (com um espaçador de seis carbonos). Coloque o local de reconhecimento no centro da região duplex.
      NOTA: As sequências de oligonucleotídeos para uso com EcoRV são mostradas abaixo (local de reconhecimento em negrito).
      5' biotina - AAA ACC GAC ATG TTG ATT TCC TGA AAC GGG ATA TCA TCA AAG CCA TGA ACA AAG CAG CCG - 3'
      5' thiol - CGG CTG CTT TGT TCA TGG CTT TGA TGA TAT CCC GTT TCA GGA AAT CAA CAT GTC GGT TTT - 3'
2. Use água ultrapura com resistividade de 18 MOhm para todas as etapas.
3. Proteja todas as soluções que contenham pontos quânticos da luz para evitar o fotobranqueamento.
4. Use uma fonte de ar comprimido para completar este protocolo.

2. Preparação de materiais de substrato de DNA marcados com pontos quânticos

NOTA: Além dos oligonucleotídeos descritos acima, consulte a Tabela de Materiais para outros materiais e a Tabela 1 para tampões necessários para a preparação de substratos de DNA marcados com pontos quânticos.

1. Reduza os grupos tióis 5' no oligonucleotídeo a ser acoplado a pontos quânticos.
   1. Ressuspender cada oligonucleótido tiolado em água a uma concentração de 100 μM.
   2. Pipetar 650 μL de água em uma coluna de rotação de exclusão de tamanho para cada amostra de oligonucleotídeo e vórtice por ~ 15 s. Deixe a coluna embalar por 30 min.
   3. Preparar uma solução fresca de ditiotreitol (DTT) a 100 mM imediatamente antes de cada utilização, uma vez que a DTT se degrada rapidamente na solução. Abra cuidadosamente um frasco contendo 7,7 mg de TDT e pipete 500 μL de tampão fosfato de sódio no frasco; vórtice para misturar completamente.
   4. Para cada oligonucleotídeo ressuspenso, prepare um novo tubo e adicione 50 μL do oligonucleotídeo e 50 μL de solução de DTT ao tubo. Pipet para cima e para baixo para misturar. Incubar por 30 min à temperatura ambiente para reduzir as ligações dissulfeto entre os grupos tióis oxidados na extremidade 5' dos oligonucleotídeos.
   5. Remova as tampas da coluna giratória e coloque cada coluna no tubo de coleta. Centrifugar as colunas de centrifugação a 750 × g durante 2 min e rejeitar o eluído.
   6. Transfira as colunas de centrifugação para tubos de centrífuga novos. Pipetar suavemente todo o volume (100 μL) de uma amostra de mistura de DNA/TDT em cada coluna preparada. Centrifugar a 750 × g durante 2 min e medir a absorvância do eluído a 260 nm para confirmar que a concentração é de aproximadamente 40 μM.
   7. Armazene todas as amostras que não serão utilizadas imediatamente a -20 °C para evitar a oxidação dos grupos tióis e a formação de ligações dissulfeto.
2. Acoplamento de DNA a pontos quânticos
   1. Pipetar uma alíquota de 50 μL do estoque de pontos quânticos em um dispositivo de diálise para cada construção a ser feita, certificando-se de não tocar na membrana com a ponta da pipeta. Dialisar contra um volume de tampão de ácido N-ciclohexil-2-aminoetanossulfônico (CHES) que seja pelo menos 1000x o volume da amostra com agitação a ~ 100 rpm por 15 min.
   2. Preparar uma solução nova de 6 mM de sulfosuccinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (sulfo-SMCC) em tampão CHES imediatamente antes de cada utilização. Abra cuidadosamente um frasco contendo 2 mg de sulfo-SMCC e pipete 800 μL de tampão CHES no frasco para injetáveis. Vórtice para misturar bem.
   3. Usando um pipetador, recupere cuidadosamente os pontos quânticos suspensos do dispositivo de diálise e transfira para um novo tubo contendo um volume igual da solução sulfo-SMCC; pipet para cima e para baixo para misturar. Incubar por 1 h em temperatura ambiente com agitação a 1000 rpm para permitir que o sulfo-SMCC reaja com as aminas primárias nos pontos quânticos.
   4. Usando um pipetador, transfira cuidadosamente cada amostra para um novo dispositivo de diálise. Para remover o excesso de sulfo-SMCC, dialise contra um volume de tampão CHES que seja pelo menos 1000x o volume contido no(s) dispositivo(s) de diálise, com agitação, por 15 min. Troque o tampão 2x e realize a diálise com tampão CHES novo 3x no total, permitindo que a diálise prossiga 15 minutos após cada troca de tampão.
   5. Para trocar o tampão em preparação para a segunda reação, transfira os dispositivos de diálise para um béquer contendo um volume de solução salina tamponada com fosfato (PBS) que seja pelo menos 1000x o volume contido no(s) dispositivo(s). Dialise com agitação por 15 min, troque o tampão 2x e faça diálise com PBS fresco 3x no total, permitindo que a diálise prossiga por 15 min após cada troca de tampão.
   6. Usando um pipetador, recupere cuidadosamente a solução contendo os pontos quânticos do(s) dispositivo(s) de diálise e transfira cada amostra para um novo tubo contendo uma quantidade equimolar de oligonucleotídeo tiolado diluído em PBS. Combine um volume igual de PBS e 1/10^do volume da amostra de oligonucleotídeo reduzida e purificada (concentração de aproximadamente 40 μM), pois a concentração de pontos quânticos neste ponto é de ~ 4 μM. Incubar por 2 h à temperatura ambiente, agitando a 1000 rpm.
   7. Adicione albumina de soro bovino (BSA, 10 mg / mL) a cada amostra para obter 0,5 mg / mL de concentração final de BSA. Usando um pipetador, transfira cuidadosamente cada amostra para um novo dispositivo de diálise e dialise contra um volume de tampão de armazenamento que seja pelo menos 1000x o volume contido no(s) dispositivo(s) de diálise. Troque o tampão 2x e realize a diálise com tampão de armazenamento fresco 3x no total, permitindo que a diálise prossiga por 15 minutos após cada troca de tampão.
   8. Recuperando cuidadosamente cada amostra, utilizando um pipetador, colocá-la num novo tubo e conservá-la a 4 °C.
      NOTA: Não armazene a -20 °C, pois os pontos quânticos são danificados pelo congelamento.
3. Recozimento de oligonucleotídeo marcado com pontos quânticos em oligonucleotídeo biotinilado
   1. Ressuspender cada oligonucleótido biotinilado em tampão de armazenamento a uma concentração de 100 μM. Armazenar as amostras não utilizadas a -20 °C.
   2. Combine uma amostra de oligonucleotídeo marcado com pontos quânticos com um excesso molar de 10 vezes de oligonucleotídeo biotinilado. Como a concentração estimada de DNA na amostra marcada com pontos quânticos é de 2 μM, adicione 0,2 μL de oligonucleotídeo biotinilado para cada 10 μL desta amostra.
   3. Aquecer a mistura num bloco de calor a 75 °C (temperatura de fusão para a região complementar). Mantenha nessa temperatura por 5 min. Desligue o bloco de calor e deixe esfriar lentamente. Armazenar a construção completa a 4 °C; Não congele.

