Método de preparação de amostras de microscópio eletrônico de varredura e transmissão para os apêndices do Besouro Woodboring

Para observar a ultraestrutura da sensilla de insetos, foi apresentado o protocolo de preparação de amostras de varredura e transmissão (SEM e TEM), respectivamente) no estudo. O Tween 20 foi adicionado ao fixativo para evitar a deformação amostral na microscopia de fluorescência SEM. Foi útil para melhorar a precisão do corte na TEM.

Este relatório descreveu métodos de preparação de amostras que escaneiam e transmissam observações de microscópio eletrônico, demonstrados preparando apêndices do besouro lenhador, Chlorophorus caragana Xie & Wang (2012), para ambos os tipos de microscopia eletrônica. O protocolo de preparação de amostras de microscopia eletrônica de varredura (SEM) foi baseado na fixação química da amostra, desidratação em uma série de banhos de etanol, secagem e revestimento de sputter. Adicionando Tween 20 (Polioxyetileno sorbitan laurate) à solução fixa e de lavagem, a superfície do corpo de insetos de besouro lenhador foi lavada de forma mais limpa em SEM. A preparação de amostras de microscopia eletrônica de transmissão deste estudo (TEM) envolveu uma série de etapas, incluindo fixação, desidratação do etanol, incorporação de resina, posicionamento utilizando microscopia de fluorescência, secção e coloração. Fixante com Interpolado 20 habilitado penetrar a parede corporal do inseto de besouro lenhado mais facilmente do que teria sido sem Tween 20, e posteriormente melhores tecidos fixos e órgãos no corpo, resultando assim em observações claras de microscópio eletrônico de transmissão de ultraestruturas de insetos sensilla. O próximo passo desta preparação foi determinar as posições de sensilla de insetos na amostra embutida no bloco de resina usando microscopia de fluorescência para aumentar a precisão do posicionamento da sensilla alvo. Isso melhorou a precisão do corte.

A microscopia eletrônica de digitalização é uma ferramenta importante em muitos estudos de morfologia, que o SEM mostra estruturas superficiais^1,2. O apelo da microscopia eletrônica de transmissão é que ele possa ser usado para estudar uma ampla gama de estruturas biológicas na escala de nanômetros, desde a arquitetura das células e a ultraestrutura das organelas, até a estrutura de complexos e proteínas macromoleculares. Tem mostra estruturas internas^3,4,5.

Coleoptera é o maior grupo de insetos, incluindo cerca de 182 famílias e 350.000 espécies. A maioria dos insetos coleopteranos, em particular besouro samadeirado, se alimentam de plantas, muitas das quais são pragas importantes de florestas e árvores frutíferas, causando danos devastadores às árvores⁶. Atualmente, a prevenção e controle da população de pragas baseadas na teoria da ecologia química têm recebido cada vez mais atenção⁷. Métodos eficientes, baixotóxicos e livres de feromôona tornaram-se uma maneira eficaz⁸. Estudar a morfologia sensilla e a ultraestrutura dos insetos é uma parte importante da pesquisa de ecologia química de insetos. A microscopia eletrônica de digitalização e transmissão (SEM e TEM, respectivamente) é usada para grande efeito para estudar sua morfologia e anatomia interna. No entanto, durante a preparação de amostras de insetos para microscopia eletrônica (EM), a objetividade e autenticidade do local de observação podem ser afetadas⁹. Em geral, a preparação de amostras sem de insetos requer limpeza, fixação tecidual, desidratação, metatese, secagem e revestimento de sputter¹⁰. Devido ao ambiente complexo em que vive o besouro lenhador, a superfície corporal muitas vezes tem vários poluentes e seus apêndices muitas vezes têm muitas sensilla ou cerdas longas finas. Em particular, alguns lenhadores não estão disponíveis a partir da captação laboratorial, que coletou diretamente no campo, e depois colocado em fluido de fixação para garantir o frescor e, posteriormente, lavado em laboratório. Se a amostra for primeiro fixae e depois lavada, obviamente é muito mais difícil remover detritos porque glutaraldehyde a fixa fortemente na amostra. O Tween 20 é um surfactante^11,12,13,14, que desempenha um papel importante no processo de lavagem, incluindo a redução da tensão superficial da água e a melhoria da umidade da água na superfície da lavanderia. Neste estudo, tween 20 foi adicionado à solução de fixação e solução de limpeza PBS para reduzir a tensão superficial do líquido, e impedir que a sujeira depositasse na superfície corporal do besouro lenhador, o que fez a superfície do corpo mais limpa no SEM.

