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O protocolo descreve rotulagem específica de nucleóides mitocondriais com uma mancha de gel de DNA comercialmente disponível, aquisição de série de lapso de tempo de células rotuladas ao vivo por microscopia de iluminação estruturada de super resolução (SR-SIM) e rastreamento automático do movimento nucleóide.
Nucleóides mitocondriais são partículas compactas formadas por moléculas de DNA mitocondrial revestidas de proteínas. O DNA mitocondrial codifica tRNAs, rRNAs e vários polipeptídeos mitocondriais essenciais. Os nucleóides mitocondriais dividem e distribuem dentro da dinâmica rede mitocondrial que sofre fissão/fusão e outras alterações morfológicas. Microscopia de fluorescência viva de alta resolução é uma técnica simples para caracterizar a posição e o movimento de um nucleóide. Para esta técnica, os nucleóides são comumente rotulados através de marcas fluorescentes de seus componentes proteicos, ou seja, fator de transcrição a (TFAM). No entanto, essa estratégia precisa de superexpressão de uma construção com etiqueta de proteína fluorescente, que pode causar artefatos (relatados para tfam), e não é viável em muitos casos. Corantes orgânicos de ligação de DNA não têm essas desvantagens. No entanto, eles sempre mostram a coloração de DNAs nucleares e mitocondriais, sem especificidade para os nucleóides mitocondriais. Levando em conta as propriedades físico-químicas desses corantes, selecionamos uma mancha de gel de ácido nucleico (SYBR Gold) e alcançamos rotulagem preferencial de nucleóides mitocondriais em células vivas. Propriedades do corante, particularmente seu alto brilho ao vincular ao DNA, permitem quantificação subsequente do movimento nucleóide mitocondrial usando séries temporais de imagens de iluminação estruturadas de super-resolução.
Moléculas circulares de DNA de 16,5 kbp constituem o material genético das mitocôndrias, codificando 22 tRNAs, 2 rRNAs e 13 polipeptídeos necessários para complexos mitocondriais oxidativos de fosforilação. DNA mitocondrial ligado ao fator de transcrição mitocondrial a (TFAM) e várias outras proteínas formam os nucleóides mitocondriais1,,2,,3,,4. Os nucleóides mitocondriais movem-se e redistribuem entre os componentes da rede mitocondrial5,6 durante sua remodelagem morfológica, fissão ou fusão, dependendo da fase do ciclo celular, estresse e outros fatores (revisados em Pernas et al.7). Além disso, o movimento dos nucleóides mitocondriais está implicado na doença de lúpus eritematoso sistêmico8 e pode desempenhar um papel em outras doenças. A microscopia de fluorescência é uma técnica simples para estudos de células vivas de organelas, mas a técnica tem uma resolução de >200 nm, que é maior que o tamanho dos nucleóides mitocondriais (~100 nm9,,10,,11,12). Esse limite tem sido contornado pelas chamadas técnicas de "super-resolução", como esgotamento estimulado de emissões (STED) e microscopia de localização de moléculas únicas (SMLM)13,14. Até agora, nucleóides mitocondriais e outros DNAs foram imagens em células vivas por microscopia direta de reconstrução óptica estocástica (dSTORM)15. Estruturas submitocínias finas com posições correlacionadas com o dNH foram observadas por DST em células vivas16. No entanto, essas técnicas de super-resolução requerem alta intensidade de iluminação, o que causa efeitos fototóxicos nas células vivas17. Portanto, a imagem de lapso de tempo de nucleóides mitocondriais com resolução além do limite de difração é desafiadora. Para lidar com isso, utilizamos microscopia de iluminação estruturada de super resolução (SR-SIM)18. O SIM requer uma dose de energia de iluminação muito menor do que o STED e o SMLM19. Além disso, ao contrário das técnicas STED e SMLM, o SIM permite imagens tridimensionais multicoloridas simples (3D) e não requer propriedades fotofísicas particulares dos fluoroforos ou composição de tampão de imagem19.
