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Este protocolo detalha a metodologia para quantificar o comportamento locomotor e sono na mexicana cavefish. Análises anteriores são ampliadas para medir esses comportamentos socialmente alojados em peixes. Este sistema pode ser amplamente aplicado para estudar o sono e a atividade em outras espécies de peixes.
Em filos, sono é caracterizado por altamente conservadas características comportamentais que incluem o limiar de excitação elevado, rebote após privação de sono e consolidaram a períodos de imobilidade comportamental. O mexicano cavefish, Astyanax mexicanus (a. mexicanus), é um modelo para estudar a evolução do traço em resposta à perturbação ambiental. A. mexicanus existir como formas de superfície-moradia olhos e várias populações de cavernas cegas que apresentam diferenças morfológicas e comportamentais robustas. Perda de sono tem ocorrido em várias populações cavefish evoluiu de modo independente. Este protocolo descreve uma metodologia para quantificação de sono e atividade locomotora na . mexicanus caverna e peixe de superfície. Um sistema de monitoramento de vídeo econômico permite comportamental de imagem de peixe de larvas ou adultos alojados individualmente por períodos de uma semana ou mais. O sistema pode ser aplicado a pescar envelhecido 4 dias pós fertilização através da vida adulta. A abordagem também pode ser adaptada para medir os efeitos de interações sociais no sono, gravando vários peixes em um único arena. Na sequência de gravações comportamentais, dados são analisados usando automated software de rastreamento e análise do sono é processada usando scripts personalizados que quantificam múltiplas variáveis de sono, incluindo duração, comprimento de tal e tal número. Este sistema pode ser aplicado a medida de sono, comportamento circadiano e atividade locomotora em quase qualquer espécie de peixe, incluindo zebrafish e famílias.
Sono é altamente conservado em todo o reino animal nos níveis fisiológicos, funcionais e comportamentais1,2,3. Enquanto o sono em animais de laboratório mamíferos normalmente é avaliado por meio de eletroencefalogramas um e outro, gravações eletrofisiológicas são menos práticas em sistemas de pequeno modelo geneticamente favoráveis e assim o sono normalmente é medido com base no comportamento3 , 4. características comportamentais associadas com o sono são altamente conservadas em todo o reino animal e incluem o limiar de excitação aumentada, reversibilidade com estimulação e prolongada quiescência comportamental5. Estas medidas podem ser usadas para caracterizar o sono nos animais que vão desde o verme nematoide, c. elegans, através de de seres humanos6.
O uso de quiescência comportamental para caracterizar o sono requer software de rastreamento automatizado. Com software de rastreamento, períodos de actividade e imobilidade são detectados durante um número de dias, e longos períodos de inatividade são classificados como dormir7,8. Nos últimos anos, foram desenvolvidos vários sistemas de rastreamento para a aquisição de dados de atividade entre uma diversidade de sistemas de pequeno modelo geneticamente favorável; incluindo os vermes, moscas de fruta e peixe9,10,11. Estes programas são acompanhados por um software que permite o rastreamento automatizado do comportamento animal, incluindo ambos freeware de código aberto e software comercialmente disponível7,12,13,14 . Esses sistemas diferem em sua flexibilidade e permitem eficiente triagem e caracterização de fenótipos de sono em numerosos modelos geneticamente alteráveis.
Investigação genética de sono no peixe-zebra, Danio rerio, levou à identificação de vários genes e circuitos neurais que regulam o sono15,16. Enquanto isso forneceu um poderoso sistema para investigar a base neural do sono em um animal de laboratório de vertebrados, é muito menos conhecida sobre como sono evolui e como natural variação contribui para dormir o regulamento. O mexicano cavefish, Astyanax mexicanus (A. mexicanus), evoluíram dramáticas diferenças no sono, atividade locomotora e ritmos circadianos17,18. Estes peixes existem como olhos superfície peixes que habitam os rios do México e sul do Texas e pelo menos 29 da caverna das populações em torno da região de Sierra Del Abra de México nordeste19,20,21. Notavelmente, muitas diferenças comportamentais, incluindo a perda de sono, parecem ter surgido independentemente em vários cavefish populações14,22. Portanto, cavefish fornecer um modelo para investigar a evolução convergente de sono, circadiano e comportamentos sociais.