3. Funcionalização superficial de lamínulas

NOTA: Este processo foi descrito anteriormente em outros protocolos de vídeo JoVE ^16,17. Este protocolo descreve uma versão adaptada do procedimento com pequenas alterações para acomodar uma lâmina de vidro menor. Consulte a Tabela de Materiais para outros materiais necessários para a funcionalização da superfície de lamínulas.

1. Coloque 5 lamínulas em cada porta-lamínulas. Certifique-se de pular um espaço entre cada par de lamínulas para que elas não grudem umas nas outras. Coloque as lamínulas em seu suporte em uma jarra com tampa, adicione etanol à jarra até que as lamínulas estejam cobertas e aperte bem a tampa. Coloque o frasco inteiro na água do sonicador do banho, sem submergi-lo completamente, e sonice por 30 min.
2. Encha um copo ou jarra limpa com água ultrapura. Use uma pinça de metal para remover as lamínulas do suporte do etanol e mergulhe-as em água para enxaguar. Em seguida, transfira as lamínulas e o suporte para um frasco contendo uma solução de hidróxido de potássio (KOH) 1 M. Aparafuse bem a tampa, coloque o frasco no banho do sonicador e sonice por 30 min.
   NOTA: Tenha cuidado ao manusear a solução de KOH, pois é corrosiva e irritante.
3. Repetir a sonicação em etanol e solução de KOH, lavando as lamínulas em água como acima descrito entre cada etapa.
4. Transfira as lamínulas em seu suporte para um frasco limpo cheio de acetona pura. Termine a limpeza sonicando o frasco conforme descrito acima por 30 min. Não enxágue com água após esta etapa.
5. Usando uma pinça de metal, transfira as lamínulas em seu suporte para um béquer limpo de 100 mL contendo 80 mL de acetona fresca e uma barra de agitação em microescala. Coloque o copo em uma placa de agitação magnética regulada para pelo menos 1.000 rpm. Enquanto a acetona está sendo agitada vigorosamente, pipete 1,6 mL de 3-aminopropiltrietoxissilano (APTES) no béquer para fazer uma solução a 2% v / v.
   NOTA: Tenha cuidado ao pipetar APTES, pois é corrosivo.
6. Deixe as lamínulas incubarem na solução por 2 min e, em seguida, use uma pinça de metal para transferir as lamínulas em seu suporte para um copo de água para extinguir a reação. Enxágue as lamínulas mais duas vezes, recolocando a água no copo.
7. Catalise o vidro silanizado no forno a 120 °C durante 75 min. Se não continuar para a próxima etapa imediatamente, armazene as lamínulas sob vácuo por no máximo alguns dias.
8. Dissolver os polietilenoglicóis (PEGs) derivados de éster de N-hidroxisuccinimida (NHS) em bicarbonato de sódio a 100 mM (pH 8,2). Use uma proporção de 10:1 de PEG terminado em metoxi para PEG terminado em biotina, com ~ 100 mg / mL de PEG terminado em metoxi.
9. Pipetar 100 μL da solução de PEG em metade das lamínulas silanizadas secas e cobrir cada uma com uma segunda lamínula. Use pequenos pedaços de parafilme colocados em cada canto como espaçadores para evitar que as lamínulas grudem umas nas outras.
10. Incube as lamínulas em um ambiente úmido por 3,5 h. Separe os sanduíches de lamínula. Use uma garrafa de esguicho para lavar cada lamínula com água abundante e seque com ar comprimido.
11. Armazene lamínulas funcionalizadas sob vácuo. Certifique-se de manter o lado tratado com PEG para cima, pois o outro lado não capturará o substrato de DNA.