Usando tem, sensilla em diferentes órgãos de insetos pode ser fatiado para revelar as estruturas claras dentro deles, fornecendo assim uma base para analisar funções sensilla. Quando o inseto sujeito, como o besouro lenhador, é grande, e sua parede corporal tem um grau substancial de esclerotização, de modo que o fixativo pode não saturar totalmente os tecidos dos órgãos dentro do corpo do inseto. O Tween 20 pode aumentar a capacidade de dispersão e suspensão da sujeira. Neste estudo, Tween 20 foi adicionado ao fixativo para aumentar a penetração fixa do fluido na parede corporal do inseto de besouro lenhador, evitando a deformação e o colapso da epidermi^11,12,13. Além disso, usando tecnologia geral de fatiamento, é difícil localizar com precisão diferentes tipos de sensilla, em particular para alguma pequena sensilla¹⁵. Com base na preparação tradicional da amostra TEM, este estudo combinou microscopia de fluorescência e SEM para determinar a posição de sensilla de insetos no bloco embarcado, melhorando assim a precisão do corte.

ATENÇÃO: Consulte as folhas de dados de segurança do material dos reagentes antes de usá-los. Vários dos produtos químicos usados durante a preparação da amostra são tóxicos, mutagênicos, cancerígenos e/ou reprotóxicos. Use equipamentos de proteção individual (luvas, jaleco, calças de comprimento completo e sapatos fechados) e trabalhe um capô de fume enquanto manuseia a amostra.

1. Preparação e imagem de amostras sem

1. Fixação e Limpeza de Amostras
   1. Trabalhando em uma área onde ocorre C. caragana, atraia adultos em armadilhas de campo iscas com atrativos vegetais, como isofhorona¹⁶. Preservar corpos limpos de C. caragana adulto em 0,1 mol L^-1 sorofia tampão de fosfato (PBS, pH 7.2), 2,5% (wt/vol) glutaraldeído (Anhydrous EM Grad) e 0,06% (vol/vol) Tween 20. Conserte a amostra a 4 °C no fim de semana.
   2. Remova os corpos do líquido de preservação e enxágue em tampão de fosfato. Usando um estereótipo, remova os apêndices e limpe-os ultrassonicamente (40 kHz) em um salino l -1 mol^{L -1} tampão de fosfato (pH 7.2) com 0,06% (vol/vol) Tween 20 (PBST). Depois de limpar por 100 s, transfira a amostra para o microscópio para verificar se estava limpa. Em circunstâncias normais, limpa por 400 anos para garantir que a amostra estava limpa o suficiente para observar e não danificar.
2. Desidratação amostral, montagem e secagem
   1. Desidratar as amostras utilizando 20 tratamentos sucessivos em 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% e 100% (todos vol/vol) etanol. um estereótipo, use fita adesiva de dois lados de carbono para corrigir separadamente 3 superfícies de observação (ventral dorsal e lateral) em stubs. Observe que todas as superfícies de visualização devem ser mantidas limpas e livres de contaminação. Coloque o estágio da amostra em uma placa de petri contendo um dessiccante gel de sílica por 48 h.
3. Sputter-coat e inserção de amostra
   1. Usando o instrumento de sputtering de íons Hitachi Koki (E-1010), gire a VÁLVULA PRINCIPAL para a posição ABERTA, remova a tampa da câmara de amostra e coloque a amostra na câmara. Coloque o interruptor de alimentação ligado, e a luz READY estava acesa. Definir o tempo de sputtering em 45 segundos, e espessura de revestimento como 70.875 Å. Uma vez que o índice de discagem a vácuo da bomba mecânica caiu abaixo de 7, pressione o DISCHARGE e comece a pulverizar a platina. No final do experimento, desligue a fonte de alimentação e tire a amostra da câmara. Espessura do filme spray: d = KIVt ("d" é a espessura do filme na unidade de " Å "; " K" é uma constante, dependendo do metal e gás sputtered. Por exemplo, K de ar é 0,07; "Eu" é o mA unitário do fluxo de plasma; "V" é a tensão aplicada na unidade do "KV". "t" é tempo em segundos.
   2. Insira o stub contendo a amostra no estágio do SEM. Certifique-se de que o estágio da amostra com o stub amostral tenha altura suficiente para permitir uma boa imagem. Abra o software SEM e selecione uma tensão operacional desejada, começando em 20 kV.