Este protocolo descreve um sistema de medição do sono e comportamento locomotor na . mexicanus larvas e adultos. Um sistema de gravação baseado em infravermelho Custom-Built permite a gravação de vídeo de animais em condições claras e escuras. Software disponível comercialmente pode ser usado para medir a atividade e macros personalizadas são usadas para quantificar os diversos aspectos de inatividade e determinar os períodos de sono. Este protocolo descreve também modificações experimentais para controlar a atividade de vários animais dentro de um tanque, fornecendo a capacidade de analisar as interações entre o sono e comportamentos sociais. Estes sistemas podem ser aplicados a medida de sono, comportamento circadiano e atividade locomotora em espécies de peixe adicionais incluindo zebrafish e famílias.
Nota: Criar sistemas de controle comportamental em larvas e adultos.
1. construir um sistema de sono para larvas
Nota: O sistema de monitoramento para controle larval através de juvenis com idades entre 4 dias pós fertilização (dpf) através do dpf 30 a. mexicanus requer várias peças de equipamento, incluindo iluminação infravermelha (IR), luz difusores de acrílico IR, automatizado luz controles (temporizadores), computadores, câmeras e materiais secundários, tais como a fiação e controladores de potência (figura 1A). As instruções a seguir informará como construir um sistema para controlar com precisão o comportamento locomotor para estudar o sono e os ritmos circadianos em larval a. mexicanus.
2. sistema de dormir para adultos
3. gravação atividade locomotora
Nota: Todas as gravações comportamentais são feitas usando um padrão de notebook ou desktop com uma fonte de bateria de backup. Devido ao grande tamanho do arquivo de uma gravação (60-100 GB) 24h, salve todas as gravações em discos rígidos externos.
4. análise da atividade locomotora em individualmente alojado peixe usando Automated Software de rastreamento
5. rastreamento socialmente alojado peixe
6. a extração de dados do sono de atividade locomotora
Nota: A definição comportamental de sono em larvas e adultos a. mexicanus é 1 min ou mais de quiescência. Esta definição foi determinada usando experimentos de limiar de excitação, onde um maior estímulo sensorial é necessária para iniciar uma resposta comportamental em um estado de sono (> 60 s) comparado ao acordar14,17. Conta para pequenos movimentos e deriva comum para os ciprinídeos, há limites de velocidade são aplicados para segregar o movimento real do ruído ou deriva. Estes limites são computacionalmente-derivado comparando as correlações entre distância e duração de sono para encontrar os valores de R-quadrado mais altos; desse modo, determinar a velocidade mais precisa para o movimento e sono. Para peixes larvas, os limites superiores e inferiores são ambos 12 mm/s como lá é pouca ou nenhuma tração. Para peixes adultos o limite inferior é de 2 cm/s, com um limite máximo de 4 cm/s para conta para drift.
Idades de larvas que DPF 4-30 pode confiantemente ser registados no sistema fechado personalizado-Compilação descrito na Figura 1. O sistema inclui IR e iluminação visível para permitir gravações em condições claras e escuras, sob diferentes condições de luz visíveis (figura 1A). Os vídeos são então analisaram usando software de rastreamento (figura 1BC) e pós-processados usando uma macro personalizada sono (ver Download suplementar). Larval peixes de três populações independentes cavefish exibir uma redução significativa no sono em relação ao peixe de superfície (Figura 1) e 20 dpf, e esta perda de sono é consistente em estádios de desenvolvimento. A idade do peixe analisado para dormir é muitas vezes dependente da manipulação experimental. Por exemplo, a. mexicanus não consomem alimentos em 4 dias, então experimentos examinar interações entre o sono e a alimentação normalmente ocorreria em mais velho larvas25. Por outro lado, morpholinos só são eficazes em início frite (normalmente menos de 4 dpf) para que esta idade é usado para bundas sono24,26,27.
A. mexicanus pode viver até 30 anos em laboratório, mas experimentos usando adultos normalmente são realizados em peixes, com idades entre 6 meses a 3 anos. Peixes podem ser gravadas em uma variedade de tamanhos de tanque, dependendo do experimento e iluminação IR permite gravações durante períodos de claro e escuros (Figura 2A). Arenas individuais são rotulados em rastreamento para permitir rastreamento de peixe, e pós-processamento usando uma macro personalizada fornece uma leitura de sono (Figura 2BC). Sono é significativamente reduzido no cavefish Pachón, Molino e Tinaja, comparado com peixes de superfície (Figura 2D). Além disso, este sistema permite a gravação vários peixes em um único arena (tipicamente galão 10 tanques), permitindo a análise de interações sociais como afetam o sono (Figura 2EF). Habitação social robustamente reduz o sono em peixes de superfície, sem afetar o sono em Pachón cavefish (Figura 2). A falta de efeito no cavefish é provavelmente devido a um efeito de porão, onde cavefish dormir pouco, particularmente nas maiores arenas usados para examinar o comportamento social.