4. Construção de dispositivos microfluídicos

NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para outros materiais necessários para a construção do dispositivo microfluídico.

1. Usando uma multiferramenta rotativa portátil equipada com uma broca de roda de ponta de diamante cônica, faça dois furos em cantos opostos da corrediça de quartzo para servir como entrada e saída. Certifique-se de prender o slide no lugar, lubrificar a broca e deslizar constantemente com água durante a perfuração. Após cada experimento, recupere a lâmina de quartzo preparada para reutilização, embebendo um dispositivo usado em acetona para dissolver o adesivo e o epóxi; descarte os componentes restantes.
   NOTA: A perfuração pode ser realizada manualmente, mas o uso de um suporte tipo prensa para a multiferramenta facilita o processo.
2. Combine 25 μL de solução de estreptavidina com 80 μL de PBS e 20 μL de tampão de bloqueio. Cubra uma lamínula tratada com PEG com esta mistura e incube em um ambiente úmido por 30 min.
3. Durante a incubação da lamínula, prepare o espaçador de imagem para criar um canal de fluxo. Corte um pedaço quadrado de 1 polegada de material espaçador de imagem e, em seguida, marque um canal de 2 mm de largura alinhado às extremidades dos orifícios perfurados na lâmina de quartzo (Figura 2). Corte o canal do material espaçador com um bisturi.
4. Retire um lado do suporte do espaçador de imagem e coloque-o cuidadosamente na lâmina de quartzo, tomando cuidado para não cobrir os orifícios de entrada e saída. Certifique-se de limpar bem a lâmina de quartzo com acetona para remover quaisquer restos de adesivo de experimentos anteriores.
5. Lave a lamínula com água e seque com ar comprimido. Remova o outro lado do suporte do espaçador de imagem e coloque-o entre a lâmina de quartzo e a lamínula funcionalizada revestida com estreptavidina, usando a pinça de plástico para pressionar o conjunto e remover as bolhas de ar do adesivo.
6. Insira um tubo de polietileno de 30 cm de comprimento em cada orifício da lâmina de quartzo. Certifique-se de cortar as extremidades do tubo em um ângulo para garantir o fluxo livre da solução. Use um suporte para tubos ou outro suporte para manter os tubos no lugar e vede os tubos no lugar e as bordas do dispositivo montado com epóxi.
   NOTA: Funciona bem construir o dispositivo em um pedaço de parafilme, que pode ser facilmente retirado da parte inferior quando o epóxi estiver endurecido.
7. Assim que o epóxi endurecer, insira a agulha romba da seringa vazia no tubo de saída do dispositivo e mergulhe a extremidade do tubo de entrada em um recipiente cheio de tampão de bloqueio. Puxe o êmbolo da seringa para trás para encher o dispositivo com tampão de bloqueio. Deixe o dispositivo incubar por pelo menos 30 minutos antes de usar.

5. Amarração de superfície de substrato de DNA marcado com pontos quânticos

NOTA: Além do dispositivo microfluídico, substrato de DNA e tampão de bloqueio descritos acima, consulte a Tabela de Materiais para outros materiais e a Tabela 1 para tethering de superfície de substratos de DNA marcados com pontos quânticos.

1. Prenda o dispositivo microfluídico à placa de platina do microscópio com fita adesiva, coloque a objetiva em contato com a parte inferior do dispositivo e posicione a objetiva de forma que o campo de visão esteja dentro do canal microfluídico.
2. Lave o canal microfluídico com tampão de bloqueio fresco puxando para trás o êmbolo da seringa depois de conectar o tubo de saída à bomba da seringa. Verifique se não há bolhas presas na tubulação ou no canal.
   NOTA: A partir deste ponto, certifique-se de que o tubo de entrada esteja em líquido para que nenhuma bolha de ar seja introduzida no dispositivo.
3. Diluir 1 μL do substrato de ADN preparado em 1 ml de tampão de bloqueio. Coloque o tubo de entrada no substrato de DNA diluído e flua 800 μL da solução de substrato através do canal a uma taxa de 200 μL / min. Deixe a solução de DNA incubar no canal sem perturbação por 15 minutos após a interrupção do fluxo.
4. Fluxo de pelo menos 800 μL de tampão de bloqueio através do canal a uma taxa de 200 μL/min para enxaguar o DNA não ligado para fora do canal.
5. Ajuste a potência do laser, o foco do microscópio e o ângulo TIRF para que os pontos quânticos conectados à superfície fiquem claramente visíveis.
   NOTA: Embora os pontos quânticos não branqueiem rapidamente, é melhor manter a potência o mais baixa possível para minimizar o piscar.

6. Clivagem de DNA mediada por REase

NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para materiais e a Tabela 1 para tampões necessários para clivagem de DNA mediada por REase.

