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Este protocolo detalla la metodología para cuantificar el comportamiento locomotor y sueño en el mexicano cavefish. Análisis anteriores se extienden para medir estos comportamientos en pescados ubicado socialmente. Este sistema puede ser ampliamente aplicado para el estudio de sueño y actividad en otras especies de peces.
A través de phyla, sueño se caracteriza por características de comportamiento altamente conservadas que incluyen umbral de excitación elevados, rebotan tras privación de sueño y consolidaron períodos de inmovilidad conductual. El mexicano cavefish, Astyanax mexicanus (a. mexicanus), es un modelo para estudiar la evolución del rasgo en respuesta a la perturbación ambiental. A. mexicanus existen ojos formas de superficie y varias poblaciones cavernícolas ciegas que tienen diferencias morfológicas y de comportamiento robustas. La pérdida de sueño ha ocurrido en múltiples poblaciones cavefish evolucionó independientemente. Este protocolo describe una metodología para la cuantificación de sueño y actividad locomotriz en cueva a. mexicanus y peces de superficie. Un sistema de vigilancia de video rentable permite la conducta la proyección de imagen de peces adultos o larvas alojadas individualmente por períodos de una semana o más. El sistema puede aplicarse a los peces de 4 días post fertilización hasta la edad adulta. El enfoque puede ser adaptado también para medir los efectos de las interacciones sociales en sueño registrando varios peces en una sola arena. Tras grabaciones de comportamiento, datos se analizaron usando automatizado de software de seguimiento y análisis de sueño es procesado usando scripts personalizados que cuantifican variables múltiples de sueño incluyendo duración, longitud de pelea y pelea número. Este sistema puede aplicarse a medida sueño y comportamiento circadiano locomotor actividad en casi cualquier especie de peces como el pez cebra y espinosos.
Sueño se conserva altamente en todo el reino animal en los niveles fisiológicos, funcionales y conductuales1,2,3. Mientras sueño en los animales mamíferos de laboratorio normalmente se evalúa mediante electroencefalogramas, las grabaciones electrofisiológicas son menos prácticas en sistemas pequeños modelo genéticamente susceptibles y así dormir normalmente se mide en base a comportamiento3 , 4. características de comportamiento asociadas con el sueño están muy conservadas a lo largo del reino animal e incluyen umbral de excitación creciente, reversibilidad con estimulación y prolongada inactividad conductual5. Estas medidas se pueden utilizar para caracterizar el sueño en los animales que van desde el gusano nematodo C. elegans, a través de los seres humanos6.
El uso de quietud conductual para caracterizar el sueño requiere software de rastreo automatizado. Con software de seguimiento, se determinan periodos de actividad e inmovilidad durante varios días y largos períodos de inactividad se clasifican como dormir7,8. En los últimos años se han desarrollado múltiples sistemas de seguimiento para la adquisición de datos de actividad entre una diversidad de sistemas de la pequeña modelo genéticamente susceptibles; como gusanos, moscas de la fruta y pescado9,10,11. Estos programas van acompañados de software que permite el seguimiento automatizado del comportamiento animal, incluyendo freeware de código abierto y software disponibles en el mercado7,12,13,14 . Estos sistemas difieren en su flexibilidad y permitan la eficiente detección y caracterización de los fenotipos de sueño en numerosos modelos genéticamente modificable.
Investigación genética del sueño en el pez cebra, Danio rerio, ha llevado a la identificación de numerosos genes y circuitos neuronales que regulan el sueño15,16. Mientras que esto ha proporcionado un sistema poderoso para investigar la base neural del sueño en un animal de laboratorio vertebrados, es mucho menos conocida sobre cómo evoluciona el sueño y cómo natural variación contribuye a dormir Reglamento. El mexicano cavefish, Astyanax mexicanus (A. mexicanus), han evolucionado las diferencias dramáticas en el sueño, la actividad locomotriz y ritmos circadianos17,18. Estos peces existen ojos superficie peces que habitan en los ríos de México y sur de Texas y al menos 29 cueva las poblaciones de la región de la Sierra Del Abra del noreste de México19,20,21. Notablemente, muchas diferencias conductuales, incluyendo la pérdida de sueño, parecen haber emergido independientemente en varias poblaciones de cavefish14,22. Por lo tanto, cavefish proporciona un modelo para la investigación de la evolución convergente de sueño, circadiano y comportamientos sociales.