Figura 1: Comportamento de sono de gravação em larvas e juvenis a. mexicanus. (A) esquema de instalação do comportamento de sono larval: Larva são colocados em uma plataforma dentro de um tubo de luz controlada. Sistemas de iluminação de infravermelho e branco sente-se abaixo o peixe no fundo do tubo. Uma câmera IR-pass fica no topo do tubo e está conectada a um computador portátil em que o vídeo é gravado. Todos os sistemas de energia (iluminação e laptop) estão ligados à energia de reserva. (B) configurações de Arena em software de rastreamento. As larvas individuais são mantidas em poços de uma placa de cultura de tecidos, e arenas (ciano) são feitos para cada animal. (C) Aparelho Locomotor traços de comportamento locomotor do peixe após adquirir os dados no software de rastreamento. Traços vermelhos representam 10 s de atividade em peixes 20 dias de idade. (D) resultando dormir dados do software de rastreamento. Cavefish juvenil converge para comportamento de sono reduzida, comparado a peixes de superfície morfos (One-Way ANOVA F(3, 116) = 76.12; Análise post-hoc de Dunnett foi aplicado para comparar cada população cavefish com peixes de superfície, P < 0,001). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Sistema de adulto a. mexicanus para sono e comportamento circadiano. (A) diagrama do sistema de sono-gravação: peixes são mantidos em tanques em uma cremalheira em frente das câmeras de monitoramento. Um sistema de iluminação infravermelha é colocado atrás dos tanques de peixe, enquanto Câmeras IR-pass estão conectadas a um computador portátil para gravação de comportamento. Todos os sistemas de alimentação estão conectados a um sistema de bateria de backup em caso de flutuações de energia. Arena (B) configuração no software de rastreamento. Peixes individuais são marcados por criando arenas separados (ciano) para controlar o comportamento locomotor. (C) representante locomotoras faixas (linhas vermelhas) de peixe individual após adquirir uma gravação comportamental em software de rastreamento. Traços representam 20 s da atividade. Duração de sono Total (D) mais de 24 h é significativamente reduzida em três populações distintas de cavefish comparado a peixes de superfície (One-Way ANOVA F(3, 106) = 52.66; Testes de post-hoc de Dunnett foram aplicados entre os peixes de superfície e cada população de caverna, P < 0,001). (E) A única tanque contendo vários peixes, na qual uma arena (laranja) é feito para controlar o sono e interações sociais. (F) Aparelho Locomotor traços de vários peixes após a aquisição de dados no software (cada cor de linha representa um peixe individual) de rastreamento. (G) dados representativos da superfície e Pachón cavefish no sono social de rastreamento. Peixe de superfície reduzir significativamente o sono em tanques de 10 L comparado a arenas de 2L; Superfície peixe sono é reduzido quando peixe socialmente está alojado. Cavefish sono não é significativamente alterado em qualquer condição (Two-Way ANOVA F(2,46) = 4.545; análise post hoc foi realizada dentro de cada população para testar o efeito do tamanho do tanque e o Estado social, no total de sono 10 L single, P = 0,013; 10 L Social, P = 0.0003). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Este protocolo descreve um sistema personalizado para quantificar o sono e a atividade locomotora em cavefish larval e adulto. Cavefish têm emergido como o principal modelo para o estudo da evolução do sono que pode ser usado para investigar a base genética e neural do sono Regulamento1. Os passos críticos neste protocolo incluem a otimização da iluminação e qualidade de vídeo para garantir a precisão de rastreamento que é necessária quantificar o sono. O sistema de aquisição e análise descritos aqui são totalmente funcionais, como muitos outros sistemas, comerciais e personalizados, para quantificar a locomoção e comportamento28,29,30. O ensaio anterior, examinando o sono no único peixe pode ser estendido para permitir a análise dos peixes alojados em grupo. É uma consideração importante quando solução de problemas ou projetar os ensaios o confunde comportamento social pode ter sobre o sono de um indivíduo. Por exemplo, agressão é comum em Astyanax, e níveis de agressão diferem entre os peixes de superfície e cavefish31. Otimizando o número de peixes, tamanho da arena e proporção sexual, a fim de minimizar a agressão permitirá medições reproduzíveis do Regulamento do sono.