1. Certifique-se de que a câmera esteja resfriada até a temperatura operacional ideal e configurada para streaming de alta velocidade com um tempo de exposição de 0,10 seg. Esteja preparado para coletar dados por ~4 min.
2. Lave o dispositivo microfluídico com 800 μL de tampão experimental sem magnésio a uma taxa de fluxo de 200 μL / min.
3. Adicionar a REase a uma alíquota (1 ml) de tampão experimental sem magnésio e misturar delicadamente por pipetagem. Use 4 μL de estoque de 100.000 unidades/mL, o que corresponde a 400 unidades/mL de EcoRV. Fluxo de 800 μL da enzima diluída através do canal a uma taxa de fluxo de 200 μL / min.
4. Iniciar a experiência com um tampão experimental contendo magnésio e fluoresceína a um caudal de 200 μl/min. Comece a capturar dados imediatamente após iniciar a bomba de seringa. Depois de fluir 800 μL de buffer, pare a aquisição de dados.

7. Análise dos dados

NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para o software de análise de dados usado para este protocolo e faça ajustes se estiver usando uma plataforma de análise diferente.

1. Determinação de ponto de tempo zero
   1. Subtraia a fluorescência de fundo de cada quadro do filme experimental usando a função imtophat , uma função de filtragem morfológica integrada na caixa de ferramentas de processamento de imagem. Selecione um disco com um raio de três pixels como elemento estruturante. Obtenha a intensidade do plano de fundo subtraindo a imagem filtrada da imagem original.
      NOTA: O filtro retém apenas os recursos da imagem mais brilhantes que o plano de fundo e menores que o elemento estruturante.
   2. Calcule a média do plano de fundo subtraído em cada quadro do filme. Use uma trajetória desse valor para determinar o ponto de tempo zero para o experimento (Figura 3A). Determine a hora de início encontrando o primeiro quadro no qual a taxa de aumento excede 3x o desvio padrão da taxa de mudança durante o fluxo de volume morto.
      NOTA: Um aumento acentuado na taxa de variação do valor médio do fundo subtraído para cada quadro de filme indica o momento em que o tampão experimental final contendo o corante traçador entrou na célula de fluxo (Figura 3B).
2. Cálculo e análise da trajetória de intensidade de pontos quânticos
   1. Calcule uma projeção de intensidade máxima para o conjunto de quadros de filme corrigidos pelo fundo gravados antes da chegada do corante traçador. Determine as localizações dos pontos quânticos com precisão de um pixel nesta imagem de projeção usando uma função de localização de pico, como pkfnd.
   2. Gere trajetórias de intensidade para pontos quânticos individuais calculando a intensidade média em cada quadro de filme de uma região quadrada de três pixels por lado ao redor do local retornado pela função de localização de pico.
      NOTA: A correção de fundo descrita acima remove os artefatos introduzidos pelo corante traçador. As trajetórias de intensidade resultantes devem ser relativamente planas, mas ainda incluir flutuações de intensidade que ocorrem naturalmente (Figura 4).
   3. Identifique eventos de desaparecimento de pontos quânticos por meio de análise estatística das trajetórias de intensidade. Para cada trajetória de intensidade de ponto quântico, calcule uma intensidade limite que esteja acima do valor mínimo por uma fração apropriada da diferença entre os valores máximo e mínimo para essa trajetória, dependendo do ruído observado nas trajetórias.
      NOTA: A flutuação de intensidade do ponto quântico é normalmente muito maior do que a flutuação de fundo. Um valor apropriado pode ser determinado comparando esses valores: o limite selecionado deve ser maior que o valor de fundo mais alto, mas idealmente menor que o valor mais baixo para fluorescência de pontos quânticos. Para os dados apresentados, o limiar utilizado foi calculado acima do valor mínimo para cada trajetória mais um terço da diferença entre os valores máximo e mínimo para essa trajetória. Um ponto quântico pode ser considerado como desaparecendo no último ponto de tempo em que a intensidade observada em sua localização estava acima desse limite.
   4. Confirme eventos de desaparecimento putativos. Incluir eventos na análise final apenas se a intensidade observada estiver acima do ponto médio entre os valores de intensidade mínima e máxima para a trajetória para mais da metade dos quadros do filme antes do momento do desaparecimento e o desvio-padrão da trajetória de intensidade diminuir após o evento.
      NOTA: Outros testes estatísticos podem ser empregados para garantir que apenas eventos de desaparecimento válidos sejam registrados.

A célula de fluxo é acoplada diretamente a uma objetiva de ampliação de 60x de imersão em óleo de alta abertura numérica em um microscópio invertido equipado com iluminação a laser para imagens TIRF através da objetiva (Figura 5A). Depois de introduzir o substrato de DNA e lavar o excesso de DNA e pontos quânticos, normalmente existem milhares de pontos quânticos individuais em um campo de visão (Figura 5B). Esses pontos quânticos são fixados de forma estável à superfície do vidro e não sofrem escurecimento perceptível ou branqueamento significativo ao longo da escala de tempo do experimento. No entanto, se um tampão contendo magnésio e uma REase apropriada fluir através do canal de fluxo, no final de um período típico de observação de quatro minutos, pelo menos 30% dos pontos quânticos presentes no início de um experimento terão desaparecido do campo de visão. Confirmando a necessidade de magnésio, quando a REase é fluída através do canal na ausência de magnésio, pelo menos 95% dos pontos quânticos presentes no início do experimento ainda podem ser vistos no final do período de observação (Figura 5C). No entanto, quando o tampão contendo magnésio flui imediatamente após permitir que a REase se ligue ao DNA ligado à superfície na ausência de magnésio, até metade dos pontos quânticos terá desaparecido até o final do período de observação (Figura 5D), semelhante ao que é observado quando a REase e o magnésio fluíram juntos através do canal. O rendimento exato dos eventos dependerá da eficiência da enzima nas condições utilizadas. Quando o tampão contendo magnésio é fluído sem ter introduzido previamente a REase apropriada no canal de fluxo, menos de 5% dos pontos quânticos desaparecem durante o período de observação e não há pico discernível para um histograma dos eventos. Este resultado indica que as moléculas REase pré-ligadas medeiam a clivagem do DNA que amarra os pontos quânticos à superfície do vidro, e essa clivagem de DNA é responsável pela grande maioria dos eventos de desaparecimento de pontos quânticos observados nesses experimentos.