A estratégia convencional para rotular nucleóides mitocondriais em células vivas é a marcação fluorescente de uma proteína nucleóide mitocondrial, como a TFAM20. No entanto, em muitos casos, essa estratégia não é adequada. Além disso, a superexpressão do TFAM com proteína fluorescente produz um artefato sério21. A rotulagem de DNA com corantes orgânicos tem vantagens sobre uma estratégia baseada em proteína fluorescente (FP). Os corantes orgânicos são livres de restrições relacionadas à marcação FP: podem ser usados para qualquer tipo de células ou tecidos e podem ser aplicados a qualquer momento de um experimento. Imagens de células vivas de nucleóides mitocondriais foram relatadas com vários corantes de ligação de DNA: DAPI22, SYBR Green23, Vybrant DyeCycle24e picoGreen15,,25,26. Uma desvantagem substancial da maioria dos corantes de ligação de DNA para rotulagem nucleóide é que eles mancham todo o DNA dentro da célula. Direcionar um corante apenas para DNA mitocondrial é altamente desejável. Para isso, é necessária uma seleção cuidadosa de um corante que possua propriedades físico-químicas adequadas. Corantes lipofílicos que possuem carga positiva deslocalizada, como a rhodamina 123, são conhecidos por se acumularem em mitocôndrias vivas, que preservam seu potencial de membrana negativa. Além disso, um corante ideal para rotulagem específica de nucleóides mitocondriais deve ligar o DNA com alta afinidade e emitir fluorescência brilhante na ligação de DNA. Considerando esses requisitos, certas cianolinas são promissoras (por exemplo, picoGreen), mas o DNA nuclear é abundantemente manchado por esses corantes simultaneamente com DNA mitocondrial15,,25,26. O presente protocolo descreve a rotulagem específica de nucleóides mitocondriais em células vivas com outro corante de cianina, SYBR Gold (SG), e rastreamento dos nucleóides em vídeos SIM de super resolução de lapso de tempo. Além disso, as células vivas manchadas de SG podem ser imagens por qualquer tipo de microscópio fluorescente invertido (fusocal, disco giratório, epifluorescência, etc.) adequado para células vivas e equipado com uma fonte de luz de 488 nm.
NOTA: Todas as linhas celulares aqui mencionadas foram cultivadas em alta glicose Dulbecco's Modified Eagle's medium (DMEM) suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS), glutamina, penicilina/estreptomicina e piruvato. Equilibre todos os meios de comunicação e suplementos a serem usados no dia da rotulagem e imagem aquecendo-os até 37 °C em uma incubadora definida para 5% de CO2. Todo o trabalho de cultura celular, incluindo rotulagem, ocorre em condições estéreis sob uma coifa de fluxo laminar.
1. Rotulagem de células ao vivo
2. Aquisição de Imagem SR-SIM
3. Processamento e Análise de Dados
4. Aquisição de Imagem Confocal
Caracterização da rotulagem de células vivas com SG
Primeiro, a distribuição de SG nas células após incubação com o corante em várias diluições foi caracterizada por microscopia confocal. Após a incubação com altas concentrações de SG ou picoGreen, ambos os corantes rotularam principalmente os núcleos e apresentaram uma coloração pontual no citoplasma (Figura 1),da mesma forma aos dados publicados para outro corante de cianeto carregado positivamente (ou seja, picoGreen)15. No entanto, após a incubação com SG às 1:10.000 diluições, manchas fracas apareceram nos núcleos, enquanto no citoplasma, observamos um padrão de pontos brilhantes(Figura 1). Por outro lado, a incubação com corante picoGreen diluído 1:10.000 rendeu principalmente manchas nucleares. O sinal SG era muito mais brilhante do que o do picoGreen na mesma concentração. Os dados mostraram que a SG é mais adequada para o DNA mitocondrial de imagem do que outros corantes similares de ligação de DNA.
Para confirmar que os pontos brilhantes estão localizados nas mitocôndrias, manchamos células vivas simultaneamente com SG e mancha mitocondrial muito vermelha. Este último é um corante orgânico permeável celular com células carregadas positivamente que se acumula nas mitocôndrias das células vivas. Após a incubação com SG às 1:10.000 e 1:50.000 diluições, quase todas as manchas de SG ocorreram em mitocôndrias, enquanto ao rotular em 1:500 e 1:1.000 diluições, ocorreu uma mancha significativa dos núcleos e citoplasma(Figura 2).
Além disso, caracterizamos o curso de tempo de coloração de células vivas com SG por microscopia de lapso de tempo(Figura 3). Os gráficos de intensidade de fluorescência SG em mitocôndrias vs. tempo(Figura 3B) sugeriram que após 45 minutos, a coloração nucleóide estava perto da saturação. Assim, recomendamos tempos de incubação de ~30-60 min.
Testamos como a distribuição intracelular SG muda após a fixação e/ou permeabilização das células. A fixação (2% de paraformaldeído [PFA]) das células manchadas vivas causou uma leve redistribuição do corante ao núcleo(Figura 4A,B). A permeabilização das células fixas (0,1% Triton X100) eliminou o padrão pontilhado SG nas mitocôndrias, e a coloração dos núcleos foi dominante(Figura 4C). Se o SG foi adicionado às células após fixação e permeabilização, ele se distribuiu uniformemente através do citoplasma e núcleos(Figura 4D). Assim, as células rotuladas por SG podem ser fixadas se necessário, mas o corante não é adequado para protocolos que requerem permeabilização.
