Method Article
Este modelo animal permite que os investigadores induzam o linfedema secundário estatìstica significativo no retrospecto dos ratos, durando pelo menos 8 semanas. O modelo pode ser usado para estudar a fisiopatologia do linfedema e para investigar novas opções de tratamento.
Os modelos animais são de suma importância na pesquisa do linfedema, a fim de compreender a fisiopatologia da doença, mas também para explorar potenciais opções de tratamento. Este modelo do rato permite que os investigadores induzam o linfedema significativo que dura pelo menos 8 semanas. O linfedema é induzido usando uma combinação de radioterapia fracionada e ablação cirúrgica de linfáticos. Este modelo exige que os ratos recebem uma dose de 10 cinza (Gy) radiação antes e depois da cirurgia. A parte cirúrgica do modelo envolve a ligadura de três vasos linfáticos e extração de dois gânglios linfáticos do membro posterior do rato. Ter acesso a ferramentas microcirúrgicas e um microscópio é essencial, devido às pequenas estruturas anatômicas dos camundongos. A vantagem deste modelo é que ele resulta em linfedema estatisticamente significativo, o que fornece uma boa base para avaliar diferentes opções de tratamento. É também uma opção grande e facilmente disponível para o treinamento microcirúrgico. A limitação deste modelo é que o procedimento pode ser demorado, especialmente se não for praticado com antecedência. O modelo resulta em linfedema objetivamente quantificável em camundongos, sem causar morbidade grave e foi testado em três projetos separados.
O linfedema é caracterizado por um acúmulo de líquido linfático que leva ao inchaço do tecido localizado, que ocorre principalmente devido ao fluxo prejudicado ou interrompido de fluido linfático nos vasos linfáticos1. O fluxo linfático pode ser prejudicado ou interrompido por infecção, obstrução, lesão ou defeitos congênitos no sistema linfático2. Essas etiologias resultam em acúmulo de líquido linfático, o que leva a um estado crônico de inflamação, resultando em fibrose subseqüente, bem como a deposição do tecido adiposo3. O linfedema pode ser categorizado como linfedema primário ou secundário. O linfedema primário é causado por anormalidades no desenvolvimento ou mutação genética2,4. O linfedema secundário ocorre devido à doença sistêmica subjacente, cirurgia ou trauma2,4. Linfedema secundário é a forma mais comum de linfedema no mundo2. Nos países desenvolvidos, a causa mais comum do linfedema secundário é a terapia oncológica, como radioterapia adjuvante e dissecção do nóde linfático5. O linfedema é mais frequente entre os pacientes com câncer de mama, mas também pode se desenvolver em pacientes com câncer ginecológico, melanoma, genitourinário ou pescoço6. Tem sido sugerido que de todas as mulheres diagnosticadas com câncer de mama, 21% desenvolverão linfedema7.
Linfedema pode ser estressante para o paciente física e psicologicamente. Pacientes com linfedema têm um risco aumentado de infecção5,8,9, má qualidade de vida e podem desenvolver ansiedade social e sintomas de depressão10. As complicações do linfedema crônico levam ao alto custo dos cuidados e ao aumento da carga da doença9,11. Os resultados também sugeriram que o linfedema pode estar associado ao aumento do risco de morte após o tratamento do câncer de mama12. A gerência conservadora tal como a compressão da área afetada, a drenagem manual do linfa e o skincare geral permanecem a primeira aproximação da linha. Atualmente não há tratamento curativo6. Embora o progresso foi feito no campo da terapia cirúrgica e médica, há ainda um quarto para a melhoria. Mais pesquisa, fornecendo a introspecção na fisiopatologia e progressão da doença, é necessário permitir clínicos de fornecer melhores opções do tratamento para os pacientes5.