O desaparecimento do ponto quântico acontece rapidamente e resulta em uma diminuição acentuada na trajetória de intensidade, fornecendo uma indicação clara do momento em que uma determinada molécula de DNA é clivada (Figura 5E). A determinação dos tempos de eventos é realizada pela análise matemática das trajetórias de intensidade. Pontos quânticos únicos geram trajetórias de intensidade com variância significativamente maior do que o plano de fundo nas condições de imagem usadas, portanto, eventos putativos são confirmados quando a variância da trajetória de intensidade diminui para um nível comparável à variância do plano de fundo após a queda de intensidade observada. Além disso, as trajetórias que incluem um grande grau de piscar antes de um suposto evento de desaparecimento são excluídas da análise final. No entanto, um experimento típico resulta em centenas de eventos que atendem a esses critérios, e os resultados de vários experimentos podem ser agrupados para fornecer estatísticas adequadas para permitir a estimativa dos parâmetros N e β por ajuste de curva de mínimos quadrados não lineares ou estimativa de parâmetro de máxima verossimilhança.

Os dados representativos apresentados foram coletados realizando este experimento com a REase Tipo IIP bem estudada, EcoRV (Vídeo 1). O substrato de DNA duplex de 60 pb de comprimento é construído com uma molécula de biotina na extremidade 5 'de uma fita do duplex e um ponto quântico covalentemente ligado à extremidade 5' da outra fita. O substrato de DNA contém uma única cópia da sequência de reconhecimento, GAT↓ATC, que é clivada por EcoRV no meio, conforme indicado pela seta para baixo (↓). O EcoRV foi pré-ligado ao substrato de DNA na ausência de magnésio e, em seguida, o tampão contendo magnésio foi fluído para iniciar a clivagem do DNA. Os dados representativos incluem os resultados agrupados de cinco experimentos separados, produzindo um total de 3451 eventos de clivagem observados. Depois de excluir eventos que ocorreram antes do ponto de tempo zero ou fora do pico de atividade proeminente, 2987 eventos permaneceram, o que foi suficiente para preencher um histograma com compartimentos de um segundo. Tanto o ajuste de curva de mínimos quadrados não lineares quanto a estimativa de parâmetros de máxima verossimilhança foram usados para extrair os valores de N e β dos dados. Os dois métodos de estimação dos parâmetros foram concordantes (Figura 6A), com N = 3,52 (intervalo de confiança de 95%: 3,32-3,71) e β = 5,78 s (intervalo de confiança de 95%: 5,41-6,15 s) para o ajuste não linear dos mínimos quadrados e N = 3,41 (intervalo de confiança de 95%: 3,25-3,58) e β = 6,06 s (intervalo de confiança de 95%: 5,75-6,39 s) para a estimativa de máxima verossimilhança.

A estimativa de pelo menos três etapas cinéticas é razoável, dado o que se sabe sobre o mecanismo do EcoRV. Sabe-se que esta enzima se liga ao DNA de forma não específica na ausência de magnésio¹⁴. As observações da fase de solução a granel das mudanças na fluorescência intrínseca dos resíduos de triptofano no EcoRV sob condições de fluxo interrompido sugeriram que o EcoRV que se ligou ao DNA na ausência de magnésio deve sofrer uma mudança conformacional antes da entrada do magnésio no sítio ativo¹⁸. Esta observação é corroborada por dados de estrutura cristalina¹⁹. Os resultados dos estudos de fluorescência do triptofano também indicam que a clivagem do DNA e a liberação do produto são etapas separadas que ocorrem com taxas semelhantes¹⁸. Portanto, um mecanismo de reação razoável para clivagem de DNA mediada por EcoRV neste experimento é:

ES → ES* → EP → E+P

Nesse mecanismo, o ES, o complexo enzima-substrato inicial, é formado quando o EcoRV é pré-ligado ao DNA na ausência de magnésio. Quando o magnésio entra na célula de fluxo, o complexo enzima-substrato sofre uma mudança conformacional para se tornar ES*, o complexo enzima-substrato ativado. Este complexo ativado então cliva o DNA, mas não libera imediatamente as moléculas do produto, tornando-se um complexo enzima-produto (EP). Finalmente, o produto, P, é liberado na etapa final. Esse mecanismo requer três etapas, o que está de acordo com os dados apresentados. A estimativa resultante para o tempo médio de espera para cada etapa é de ~ 6 s, equivalente a uma taxa de 0,17 ^s-1 para cada etapa. Este cálculo está de acordo geral com as estimativas anteriores das taxas para esses processos - na ordem de 0,3-0,4 ^s-1 para clivagem de DNA e liberação de produto e ~ 0,5 ^s-1 para o rearranjo conformacional.