2. TEM Preparação e Imagem de Amostras

1. Obtenha e fixe a amostra como nas etapas 1.1.1 e 1.1.2.
2. Limpeza, Fixação Secundária e Desidratação
   1. Remova o adulto C. caragana do líquido de preservação. Usando um estereótipo, remova os apêndices, lave as amostras no PBST por 3 h e, em seguida, pós-fixá-las em 1% (wt/vol) tetróxido de osmio em PBS por 1h a 25 °C. Desidratar as amostras utilizando 20 tratamentos sucessivos em 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% e 100% (todos vol/vol) etanol em temperatura ambiente.
3. Incorporação e Polimerização de resina
   1. Incorpore as amostras em resina em moldes de incorporação plana. A amostra estava na parte inferior da placa e foi colocada o mais perto possível da borda do sulco recesso. Coloque o rótulo em branco e incuba a placa contendo a amostra a 60 °C por 72 h. Remova a cápsula da incubadora e verifique se a resina havia polimerizado.
4. Secagem e Coloração de Amostras
   1. Uma vez que certifique-se de que a amostra foi solidificada, coloque cada bloco de resina um microscópio de fluorescência e fotografe-as luz azul. Mova a fonte de luz fluorescente do microscópio para que ele irradiasse a amostra de cima. Permitir que a sensilla no bloco de resina seja claramente observada. Fotografar e medir distâncias para atingir a sensilla (Figura 1).
   2. Consulte a imagem SEM das palps(Figura 2A),e corte aproximadamente o bloco de resina com uma lâmina de barbear para fechar o receptor alvo(Figura 2B).
   3. Em seguida, usando microscopia de fluorescência de luz azul, fotografe o bloco de resina aproximadamente cortado, ajustando a fonte de luz de cima para que a sensilla fosse observada claramente. A luz verde animada pela luz azul criou uma observação favorável. Ao ser imagem, o micrometro objetivo (DIV 0,01mm) foi adicionado ao estágio do microscópio de fluorescência, e então a distância do alvo foi medida pelo software ImageJ (Instituto Nacional de Saúde dos EUA) (Figura 2C). A régua de imagem foi feita pelo Adobe Photoshop CS5 (Adobe Systems, Inc., San Jose, CA, USA). Em seguida, para o corte ultramicrotome, defina a distância de corte, utilizando espessuras de fatia de 50-60 nm, até que a posição alvo fosse atingida. Use microscopia de fluorescência para identificar o receptor alvo.
   4. Monte as seções em grades de cobre de 100 malhas revestidas de Formvar, manchadas duas vezes com acetato de uranyl e citrato de chumbo.
      1. Em primeiro lugar, adicione 3,75 g de acetato uranyl a 50 mL de 50 % de metanol. Redes de manchas com uma seringa filtrada (0,45 μm) de uma solução saturada de acetato de uranyl em temperatura ambiente por 10 min. Seções de cobertura durante a coloração para bloquear precipitados induzidos pela luz. Enxágüe 2x em 50 % de metanol; 2x água desgaseada filtrada filtrada.
      2. Em segundo lugar, adicione citrate de chumbo de 0,02 g a 10 mL de água destilada desgaseada no tubo de centrífuga. Adicione 0,1 mL de hidróxido de sódio de 10 N, vedae e agite para dissolver. Redes de manchas com uma solução de citrato de chumbo por 8 min. Centrífuga antes do uso. A coloração deve ser feita em um ambiente livre de dióxido de carbono para evitar a formação de precipitados de carbonato de chumbo. Coloque gotas de mancha em praças de placas de petri de plástico. Enxágüe em água filtrada degasegasee e seca¹⁷. Observe-os via TEM operando a 80 kV.

Figura 1: Um microscópio fluorescente fotografou um bloco de resina envolvendo o apêndice da caragana clorofóbica. (A) Bloco de resina de antena; (B) Bloco de resina no final do ovipositor. A seta indicou a borda do bloco de resina; círculo pontilhado indica o alvo sensilla. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figura 2: Procedimentos do método preciso de localização sensilla. (A) O 4º subsegmento de uma palp maxilar de Clorofóbico caragana, o círculo pontilhado mostrou a sensilla alvo de SEM. (B) O 4º subsegmento de uma palp maxilar de C. caragana vista pela microscopia de fluorescência. A seta branca mostrou a borda aproximadamente cortada do bloco de resina e o círculo pontilhado mostrou a localização precisa. (C) A distância acentuada da borda do bloco de resina até o local alvo da palp maxilada (28 μm nesta amostra). Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Utilizando a solução de limpeza e fixação com tween 20, observou-se imagem SEM mais limpa do que a sem Tween 20 (Figura 3). A solução de fixação de interpolação 20 penetrou na solução de fixação de glutaraldeído no tecido. A estrutura de microtúbulos foi claramente vista. A imagem TEM da estrutura interna da amostra foi borrada sem Tween 20 (Figura 4).