Modelos animais estão sendo usados em pesquisas pré-clínicas para entender a fisiopatologia de doenças e desenvolver opções potenciais de tratamento. Vários modelos animais linfedemos diferentes foram estabelecidos em caninos13,14,coelhos15,ovelhas16,porcos17,18 e roedores19,20, 21,22,23,24. O modelo de roedores parece ser o modelo mais econômico, ao investigar a reconstrução da função linfática, devido a roedores serem facilmente acessíveis e relativamente de baixo preço25. A maioria dos modelos de camundongos se concentraram em induzir linfedema na cauda dos camundongos21,22,23. O modelo da cauda é muito de confiança mas a técnica cirúrgica exata para induzir o linfedema varia significativamente no material publicado precedente. Isso resulta em flutuações de duração e robustez do linfedema desenvolvido apresentado sapateado conhecido25. Diferentes técnicas também estão sendo usadas para induzir linfedema no modelo de membros posteriores e também produzem resultados variados, mas o modelo de membros posteriores pode ser mais fácil de entender de uma perspectiva translacional. Modelos anteriores de linfedema foram prejudicados pela resolução espontânea do linfedema e, portanto, um modelo de linfedema reproduzível e permanente é necessário25. Os investigadores têm tentado previamente aumentar a dose da radiação, para impedir a definição espontânea do linfedema, mas esta conduziu frequentemente à morbosidade severa subseqüente25.
Este modelo resulta em linfedema estatisticamente significativo, sem causar morbidade grave, combinando microcirurgia com radiação. O modelo foi revisado a partir de um modelo cirúrgico anterior, adicionando uma dose de irradiação que induz o linfedema, sem causar morbidade grave26. Ele também oferece uma grande oportunidade para o treinamento microcirúrgico. É necessário ter acesso a equipamentos microcirúrgicos e microscópio, devido às pequenas estruturas anatômicas dos camundongos. O procedimento cirúrgico pode ser realizado quando o usuário foi ensinado técnicas microcirúrgicas básicas, como a sutura com instrumentos microcirúrgicos. Os operadores que realizaram este procedimento assistiram a vídeos tutoriais de Acland sobre as pré-condições de habilidades microcirúrgicas (1981) e técnica de microssutura básica (1985). Recomendamos a prática do procedimento cirúrgico 8 a 10 vezes antes de usá-lo em pesquisa. A prática do procedimento garante que menos erros sejam cometidos e que o procedimento possa ser realizado de forma mais eficiente. Quando dominado, o procedimento cirúrgico pode ser realizado em 45 minutos.
Os animais foram alojados na Universidade do Sul da Dinamarca Animal Care Facility de acordo com as orientações institucionais. Todos os procedimentos que envolvem indivíduos animais foram aprovados pela Inspecção de Experiências Animais, Ministério do Ambiente e Alimentação da Dinamarca.
1. Irradiação pré-cirurgia
NOTA: A irradiação pré-cirurgia ocorre 7 dias antes da cirurgia.
2. Configuração de equipamento
NOTA: A cirurgia deve ser realizada em uma sala dedicada aos procedimentos cirúrgicos. A superfície operativa deve ser estéril.
3. Preparação
4. Cirurgia
NOTA: Neste exemplo, o membro traseiro esquerdo (quando o mouse é visto na posição supina), foi escolhido para o procedimento.
5. Cuidados pós-operatórios
6. Irradiação pós-cirurgia
Este procedimento foi usado previamente em três experiências separadas. Todos os experimentos foram feitos por diferentes investigadores principais que todos são co-autores deste artigo. Em todos os três experimentos, foi tomado grande cuidado para aderir ao mesmo procedimento descrito neste protocolo. Em todos os três experimentos, o linfedema secundário foi induzido em um membro posterior, enquanto o outro membro posterior serviu como controle. Os volumes dos membros posteriores foram o principal resultado em todos os três experimentos. A figura 1 ilustra o projeto do estudo.
Todos os camundongos foram submetidos a tomografia microcomputadorizada (μCT) nas semanas seguintes à cirurgia para medir o volume dos membros posteriores. As varreduras μCT foram realizadas em um scanner pré-clínico multimodalidade(Tabela de Materiais)e o volume dos membros posteriores foi medido através da função de região de interesse (ROI) no software associado, conforme descrito anteriormente26. A articulação distal tibiofibular foi localizada em imagens axonais tridimensionais (3D) usando um método previamente descrito27. O ROI começou na articulação tibiofibular distal e incluiu todo o tecido distal a esse ponto. A escala de Hounsfield para a análise foi ajustada a -500 a 4000.
Todos os dados foram analisados por meio de software estatístico(Tabela de Materiais). O teste de comparação múltipla de Sidak foi usado para comparar o volume do retrospectlimb induzido do linfedema, com o retrospecto do controle. Uma diferença significativa entre o membro traseiro controle e o membro do linfoma é definida como um valor P <0.05.