Rastreamento de nucleóides sr-SIM e mitocondrial de células vivas
As células vivas costas com SG e uma mancha mitocondrial muito vermelha(Tabela de Materiais) foram imagens 3D por uma técnica sim de super resolução. Como nas imagens confocal(Figura 2),os nucleóides mitocondriais apareceram como pontos brilhantes dentro das mitocôndrias(Figura 5A). Além disso, adquirimos uma série temporal de imagens SIM 2D e rastreamos as posições dos nucleóides em uma resolução além do limite de difração. Imediatamente antes de iniciar a série de tempo adquirimos pilhas SIM 3D no SG e nos canais de manchas mitocondriais. Então adquirimos uma série temporal apenas no canal SG e rastreamos os nucleóides mitocondriais a fim de quantificar seus movimentos. A velocidade média da pista foi de 0,042 μm/s, e a velocidade máxima instantânea da pista foi de 0,078 ± 0,012 μm/s. A maioria dos nucleóides não se deslocou longe de suas posições originais, mas mostrou movimentos aleatórios de curta distância que provavelmente estavam confinados à rede mitocondrial, como sugere uma sobreposição de faixas nas imagens mitocondriais(Figura 5B). Poucos deslocamentos direcionais rápidos ocorreram durante uma série temporal típica(Filme 1).
Figura 1: Comparação da rotulagem de células vivas picoGreen e SG. As células A549 foram incubadas com picoGreen ou SG em diluições indicadas e imagens. Campos representativos de visão das células rotuladas no canal verde. LSM880 Airyscan FAST, 20x/air objective, Barra de escala = 50 μm. Seções ópticas únicas. Os quadrados brancos marcam as áreas mostradas em uma ampliação mais elevada à direita dos campos de visão de 423 x 423 μm. Para diluições de 1:1.000 e 1:2.000, as mesmas imagens são mostradas em duas configurações de brilho: as configurações de brilho "padrão" otimizadas para diluição de 1:10.000 e as configurações de "brilho reduzido" ajustadas para evitar a saturação do detector. Este número foi modificado a partir de Jevtic et al.27. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Localização de SG em células vivas após rotulagem em diferentes concentrações. As células HeLa foram incubadas por 30 min com uma mistura de 0,25 μM Mitotracker CMXRos Red e a diluição indicada de SG. A solução foi substituída pelo DMEM, e as imagens foram adquiridas em um microscópio Airyscan LSM880, objetivo de óleo 63x 1.4, com aquisição sequencial de canais coloridos. Únicas fatias ópticas são mostradas Barra de escala = 10 μm). Este número foi modificado a partir de Jevtic et al.27. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Células HeLa durante a rotulagem com SYBR Gold (SG). Primeiro, as células HeLa vivas foram rotuladas com Mitotracker CMXRos Red e lavadas. SG (diluição final 1:10.000 em DMEM) foi adicionado às células e uma série de lapso de tempo foi adquirida. Microscópio LSM880, 63x 1.4 Óleo objetivo, aquisição sequencial. Pilhas de Z foram adquiridas em cada ponto de tempo. As projeções de intensidade máxima são mostradas. (A) Intensidades médias de fluorescência SG ao longo do tempo em várias regiões de interesse. (B) Campos de visão representativos mostrando as regiões de interesse onde a fluorescência SG foi medida (retângulos coloridos). (C) Um campo de visão em vários pontos de tempo durante a incubação com SG. Uma região quadrada marcada com linha branca é mostrada em uma ampliação mais elevada na coluna direita. Este número foi modificado a partir de Jevtic et al.27. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Efeito da fixação e permeabilização na localização de SG nas células. As células HeLa foram manchadas com SG (estoque diluído 1:10.000) e Mitotracker CMXRos Red (0,25 μM) por 30 min. Fatias ópticas únicas foram adquiridas em um microscópio de disco giratório; aquisição sequencial; barra de escala = 10 μm. (A) Células HeLa vivas manchadas com SG. (B) Células HeLa vivas manchadas com SG e depois fixadas com 2% de PFA em PBS por 30 min. (C) Células HeLa vivas manchadas com SG, depois fixadas com 2% pfa em PBS por 30 min e permeabilizadas com 0,1% Triton X100 por 15 min. No painel inferior, a mesma imagem é mostrada, mas o brilho no canal verde é definido mais alto. (D) Células HeLa fixadas com 2% pfa, permeabilizadas com Triton X100 de 0,1% por 15 min, e depois manchadas com SG e Mitotracker CMXRos Red. Para adquirir as imagens mostradas em(D),o ganho emCCD da câmera para o canal verde foi reduzido por um fator de 12 em comparação com A-C para evitar a superexposição. Este número foi modificado a partir de Jevtic et al.27. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Rastreamento nucleóide em imagens SIM ao vivo. Imagens representativas de um campo de visão de células manchadas de SG. Inferior: a imagem SIM de duas cores tirada antes da aquisição da série time lapse. Verde = canal SG; magenta = canal mitotracker. Top: faixas nucleóides de uma série de tempo SIM de 50 quadros no canal SG(Filme 1); tempo de quadro = 1,8 s; rastreamento pelo software Imaris 8.4.1. As faixas são codificadas por cores por velocidade máxima da faixa (μm/s); Elyra PS.1, modo SIM, objetivo de 100x/1.46 Oil; Barra de escala = 10 μm. Este número foi modificado a partir de Jevtic et al.27. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Filme 1: Série de lapso de tempo SIM mostrando células representativas manchadas de SG. Barra de escala = 5 μm. Os nucleóides mitocondriais detectados são marcados como esferas brancas. As faixas são visualizadas como "Caudas de Dragão" (8 quadros de comprimento) e codificadas por cores de acordo com suas velocidades instantâneas máximas (a barra de cores no canto inferior direito mostra velocidades em μm/s). Nucleóides mitocondriais rastreando e visualizando pelo software Imaris 8.4.1. Este vídeo foi publicado em Jevtic et al.27. Clique aqui para ver este vídeo (Clique com o botão direito do mouse para baixar).