Figura 1: Esquema de reação de DNA e enzima marcado. As moléculas de DNA marcadas com pontos quânticos são amarradas à superfície do vidro funcionalizada por meio da ligação biotina-estreptavidina-biotina e observadas usando microscopia TIRF. As moléculas de DNA contêm o local de reconhecimento para a REase de interesse. Quando uma molécula de DNA é clivada pela REase, o ponto quântico fica livre para se difundir para longe da superfície e para fora da zona de iluminação. Abreviaturas: REase = endonuclease de restrição; PEG = polietilenoglicol; TIRF = fluorescência de reflexão interna total. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Dispositivo de célula de fluxo microfluídico. (A) Vista explodida mostrando as três camadas usadas para criar o dispositivo: a lamínula de vidro funcionalizada na parte inferior, a lâmina de quartzo com orifícios de entrada e saída na parte superior e o espaçador de imagem adesiva de dupla face com um canal cortado no meio. (B) Um dispositivo completo com tubos de polietileno selados no lugar e com bordas revestidas com epóxi. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Determinação de ponto de tempo zero. (A) Intensidade média de fundo determinada usando a função de filtragem morfológica de cartola em cada quadro do filme. A intensidade de fundo aumenta acentuadamente quando o tampão experimental contendo fluoresceína entra no campo de visão. Os resultados de três experimentos diferentes são mostrados aqui. Há uma variação substancial no tempo de atraso de experimento para experimento. (B) O aumento acentuado na taxa de mudança da trajetória da intensidade de fluorescência de fundo facilita a determinação precisa do ponto de tempo zero. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Correção de fundo. O aumento na intensidade de fundo devido ao corante traçador de fluoresceína indicando a chegada de magnésio pode ser visto nas trajetórias de intensidade de fluorescência bruta para pontos quânticos individuais (trajetória cinza). Depois de subtrair o fundo usando a função de filtragem morfológica da cartola, os artefatos introduzidos pelo corante traçador foram removidos da trajetória (trajetória preta). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Experimento TIRF de molécula única para observações paralelizadas de eventos de clivagem de DNA. (A) Uma célula de fluxo construída em uma superfície de vidro funcionalizada projetada para capturar DNA marcado com pontos quânticos é diretamente acoplada a uma objetiva de microscópio de imersão em óleo de alta abertura numérica de 60x para imagens TIRF. (B) Imagem representativa do início de um experimento. O DNA marcado com pontos quânticos foi carregado na célula de fluxo e o excesso de pontos quânticos não ligados foi lavado. Pontos quânticos individuais ligados ao DNA podem ser resolvidos uns dos outros. (C) O mesmo campo de visão após o tampão contendo uma REase capaz de clivar as amarras de DNA foi fluído através do canal de fluxo na ausência de magnésio por quatro minutos. Não houve perda significativa de pontos quânticos amarrados ao DNA. (D) O mesmo campo de visão na conclusão de um experimento. O tampão contendo magnésio fluiu através do canal de fluxo imediatamente após o fluxo de REase em um tampão livre de magnésio. Esta imagem foi adquirida após aproximadamente quatro minutos de fluxo tampão. As REases pré-ligadas clivaram muitas das amarras do DNA, liberando os pontos quânticos da superfície. Para facilitar a visualização, apenas o quadrante central do campo de visão objetivo é mostrado em cada imagem. Dez quadros de filme (equivalente a um segundo de tempo de observação) foram calculados para diminuir os efeitos do piscar de pontos quânticos. As configurações de brilho e contraste são idênticas para todas as três imagens. (E) Trajetórias representativas de intensidade de fluorescência de locais de imagem onde um ponto quântico estava presente no início do experimento. As trajetórias obtidas a partir de locais de imagem correspondentes a pontos quânticos que não são liberados da superfície (cinza) podem exibir breves quedas para um nível de intensidade mais baixo, mas começam e terminam em um nível de intensidade alto. As trajetórias obtidas a partir de locais de imagem, correspondentes a pontos quânticos que são liberados da superfície (preto), exibem uma rápida diminuição na intensidade para um nível de fundo baixo que é instantâneo em relação à resolução de tempo do experimento (10 Hz). Os pontos quânticos liberados não reaparecem dentro do período de observação de quatro minutos. Abreviaturas: REase = endonuclease de restrição; TIRF = fluorescência de reflexão interna total. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Análise da distribuição do tempo de permanência da clivagem de DNA mediada por EcoRV. (A) Histograma e envelopes previstos para os 2987 eventos de clivagem que ocorrem dentro do pico de atividade principal em um conjunto de cinco experimentos agrupados com EcoRV. As duas curvas previstas são quase idênticas e os resíduos de ajuste (abaixo do histograma) não indicam erro sistemático no ajuste de mínimos quadrados não lineares. (B) Histograma de todo o conjunto de 3393 eventos de clivagem que ocorreram após o ponto de tempo zero. A curva prevista pela estimativa de máxima verossimilhança dos parâmetros (linha ininterrupta, curva MLE) assumindo uma distribuição de probabilidade gama não inclui o histograma. A curva prevista por um ajuste não linear de mínimos quadrados da fórmula para a distribuição de probabilidade gama para as alturas dos compartimentos (linha tracejada, curva NLS) é superior, mas os resíduos do ajuste (abaixo do histograma) revelam erro sistemático. Abreviaturas: MLE: estimativa de máxima verossimilhança; NLS = mínimos quadrados não lineares. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Tabela de Buffers.