Figura 1: Projeto do estudo e pontos de tempo para medidas do resultado. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
O experimento 126 incluiu 32 camundongos distribuídos em grupos de quatro. Um dos objetivos foi estudar várias doses diferentes de radiação e encontrar a dose mais preferível, para induzir linfedema duradouro sem causar morbidade grave. O grupo que recebeu duas doses de 10 irradiação Gy incluiu quatro camundongos. A figura 2 mostra que um estado consistente de linfedema foi alcançado em todas as 8 semanas. A tabela 1 mostra que houve uma diferença significativa no volume entre o membro do linfoluz e o membro traseiro do controle nas semanas 1, 7 e 8. Quando um estado consistente de linfedema induzido foi conseguido, não havia uma diferença estatìstica significativa entre os hindlimbs durante todas as 8 semanas. Este resultado difere dos dois outros experimentos e pode ser explicado devido ao tamanho da amostra relativamente menor de quatro camundongos. Aumentar o número de medições aumentaria o poder do estudo e, por isso, a probabilidade de detectar uma diferença se existe uma diferençade 28.
Figura 2: Média de volume de membros traseiros: Experimento 1. Medições de 4 camundongos do grupo que recebeu duas doses de 10 irradiação gy estão incluídas nesta figura. Este gráfico mostra os volumes dos membros traseiros média no mm3 nas 8 semanas após a cirurgia. Todos os camundongos receberam uma dose de 10 irradiação Gy pré e pós-cirurgia. As barras de erro representam o desvio padrão (SD). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Semana | Volume de linfedema no mm3 (n = 4) | Volume de controle no mm3 (n = 4) | P-valor | Intervalo de confiança de 95% |
1 | 218,53 ± 9,3 | 136,78 ± 2,48 | 0.002 | 53,77−109,73 |
2 | 202,25 ± 10,24 | 141,88 ± 8,02 | 0.066 | (-6,53)−127,28 |
3 | 193,28 ± 10,80 | 141,20 ± 6,80 | 0.060 | (-3,7)−107,85 |
4 | 194,95 ± 21,05 | 141,50 ± 8,03 | 0.224 | (-41,85)−148,75 |
5 | 193,75 ± 7,07 | 141,70 ± 8,60 | 0.051 | (-0,27)−104,37 |
6 | 193,23 ± 3,42 | 141,78 ± 10,29 | 0.054 | (-1,56)−104,46 |
7 | 194,95 ± 7,26 | 143,23 ± 8,90 | 0.050 | 0,17-103,28 |
8 | 195,8 ± 9,65 | 152,18 ± 5,81 | 0.009 | 19,88-67,38 |
Tabela 1: Teste de múltiplas comparações de Sidak: Experiment 1. Esta tabela mostra a comparação estatística entre os volumes médiode hindlimbs induzidos do linfedema e os hindlimbs do controle durante as 8 semanas após a cirurgia. Todos os camundongos receberam uma dose de 10 irradiação Gy pré e pós-cirurgia. Os valores são apresentados como: média ± SD no mm3. P-valor < 0,05 é considerado como uma diferença significativa entre o membro traseiro controle e linfoedema hindlimb. n (número de observações) = 4.
O experimento 2 incluiu 45 camundongos. 15 camundongos serviram como controles e receberam injeções salinas. Os controles são usados como resultados representativos, pois assumimos que as injeções salinas não tiveram efeito sobre o volume de linfedema induzida. A figura 3 mostra que o linfedema era menos estável do que na experiência 1. Além disso, o volume dos membros posteriores de controle aumentou durante as 8 semanas. Isso diminui a diferença relativa apresentada na Tabela 2. Tem sido especulado que os ratos usam seu hindlimb não operado mais, nas semanas seguintes à cirurgia, e que isso leva à hipertrofia e aumento no volume dos membros do membro não operado. Mais importante ainda, a tabela 3 mostra que há uma diferença estatìstica significativa entre o retrospectlimb do linfedema e o retrospecto do controle durante todas as 8 semanas após a cirurgia. O maior número de camundongos prova que este procedimento pode induzir linfedema estatisticamente significativo por pelo menos 8 semanas.