Figura 3: A sensilla localizando-se na antena de Clorofóbico caragana SEM. Comparação da imagem SEM com Tween 20(A)e sem Tween 20(B),que mostrou que a imagem A é mais limpa que a imagem B em geral. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figura 4: Clorofóbico caragana visto pela microscopia eletrônica de transmissão de sensilla twig basiconica nas palps labiais. Comparação da imagem TEM com Tween 20(A)e sem Tween 20(B). A estrutura microtúbula da imagem A é clara, enquanto a da imagem B está borrada. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Usamos o SEM para estudar os tipos e ultraestruturas de sensilla nas palps de C. caragana, encontrando 4 tipos de sensilla incluindo 10 subtipos: 1 bristles de Böhm (BB.), 3 sensilla chaetica (Ch.1-Ch.3), 1 dígito sensilla (Dig.) e 5 sensilla twig basiconica (S.tb.1-S.tb.5) (Tabela 1). A identificação e a ultraestrutura sensilla foram baseadas em sua morfologia e tamanho^{18,19,20,21,22,23}. Nossos métodos de preparação de amostras renderizaram imagens claras das superfícies e ultraestruturas internas de sensilla de insetos.

Tabela 1: Tipos de sensilla nas palps de C. caragana.

Para examinar a ultraestrutura dentro da sensilla em C. caragana palps, usamos TEM. Um exemplo desses estudos foram as visões transversals contínuas do pino do S.tb.1 em palps maxiladores. As vistas mostraram que a bainha dendrítica cercou os segmentos dendriticos externos e se estendeu até o poro da ponta (Figura 5A-D). Sete segmentos dendriticos externos não ramificados existiam dentro da cavidade linfática do receptor interno, que estava cercada por uma cavidade externa (Figura 5D). O corpo tubular foi separado por uma bainha dendrítica de outros segmentos dendriticos externos em cada base de tomadasensillar(Figura 5E). Na região ciliária, observou-se 8 dendritos de diferentes diâmetros, indicando a presença de 8 neurônios bipolares. Por fim, o segmento ciliário continha 9 doublets de microtúbulo periférico(Figura 5F).

Figura 5: Tem views of sensilla tipo 1 twig basiconica (S.tb.1) em um clorophorus caragana maxillary palp³⁰. (A)S.tb.1 com linhas pontilhadas marcando regiões próximas às seções transversais tomadas para Figs. O B-E. (B)Seção transversal de protrusões em forma de dedo mostrando cuticula dispersa. (C) Seção transversal da região basal de protrusões em forma de dedo mostrando cavidades linfáticas receptoras internas sem segmentos dendriticos externos. (D) Seção transversal da região média do pino mostrando a bainha denértica dividindo a cavidade sensillum-linmph em cavidades internas e externas com 7 segmentos dendriticos externos na cavidade interna. (E) Região basal do pino mostrando o corpo tubular cercado por uma bainha dendrítica e separada de segmentos dendriticos externos. Uma célula tormogen forma o lado de fora da bainha dendrítica. (F) Trecho transversal da região ciliária mostrando 8 dendritos de diferentes diâmetros. Abreviaturas: bb, corpo basal; cs, segmento ciliário; CW, parede cuticular; DS, bainha dendrítica; iRL, cavidade linfática receptorinterna; M, microtúbulo; Mi, microvilli; oD, segmento dendriótico externo; oRL, cavidade linfática receptor externo; S.tb.1, tipo 1 sensilla twig basiconica; TB, corpo tubular; TH, célula de thecogen; TO, célula tormogena; TR, célula trichogen. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Neste artigo, apresentamos um esquema de preparação de amostras para digitalização e microscopia eletrônica de transmissão para besouro lenhador. Usando o apêndice de insetos como um sujeito representativo do estudo, demonstramos várias melhorias em relação aos métodos tradicionais de preparação de amostras.