Vídeo 1: Exemplo de filme de molécula única. Clique aqui para baixar este vídeo.

O substrato de DNA para este ensaio é marcado com um ponto quântico usando um esquema de reação em duas etapas usando sulfo-SMCC. Este reticulador bifuncional consiste em uma porção éster NHS que pode reagir com uma amina primária e uma porção maleimida que pode reagir com um grupo sulfidrila²⁰. Os oligonucleotídeos tiolados usados para preparar o substrato são enviados em sua forma oxidada. É importante reduzi-los e purificá-los, conforme descrito, antes de prosseguir com o procedimento de acoplamento, ou a eficiência da reação de acoplamento será reduzida. É fundamental preparar novas soluções de TDT e sulfo-SMCC imediatamente antes do uso. Essas moléculas hidrolisam rapidamente em solução aquosa. Tenha cuidado ao transferir soluções para dentro e para fora dos dispositivos de diálise - se a ponta da pipeta tocar a membrana, causará uma ruptura e a amostra será perdida. É ideal concluir todas as etapas da seção 2 sem interrupção para evitar a perda de amostra.

A reação de acoplamento usada para gerar o oligonucleotídeo marcado com pontos quânticos é ineficiente. Depois de combinar e recozer o oligonucleotídeo marcado com ponto quântico com o oligonucleotídeo biotinilado, haverá excesso de DNA não marcado presente na amostra de substrato preparada. Embora essas espécies possam se ligar à superfície funcionalizada, elas não são visíveis nas condições de imagem recomendadas e não contribuem para a leitura do experimento. Para confirmar que a clivagem da construção concluída resulta na liberação de pontos quânticos da superfície, realize a amarração da superfície conforme descrito na seção 5 do protocolo e crie uma imagem de uma região da superfície para determinar quantos pontos quânticos estão presentes. Em seguida, flua 800 μL de uma alíquota de 1 mL de 10 U / mL de DNase I em tampão DNase (2,5 mM MgCl₂; 10 mM Tris-HCl; 0,1 mM CaCl₂, pH 7,6) através do canal microfluídico. Deixe a DNase I incubar no canal por 15 min, lave com 800 μL de tampão DNase (sem enzima) e obtenha imagens da mesma região de interesse. Aproximadamente 90% dos pontos quânticos devem ser liberados da superfície se a construção e a superfície estiverem devidamente preparadas.

Para anexar covalentemente uma mistura de moléculas de PEG terminadas em metoxi e terminadas em biotina, as superfícies de vidro devem ser tratadas para capturar o substrato de DNA marcado com pontos quânticos na superfície para geração de imagens. É extremamente importante realizar todas as etapas de limpeza com rigor. Várias etapas de limpeza são necessárias para remover as impurezas da superfície e expor os grupos hidroxila na superfície do vidro que reagirão com os grupos alcoxi no silano para formar ligações covalentes. Embora seja importante enxaguar as lâminas com água ultrapura entre as etapas de limpeza usando etanol e soluções de KOH, nenhuma água deve ser usada após a limpeza final com acetona. A presença de excesso de água durante a etapa de silanização incentivará a multimerização do silano em solução às custas da ligação da superfície. Além disso, a solução de silano não deve ser preparada com antecedência. Para prolongar sua vida útil, o estoque de silano deve ser armazenado em um gabinete de dessecador.

O ensaio de clivagem de molécula única foi projetado para ser realizado em um dispositivo microfluídico (Figura 2). Fabrique um novo dispositivo antes de cada experimento, reutilizando a lâmina de quartzo perfurada que forma a parte superior do dispositivo. Esse procedimento foi descrito anteriormente^16,17 e suas variações são amplamente utilizadas para microscopia TIRF. O procedimento aqui descrito foi adaptado para acomodar lâminas quadradas de 1 polegada. É importante trabalhar rapidamente para construir o dispositivo para que a superfície funcionalizada não se degrade enquanto estiver exposta ao ar. O epóxi é fluorescente, portanto, tome cuidado para evitar cobrir o canal com ele. A lâmina de quartzo perfurada pode ser recuperada para reutilização embebendo o dispositivo usado em acetona e desmontando-o.

Este ensaio foi projetado para ser realizado em um microscópio invertido que possui recursos de iluminação de reflexão interna total objetiva equipados com uma câmera de dispositivo de carga acoplada multiplicadora de elétrons (EMCCD) para coleta de dados. Use uma objetiva de alta abertura numérica de 60x e uma fonte de excitação de laser de 488 nm e use um cubo de filtro que inclua um filtro de emissão passa-banda única e um dicróico de borda única adequado para o laser, e um filtro de emissão que permita a passagem da fluorescência dos pontos quânticos (pico de emissão em 655 nm) e pelo menos parte da fluorescência da fluoresceína (pico de emissão em 512 nm). Por exemplo, os dados apresentados aqui foram coletados com um cubo de filtro equipado com um filtro de excitação passa-banda única de 482/18 nm, um dicróico de borda única de 488 nm e um filtro de emissão passa-banda única de 675/67 nm. O ensaio pode ser realizado por imagem em um único canal espectral, conforme descrito neste protocolo. Se desejado, o ensaio também pode ser realizado dividindo a imagem de fluorescência em dois canais espectrais, um para os pontos quânticos e outro para a emissão de fluoresceína. Um divisor de imagem equipado com um espelho dicróico de borda única de 640 nm seria apropriado para esse fim. No entanto, a imagem multicanal não é necessária.