Figura 3: Média de volume de membros traseiros: Experimento 2. As medidas de 15 ratos do grupo controle são incluídas nesta figura. Este gráfico mostra os volumes dos membros traseiros média no mm3 nas 8 semanas após a cirurgia. Todos os camundongos receberam uma dose de 10 irradiação Gy pré e pós-cirurgia. As barras de erro representam SD. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Experimento 1 | Experiência 2 | Experimento 3 | Experimento 1, 2 e 3 combinados | |||||
Semana | Diferença absoluta (mm3) | Diferença relativa (%) | Diferença absoluta (mm3) | Diferença relativa (%) | Diferença absoluta (mm3) | Diferença relativa (%) | Diferença absoluta (mm3) | Diferença relativa (%) |
1 | 81,75 ± 7,20 | 0,60 ± 0,04 | 104,34 ± 25,96 | 0,76 ± 0,23 | 85,20 ± 35,05 | 0,64 ± 0,27 | 94,02 ± 29,57 | 0,69 ± 0,24 |
2 | 60,38 ± 17,21 | 0,43 ± 0,14 | 107,12 ± 44,33 | 0,79 ± 0,33 | 85,63 ± 37,94 | 0,63 ± 0,29 | 92,77 ± 41,68 | 0,68 ± 0,31 |
3 | 52,08 ± 14,35 | 0,37 ± 0,11 | 78,77 ± 39,45 | 0,57 ± 0,28 | 74,67 ± 49,57 | 0,54 ± 0,38 | 73,74 ± 41,51 | 0,53 ± 0,31 |
4 | 53,45 ± 24,51 | 0,38 ± 0,19 | 50,67 ± 29,94 | 0,36 ± 0,21 | 50,62 ± 16,35 | 0,37 ± 0,11 | 51,01 ± 24,03 | 0,37 ± 0,17 |
5 | 52,05 ± 13,46 | 0,37 ± 0,11 | 32,74 ± 24,66 | 0,22 ± 0,17 | 42,67 ± 11,81 | 0,31 ± 0,07 | 39,08 ± 20,02 | 0,27 ± 0,14 |
6 | 51,45 ± 13,63 | 0,36 ± 0,11 | 26,80 ± 22,35 | 0,18 ± 0,14 | 32,86 ± 10,90 | 0,22 ± 0,08 | 32,32 ± 18,96 | 0,21 ± 0,13 |
7 | 51,73 ± 13,26 | 0,36 ± 0,11 | 19,04 ± 17,22 | 0,12 ± 0,11 | - | - | 25,92 ± 21,15 | 0,17 ± 0,15 |
8 | 43,63 ± 6,11 | 0,29 ± 0,04 | 15,15 ± 11,70 | 0,10 ± 0,08 | - | - | 21,15 ± 15,96 | 0,14 ± 0,10 |
Tabela 2: Diferença absoluta e relativa. Esta tabela mostra a diferença absoluta no volume entre os membros posteriores do linfedema e controle ± SD no mm3 e a diferença relativa ± SD em por cento.
Semana | Volume de linfedema no mm3 (n = 15) | Volume de controle no mm3 (n = 15) | P-valor | Intervalo de confiança de 95% |
1 | 241,82 ± 35,69 | 137,48 ± 21,54 | E 0,001 | 82,21-126,47 |
2 | 242,41 ± 45,13 | 135,29 ± 5,81 | E 0,001 | 69,33-144,89 |
3 | 216,85 ± 41,47 | 138,08 ± 5,31 | E 0,001 | 45.15-112,39 |
4 | 193,10 ± 31,27 | 142,43 ± 5,29 | E 0,001 | 25,15-76,18 |
5 | 180,03 ± 26,03 | 147,29 ± 6,45 | 0.002 | 11,72-53,76 |
6 | 179,89 ± 25,00 | 153,09 ± 6,56 | 0.004 | 7,74-45,85 |
7 | 176,45 ± 19,77 | 157,41 ± 7,49 | 0.008 | 4,35-33,71 |
8 | 166,97 ± 11,8 | 151,82 ± 10,07 | 0.002 | 5.18-25.12 5.18-25.12 |
Tabela 3: Teste de múltiplas comparações de Sidak: Experiment 2. Esta tabela mostra a comparação estatística entre os volumes médio de hindlimbs induzidos do linfedema e de membros traseiros do controle nas 8 semanas após a cirurgia. Todos os camundongos receberam uma dose de 10 irradiação Gy pré e pós-cirurgia. Os valores são apresentados como: média ± SD no mm3. P-valor < 0,05 é considerado como uma diferença significativa entre o membro traseiro controle e linfoedema hindlimb. n (número de observações) = 15.