Uma limitação da técnica, conforme descrito, é uma falta de confiabilidade peixe individual durante todo o ensaio a seguir. Automatizado de rastreamento animal mudará frequentemente animais quando entram em contato próximo. Isto pode ser resolvido pela otimização cuidadosa dos limiares, ou corrigindo manualmente qualquer switches. Além disso, o sistema descrito não é um sistema de escoamento, e portanto, qualidade da água pode se tornar um problema depois de gravações que dura mais de alguns dias. Outro fluxo através de sistemas têm sido descritos em zebrafish13 e estas prontamente poderiam ser aplicadas para o chiqueiro de cavefish mexicano.
A metodologia descrita é significativa por causa de sua ampla aplicabilidade para medir o comportamento de espécies de peixes diversos. Sono... ainda tem que ser caracterizada em quase qualquer peixe de água doce ou marinha incluindo Sticklebacks, ciclídeos e espadas32,33,34. A versatilidade deste sistema para medir o sono na . mexicanus e outros modelos de peixe pode abordar diversas perguntas sobre a evolução e as bases genéticas da sono. O hardware associado com este sistema é altamente rentável, tornando-se altamente acessível e proporcionando potencial para análise de alta taxa de transferência de farmacológicos e análise ecotoxilogical do sono e a atividade locomotora.
Os autores declaram que eles têm não tem interesses concorrente.
Este trabalho foi financiado pelo prêmio NIGMS GM127872 ACK, NINDS prêmio 105072 ERD e ACK e prêmio NSF 1656574 de ACK.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
12 V power adaptor | Environmental Lights | 24 Watt 12 VDC Power Supply | |
Acrylic dividers (adults) | TAP Plastic | Order sheets in sizes as needed | |
Adult infrared light power source | Environmnental Lights 24 Watt 12 VDC Power Supply | ||
Battery pack | CyberPower | CP850PFCLCD | |
Camera lens (adult) | Navitar Zoom 7000 | Zoom 7000 | |
Camera lens (larval) | Fujian 35mm f/1.7 | B01CHX7668 | Purchase on Amazon |
Camera lens adapter | d | 1524219 | |
Camera mount | CowboyStudio Super Clamp | B002LV7X1K | Purchase on Amazon |
Fish tank | Deep Blue Professional | ADB11006 | |
Heat sink (adult) | M-D Building products | SKU: 61085 | Cut to fit |
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Infrared lights (adults) | Environmental Lights Infrared 850 nm 5050 LED strip | irrf850-5050-60-reel | Cut to fit |
Infrared lights (larval) | LED World | B00MO9H7H4 | Purchase on Amazon |
IR-diffusing acrylic | TAP Plastic | Order sheets in sizes as needed | |
Laptop/computer | N/A | N/A | Any laptop will work. |
LED light | Chanzon 10 High Power Led Chip 3W White (6000K-6500K/600mA-700mA/DC 3V-3.4V/3 Watt) | B06XKTRSP7 | Use with Chanzon 25 pcs 1 W, 3 W, 5 W LED Heat Sink (2 pin Black) Aluminum Base Plate Panel |
light timer | Century 24 Hour Plug-in Mechanical Timer Grounded | ||
Plastic wall mount for IR | Everbilt Plastic pegboard | Model # 17961 | |
Power cable | BNTECHGO 22 Gauge Silicone Wire | B01K4RPE0Y | |
Power source | Rapid LED | MOONLIGHT DRIVER (350MA) | |
Tissue culture plates | Fisherbrand | 12-well (FB012928) 24-well (FB012929) | |
Tripod Ball head | Demon DB-44 | B00TQ54CZO | Purchase on Amazon |
USB Hardrive | Seagate 3TB backup | STDT3000100 | |
USB Webcam | Microsoft LifeCam | Q2F-00014 | Purchase on Amazon |
Wall mount for camera | LDR Industries 1/2" Steel pipe | 307 12X36 | Mounted on wall with Flange and 90° pipe elbow. Could also use a tripod to hold camera. |
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