É importante lavar quaisquer substratos de DNA não amarrados do canal antes de iniciar o experimento. A fluoresceína é incluída em uma concentração de 50 μM no tampão final para sinalizar a chegada do magnésio ao campo de visão. Dependendo da configuração do microscópio, pode ser necessário ajustar a concentração de fluoresceína para que sua emissão não obscureça os pontos quânticos. Certifique-se de começar a adquirir dados imediatamente após iniciar o fluxo do tampão contendo magnésio. Registar os dados durante o tempo de desfasamento antes da chegada do tampão contendo magnésio, de modo a que a média e o desvio-padrão da taxa de variação da intensidade de fundo possam ser calculados para facilitar a determinação precisa do ponto de tempo zero. Observe que o ponto de tempo zero mais preciso é o primeiro quadro no qual a taxa de variação da fluorescência de fundo excede as flutuações naturais nesta medição. A intensidade da fluorescência de fundo continua a aumentar após este ponto, à medida que a fluoresceína se difunde através da camada limite estabelecida pelo fluxo laminar no canal. O magnésio, que é muito menor que a fluoresceína, difunde-se mais rapidamente e pode-se esperar que sua concentração atinja o equilíbrio muito mais rapidamente.

Para os dados de exemplo apresentados, um histograma de todos os 3393 eventos que ocorreram após o ponto de tempo zero exibe um pico proeminente nos primeiros 60 s dos experimentos. Muitos compartimentos correspondentes a tempos de retardo mais longos não contêm eventos, e os compartimentos que contêm eventos contêm apenas alguns, semelhante ao que é observado quando nenhum REase ativo está presente. Um ajuste não linear da curva de mínimos quadrados da distribuição de probabilidade gama para todos os dados agrupados resultou em estimativas de parâmetros de N = 3,06, com um intervalo de confiança de 95% de 2,94-3,18, e β = 7,04 s, com um intervalo de confiança de 95% de 6,72-7,36 s. No entanto, as estimativas de máxima verossimilhança para os parâmetros foram N = 1,30 (intervalo de confiança de 95%: 1,24-1,35) e β = 26,7 s (intervalo de confiança de 95%: 25,3-28,1 s) e, por inspeção visual, a curva prevista pela estimativa do parâmetro de máxima verossimilhança não corresponde bem aos dados (Figura 6B). Além disso, embora a curva prevista pelos parâmetros estimados pelo ajuste de mínimos quadrados não lineares siga a forma do histograma das frequências de eventos observados relativamente bem, os resíduos (diferença entre as frequências de eventos observados e previstos) tornam-se consistentemente positivos para pontos de tempo além de cerca de 60 s (Figura 6B).

Como a frequência de eventos nos pontos de tempo posteriores é comparável à frequência de desaparecimento de pontos quânticos observada na ausência de enzima ativa, a maioria desses eventos posteriores provavelmente faz parte de um baixo nível de fundo de perda de pontos quânticos que não é causada por clivagem de DNA mediada por REase. Por conseguinte, é razoável excluir esses contentores da montagem. Quando todos os eventos que ocorreram mais de 60 s após o ponto de tempo zero de cada experimento foram excluídos, os dois métodos de estimativa de parâmetros estavam de acordo (Figura 6A). Portanto, para obter as melhores estimativas de parâmetros, exclua eventos fora do pico de atividade e confirme se a estimativa do parâmetro de máxima verossimilhança e os resultados de ajuste da curva de mínimos quadrados não lineares convergiram.

A abordagem experimental descrita neste artigo permite observações em tempo real da clivagem do DNA mediada por REase no nível de molécula única. Centenas de eventos podem ser observados em cada experimento individual, e os resultados de vários experimentos podem ser agrupados para obter o grande número de observações necessárias para caracterizar a distribuição dos tempos de espera, ajustando os dados à distribuição de probabilidade gama. Embora este ensaio só possa ser usado conforme descrito com REases que se ligam, mas não clivam o DNA na ausência de magnésio ou outro cofator, muitas REases se enquadram nessa categoria. É importante reconhecer que os detalhes exatos de todas as etapas intermediárias não serão revelados por este ensaio. Etapas significativamente mais rápidas do que a etapa de limitação de taxa não afetarão a distribuição do tempo de permanência e não figurarão no valor de N extraído dos dados¹². Da mesma forma, o valor de β que pode ser extraído dos dados é uma média aproximada do tempo de espera para as etapas que afetam a distribuição do tempo de permanência. O tempo de espera real para cada etapa pode variar do valor de β¹². No entanto, o ensaio de clivagem de molécula única descrito neste artigo pode fornecer evidências da presença de várias etapas intermediárias ao longo da via da reação, mesmo que os próprios intermediários da reação não possam ser observados diretamente.

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes ou outros conflitos de interesse

Este trabalho foi apoiado pelo Prêmio Número K12GM074869 para CME do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais ou dos Institutos Nacionais de Saúde.