O experimento 3 incluiu 36 camundongos. 12 camundongos serviram como controles e receberam injeções salinas. Os controles são usados como resultado representativo, pois assumimos que as injeções salinas não tiveram efeito sobre o volume de linfedema induzida. Neste experimento, o volume posterior dos camundongos foi medido por 6 semanas em vez de 8. O experimento durou apenas 6 semanas devido a dificuldades logísticas quando o experimento foi realizado. A figura 4 mostra um linfedema mais consistente do que o experimento 2. A tabela 4 mostra que há linfoema estatisticamente significativa nas 6 semanas após a cirurgia.
Figura 4: Média de volume de membros traseiros: Experimento 3. As medidas de 12 ratos do grupo controle são incluídas nesta figura. Este gráfico mostra os volumes dos membros traseiros média no mm3 nas 6 semanas após a cirurgia. Todos os camundongos receberam uma dose de 10 irradiação Gy pré e pós-cirurgia. As barras de erro representam SD. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Semana | Volume de linfedema no mm3 (n = 12) | Volume de controle no mm3 (n = 12) | P-valor | Intervalo de confiança de 95% |
1 | 219,06 ± 35,00 | 133,86 ± 10,02 | E 0,001 | 51,66−118,74 |
2 | 220,90 ± 36,98 | 135,27 ± 5,89 | E 0,001 | 49,33−121,94 |
3 | 211,74 ± 47,30 | 137,07 ± 7,56 | 0.002 | 27.24-122.11 |
4 | 186,09 ± 20,36 | 135,47 ± 5,70 | E 0,001 | 34,98-66,27 |
5 | 182,35 ± 18,25 | 139,68 ± 7,45 | E 0,001 | 31,37-53,98 |
6 | 183,44 ± 12,11 | 150,58 ± 8,37 | E 0,001 | 22,42-43,29 |
Tabela 4: Teste de múltiplas comparações de Sidak: Experiment 3. Esta tabela mostra a comparação estatística entre os volumes médio de hindlimbs induzidos do linfedema e de membros traseiros do controle nas 6 semanas após a cirurgia. Todos os camundongos receberam uma dose de 10 irradiação Gy pré e pós-cirurgia. Os valores são apresentados como: média ± SD no mm3. P-valor < 0,05 é considerado como uma diferença significativa entre o membro traseiro controle e linfoedema hindlimb. n (número de observações) = 12.
A Figura 5 e a Tabela 5 mostram o volume médio dos membros traseiros dos três experimentos combinados. A tabela 5 mostra que o uso deste procedimento resulta em linfedema estatisticamente significativo com duração de pelo menos 8 semanas. Dados das primeiras 6 semanas, são as medidas combinadas de 31 camundongos dos experimentos 1, 2 e 3. Na semana 7-8, tivemos apenas dados dos experimentos 1 e 2, resultando em medições combinadas de 19 camundongos.
Figura 5: Volume combinado dos membros traseiros: Experimento 1, 2 e 3. Trinta e um camundongos incluídos nas primeiras 6 semanas após a cirurgia e 19 camundongos incluídos nas 2 semanas seguintes. Este gráfico mostra os volumes dos membros traseiros média no mm3 nas 8 semanas após a cirurgia. Todos os camundongos receberam uma dose de 10 irradiação Gy pré e pós-cirurgia. As barras de erro representam SD. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Semana | Volume de linfedema no mm3 (Semana 1-6 n = 31) (Semana 7-8 n = 19) | Volume de controle no mm3 (Semana 1-6 n = 31) (Semana 7-8 n = 19) | P-valor | Intervalo de confiança de 95% |
1 | 230,00 ± 34,46 | 135,99 ± 16,03 | E 0,001 | 78,19-109,84 |
2 | 228,90 ± 40,91 | 136,13 ± 6,32 | E 0,001 | 70,47−115,07 |
3 | 211,83 ± 41,15 | 138,09 ± 6,36 | E 0,001 | 51,53-95,95 |
4 | 190,63 ± 25,81 | 139,62 ± 6,54 | E 0,001 | 38,15-63,87 |
5 | 182,70 ± 21,52 | 143,62 ± 7,79 | E 0,001 | 28,36-49,79 |
6 | 182,98 ± 19,11 | 150,66 ± 8,36 | E 0,001 | 22,18-42,47 |
7 | 180,34 ± 19,31 | 154,43 ± 9,60 | E 0,001 | 11,61-40,22 |
8 | 173,04 ± 16,42 | 151,89 ± 9,19 | E 0,001 | 10,35-31,94 |
Tabela 5: Teste de múltiplas comparações de Sidak: Experimento 1, 2 e 3 combinados. Esta tabela mostra a comparação estatística entre os volumes médio de hindlimbs induzidos do linfedema e os membros traseiros do controle de 31 ratos nas primeiras 6 semanas após a cirurgia e 19 ratos nas seguintes 2 semanas. Todos os camundongos receberam uma dose de 10 irradiação Gy pré e pós-cirurgia. Os valores são apresentados como: média ± SD no mm3. P-valor < 0,05 é considerado como uma diferença significativa entre o membro traseiro controle e linfoedema hindlimb. n (número de observações) = 31.