O óleo líquido desconectado da superfície sólida é emulsificado em pequenas gotículas, que podem ser bem dispersas e suspensas no meio de lavagem para reduzir o redepósito na superfície do objeto. O desempenho de lavagem de surfactante inclui todas as características básicas como umidade, permeabilidade, emulsificante propriedade, dispersibilidade, solubilização^11,12,13,14. Efeitos de diferentes detergentes na preparação de amostras microscópicas eletrônicas do Nematode Dourado mostraram que o Tween 20 teve o melhor efeito de limpeza, seguido de bicarbonato de sódio, e água destilada²⁴. Neste estudo, descobrimos que o Tween 20 pode ser usado para reduzir a tensão superficial do líquido, e evitar que a sujeira deposite na superfície corporal do inseto, em particular para o besouro lenhador coletado diretamente no campo. A superfície do corpo de insetos foi lavada de forma mais limpa em SEM. Fixative com Interpolado 20 penetrou a parede corporal do inseto mais facilmente, e posteriormente melhores tecidos fixos e órgãos no corpo em TEM. A vantagem do surfactante na preparação da amostra de microscopia eletrônica foi extensivamente estudada^{24,25,26,27,28,29,30,31}.

Além disso, adotamos um método modificado de secagem de ar para preparação de amostras SEM, no qual a amostra desidratada foi colocada em uma placa de petri contendo um dessiccante gel de sílica que evapora gradualmente o agente desidratante. A maior vantagem deste método é que ele é simples, facilmente mantido, e mantém o ar microambiente seco e nenhum equipamento especial necessário. O método natural de secagem é um método simples, prático e eficaz para a preservação de sementes, castanhas e longo prazo de espécimes de insetos. Embora o volume amostral diminua durante o processo natural de secagem, a morfologia básica da amostra é retida^{em 32}. Em geral, os insetos Coleoptera têm conteúdo de água relativamente baixo, e sua superfície é cercada por paredes de chitin duro. A seca de ar é capaz de atender aos requisitos. No entanto, este método de secagem não é adequado para a secagem de tecidos com um grande teor de água, como louse, ácaroe e larvas, pois a tensão superficial irá deformar a amostra durante o processo de secagem.

Para observar e calcular o tipo e o número de sensilla distribuídos pela superfície do apêndice, dorsal, ventral e lateral do apêndice deve ser considerado. Alguns sensilla eram poucos, pequenos, e às vezes cobertos, escaneiam e observam cuidadosamente de todos os ângulos para encontrar aqueles sensilla totalmente salientes da epiderme ou decorrentes da depressão. Como muitos sensilla eram relativamente longos e peludos, o efeito da ponta pode ser significativo. Então, a tensão de aceleração do microscópio eletrônico não deve ser muito alta, 5-20kV foi melhor e usamos 20kV.

Na incorporação de amostras TEM, a amostra melhor perto da borda do sulco dos moldes de incorporação plana, a fim de economizar tempo ao arcar com o bloco de resina. O método TEM tradicional para cortar continuamente a resina é extenso, e geralmente é cortado cegamente usando um microscópio óptico^17,33. Para melhorar isso, primeiro exploramos uma técnica de localização de insetos sensilla em blocos incorporados à resina usando microscopia de fluorescência para visualizar e medir a distância de destino para o corte. Em comparação com o método tradicional de corte DE TEM, essa tecnologia pode economizar tempo de preparação da amostra e localizar com mais precisão o sensor alvo. Na ausência de software de medição, uma régua dimensionada pode ser colocada no campo de visão para medir aproximadamente a distância de destino. A combinação de um ultramicrotome com um microscópio de fluorescência fornece observações claras do processo de corte, produzindo cortes precisos de sensibilidade alvo e outros assuntos apropriados.

Não temos conflito de interesses para divulgar.

Agradecemos a generosa assistência do Beijing Vocational College of Agriculture, do Instituto para a Aplicação da Energia Atômica (Academia Chinesa de Ciência agrícola), do Centro de Biopesquisa da Universidade Florestal de Pequim e do Professor Shan-gan. Zhang do Instituto de Zoologia da Academia Chinesa de Ciências. Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa Nacional de P&D da China (2017YFD0600103), da Fundação Nacional de Ciência Natural da China (Grant nº 31570643, 81774015), Pesquisa Científica Florestal no Bem-Estar Público da China (201504304), Mongólia Interior Plano de Startups de Pesquisa de Talentos de alto nível da Universidade Agrícola (203206038) e projeto de pesquisa de ensino superior da Região Autônoma da Mongólia Interior (NJZZ18047), Região Autônoma da Mongólia Interior Linxue "Dupla primeira classe" Projeto de Construção (170001).