Existem vários componentes críticos no protocolo: Para alcançar a rotulagem preferencial do DNA mitocondrial, a concentração do corante de ligação de DNA durante a incubação deve ser mantida muito baixa (por exemplo, uma diluição de 1:10.000 de um estoque comercial típico), e o tempo de incubação deve ser de 30 minutos. O tempo de incubação nunca deve exceder 1 h. Deve-se usar o corante SYBR Gold; outros corantes de ligação de DNA não são brilhantes o suficiente para gerar um sinal forte ao rotular em baixa concentração.
A limitação do nosso protocolo é que o corante é retirado dos nucleóides mitocondriais durante uma etapa de permeabilização. Portanto, o procedimento descrito não é adequado para protocolos convencionais de imunofluorescência. Neste caso, os nucleóides em células fixas podem ser rotulados eficientemente com outras técnicas, como anticorpos contra o DNA ou fatores de transcrição mitocondrial (TFAM).
A rotulagem direta de nucleóides mitocondriais com o corante orgânico de ligação de DNA tem vantagens sobre a rotulagem de proteínas fluorescentes: qualquer tipo de célula pode ser rotulada dentro de <1 h, sem restrições temporais ou outras restrições de expressão transitória ou estável de construtos fluorescentes marcados por proteínas. Além disso, nos protocolos atuais, foi relatada a marcação convencional de proteínas fluorescentes de TFAM para causar artefatos. Além disso, a SG mancha eficientemente os nucleóides somente se o potencial da membrana mitocondrial estiver intacto. Isso impede a aquisição de imagens de células "doentes" e mortas biologicamente irrelevantes, que não podem ser evitadas com coloração baseada em FP. Finalmente, protocolos publicados anteriormente baseados em corantes de ligação de DNA não alcançaram a coloração preferencial do DNA mitocondrial.
O protocolo proposto é rápido e simples, por isso assumimos que será amplamente utilizado para imagens vivas de nucleóides mitocondriais por várias técnicas de fluorescência, tanto a difração limitada (por exemplo, confocagem a laser, TIRF, etc.) quanto sim de super-resolução.
Os autores não têm nada a revelar.
Os autores reconhecem Asifa Akhtar e Angelika Rambold (ambos do Instituto Max Planck de Imunobiologia e Epigenética) por fornecer células HeLa.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Elyra PS1 | Carl Zeiss | multi-modal super-resolution microscope containing module for super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM) | |
High glucose DMEM | GIBCO/ThermoFisher | 31966021 | |
ibidi 35 mm dish, glass bottom | Ibidi Gmbh | 81158 | |
ibidi 8-well microSlide, glass bottom | Ibidi Gmbh | 80827 | |
Imaris 8.4.1 | Bitplane/Oxford Instruments | image porcessing and visualisation software package | |
iXon 885 | Andor Technologies | EMCCD camera with back-illuminated sensor | |
LSM880 Airyscan | Carl Zeiss | laser scanning confocal microscope with array detector | |
Mitotracker CMXRos Red | ThermoFischer | M7512 | red live cell mitochondrial stain |
Mitotracker Deep Red FM | ThermoFischer | M22426 | far red live cell mitochondrial stain |
picoGreen | ThermoFischer | P7581 | cell permeant DNA stain |
Plan Apochromat 100x/1.46 Oil objective | Carl Zeiss | ||
SYBR Gold | ThermoFischer | S11494 | cell permeant DNA stain |
Zen Black 2012 software | Carl Zeiss | image acquisition and processing software |
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