Há alguns passos críticos neste protocolo. Em primeiro lugar, é importante que os pesquisadores tomem precauções de segurança ao trabalhar com radioatividade. Em segundo lugar, durante a parte cirúrgica deste protocolo, é importante iniciar o procedimento uma vez que o rato tenha sido anestesiado e terminá-lo sem pausas desnecessárias. Isso é importante para evitar um período cirúrgico excessivamente longo para o animal e evitar que a anestesia perca efeito durante a cirurgia. Recomenda-se administrar apenas uma injeção de anestésico e completar o procedimento cirúrgico em uma sessão. É também um passo crítico, para não administrar muito Patente Blue V, como excesso de Patente Blue V irá descolorar o tecido em torno dos vasos linfáticos. Se o tecido circundante fica descolorido, pode ser quase impossível visualizar os vasos linfáticos e isso compromete o procedimento. Mesmo se um controla visualizar as embarcações do linfático, o tecido descolorido fará duro avaliar se o V azul da patente passa proximal à ligadura ou não. Isso é problemático porque o operador deve ter certeza de que as ligaduras colocadas estão restringindo o fluxo linfático, para garantir que o procedimento será bem sucedido. Também é importante deixar uma lacuna de 2 a 3 mm ao fechar a ferida. Como uma lacuna temporária da pele é muitas vezes necessária para imitar o processo de cicatrização de feridas humanas29.
As limitações deste método são que é um procedimento demorado que requer acesso a um microscópio e treinamento microcirúrgico anterior. Ao realizar a parte cirúrgica deste protocolo, é importante planejar o tempo entre os procedimentos cirúrgicos. Muito tempo vai para esperar que o animal seja anestesiado, raspar o membro traseiro e geralmente se preparar para cada procedimento cirúrgico. Portanto, recomenda-se preparar habitação e anestesia com antecedência. É importante notar que, para ter certeza de que o linfedema crônico foi induzido, a histopatologia deve ser analisada. Não incluímos histopatologia neste artigo, o que é uma limitação. Sem histopatologia apoiando o fato de que as mudanças histológicas aconteceram com as embarcações linfáticas as mudanças no volume nos membros posteriores só podem ser descritas como edema. O artigo que inclui todos os dados sobre os quatro camundongos do experimento 126 inclui histopatologia e mostra que houve mudanças significativas na histopatologia usando essa técnica. O artigo também inclui imagens linfáticas. O mesmo procedimento foi usado nos ratos na experiência 2 e 3, mas a histopatologia não mostrou nenhuma diferença significativa entre o retrospecto do linfedema e o membro traseiro do controle nestas experiências. Mais estudos, incluindo histopatologia são necessários para que este modelo esclareça se o linfedema é induzido em um nível histológico. Os experimentos 2 e 3 ainda não foram publicados e, portanto, não podemos nos referir a elas.
Embora o uso de varreduras μCT para medir o volume dos membros traseiros possa ser mais objetivo do que usar o método de deslocamento de água ou medições circunferentes, ele ainda tem suas limitações. A técnica de medição é cara, demorada e requer acesso a um scanner μCT e software de análise.
Um dos maiores desafios com modelos de linfoema de roedores em geral, foram a resolução espontânea do linfedema, a menos que a radiação excessiva tenha sido realizada25. Ao desenvolver este modelo, testamos várias doses diferentes de radiação para encontrar uma dose que induziria linfedema duradouro sem causar morbidade grave26. Anteriormente, os modelos de linfedema não foram padronizados nos métodos de indução de linfedema ou avaliações de resultados. Oashi et al.20 usaram uma única dose de 30 irradiação Gy, e ligaram cada navio linfático em três pontos separados. Nesse estudo, o procedimento cirúrgico levou 90 min para realizar. Embora o método apresentado neste artigo possa ser considerado demorado, a parte cirúrgica do procedimento ainda pode ser realizada aproximadamente duas vezes mais rápido que o método apresentado por Oashi et al.20. Eles também tiveram um período de acompanhamento de 6 meses, o que é consideravelmente maior do que qualquer um dos estudos apresentados neste artigo. Entretanto, incluíram somente um rato e mediram manualmente a circunferência do membro para avaliar o inchamento, visto que os volumes apresentados neste artigo foram medidos em 31 ratos usando varreduras do μCT e software 3D da análise. Komatsu et al.30 removeram os gânglios linfáticos inguinais e os vasos linfáticos periféricos associados e tecido adiposo usando uma faca elétrica. Usar uma faca elétrica pôde ser uma aproximação mais simples que não exija o treinamento microsurgical, mas o edema induzido resolvido após o dia 4 quando o método apresentado neste artigo oferecer o linfedema consistente que dura pelo menos 8 semanas.
Esperamos que este protocolo permita aos investigadores considerar as limitações e vantagens do modelo de linfedema revisto. O protocolo também deve ajudar os pesquisadores a replicar com sucesso o modelo. O método pode ser usado em futuros estudos observacionais e intervencionistas para entender a fisiopatologia do linfedema e pesquisar novas opções de tratamento. Em estudos futuros, também seria interessante ter um acompanhamento superior a 8 semanas para observar quanto tempo dura o linfedema induzido. Também seria interessante observar o efeito da realização de irradiação mais direcionada dos camundongos pré e pós-cirurgia. Isso poderia ser feito realizando uma tomografia computadorizada e planejando um volume alvo. Em estudos futuros, esse modelo também pode ser suportado por estudos de imagem linfática guiada por fluorescência, perometria ou bioimpemia. Este método oferece linfedema estatisticamente significativo com duração de pelo menos 8 semanas, que foi medido diretamente via CT volumetric em três experimentos separados por diferentes investigadores principais.
Os autores não têm nada a divulgar.
Os autores agradecem peter Bollen, cabeça do laboratório biomédico para emprestar o equipamento necessário gravar a metragem vista através dos microscópios.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
10-0 Nylon suture | S&T | 12051-10 | |
6-0 Nylon suture - Dafilon | B Braun | C0933112 | |
Coagulator - ICC 50 | ERBE | ||
Cotton tipped applicators | Yibon medical co | ||
Dissecting forceps | Lawton | 09-0190 | |
Elastic retractors | Odense University Hospital | ||
Electrical clipper | Aesculap | GT420 | |
Fentanyl 0,315 mg/ml | Matrix | ||
Heating pad - PhysioSuite | Kent Scientific Corp. | ||
Isoflurane 1000mg Attane | Scan Vet | ||
Isoflurane vaporizer - PPV | Penlon | ||
Micro jewler forceps | Lawton | 1405-05 | |
Micro Needle holder | Lawton | 25679-14 | |
Micro scissors | Lawton | 10128-15 | |
Micro tying forceps | Lawton | 43953-10 | |
Microfine U-40 syringe 0,5ml | BD | 328821 | |
Microlance syringe 25g | BD | ||
Microlance syringe 27g | BD | ||
Midazolam 5 mg/ml (hameln) | Matrix | ||
Needle holder - Circle wood | Lawton | 08-0065 | |
Non woven swabs | Selefa | ||
Opmi pico microscope F170 | Zeiss | ||
Patent blue V - 25 mg/ml | Guerbet | ||
Scissors - Joseph | BD | RH1630 | |
Siemens INVEON multimodality pre-clinical scanner | Siemens pre-clinical solutions | ||
Source of radiation - D3100 | Gulmay | ||
Stata Statistical Software: Release 15 | StataCorp LLC | ||
Temgesic - 0,2 mg | Indivior | ||
Vet eye ointment - viscotears | Bausch & Lomb |
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