Este protocolo describe un sistema para medir el sueño y el comportamiento locomotor en A. mexicanus de larvas y adultos. Un sistema de grabación basado en infrarrojos a la medida permite la grabación de vídeo de animales bajo condiciones de luz y oscuridad. Software disponible comercialmente puede utilizarse para medir la actividad y macros personalizadas se utilizan para cuantificar varios aspectos de inactividad y determinar periodos de sueño. Este protocolo también describe modificaciones experimentales para el seguimiento de la actividad de múltiples animales dentro de un tanque, proporcionando la capacidad de examinar las interacciones entre el sueño y comportamientos sociales. Estos sistemas pueden aplicarse a la medida de sueño y comportamiento circadiano locomotor actividad en especies de peces adicionales incluyendo el pez cebra y espinosos.
Nota: Establecer sistemas para el seguimiento conductual en larvas y adultos.
1. construir un sistema de descanso para las larvas
Nota: El sistema de monitoreo para seguimiento de larva a través de peces menores de edad 4 días post fecundación (dpf) a través 30 PD a. mexicanus requiere varios equipos incluyendo iluminación infrarrojos (IR), difusores de acrílico IR ligeros, automatizado luz controles (temporizadores), computadoras, cámaras y materiales secundarios como cableado y reguladores de potencia (figura 1A). Las siguientes instrucciones le informará cómo construir un sistema de seguimiento preciso comportamiento locomotor para estudio de sueño y ritmos circadianos en larvas mexicanus a.
2. sistema de dormir para adultos
3. registro actividad locomotriz
Nota: Todas las grabaciones del comportamiento se realizan con un ordenador estándar portátil o escritorio con una fuente de batería de respaldo. Debido al tamaño de archivo grande de un 24 h de grabación (60-100 GB), guardar todas las grabaciones en discos duros externos.
4. Análisis de la actividad locomotriz en individual encuentra peces usando automatizado de Software de seguimiento
5. seguimiento social encuentra peces
6. extracción de los datos de sueño de la actividad locomotriz
Nota: La definición de comportamiento del sueño en larvas y adultos de a. mexicanus es 1 min o más de inactividad. Esta definición se determinó utilizando experimentos de umbral de excitación, donde un mayor estímulo sensorial es necesaria para iniciar una respuesta conductual en un estado de hibernación (> 60 s) comparado con el despertar14,17. Para tener en cuenta para que pequeños movimientos y común a la deriva para la pesca de especies, se aplican límites de velocidad para segregar el movimiento real de ruido o deriva. Estos umbrales son derivados de cómputo mediante la comparación de las correlaciones entre la distancia y duración del sueño para encontrar los valores más altos de R-squared; determinando la velocidad más exacta para el movimiento y el sueño. Peces larvales, los límites superiores e inferiores son ambos 12 mm/s ya que es poco o no deriva. Para peces adultos el límite inferior es de 2 cm/s con un límite superior de 4 cm/s a cuenta de la deriva.
Edad de las larvas que DPF 4-30 puede ser confiablemente registrado en el sistema cerrado de la medida descrito en la figura 1. El sistema incluye IR y luz visible para permitir grabaciones en condiciones de luz y oscuridad, bajo diferentes condiciones de luz visibles (figura 1A). Los videos son luego analizan utilizando el software de seguimiento (figura 1BC) y post procesaron utilizando una macro personalizada sueño (ver Descargar suplementario). Peces larvales de tres poblaciones independientes cavefish mostrar una reducción significativa en el sueño frente a peces de superficie (figura 1) y 20 PD, y la pérdida de este sueño es consistente a través de etapas de desarrollo. La edad de los peces analizados para dormir depende a menudo la manipulación experimental. Por ejemplo, a. mexicanus no consumir alimentos en 4 días, por lo que experimentos examinando las interacciones entre el sueño y la alimentación ocurren típicamente en las larvas mayores25. Por el contrario, morfolinos sólo son eficaces en alevines temprana (típicamente menores de dpf 4) esta edad se emplea para evaluar sueño24,26,27.
A. mexicanus puede vivir hasta 30 años en el laboratorio, pero los experimentos con adultos se realizan normalmente en el pescado de 6 meses a 3 años. Peces pueden grabarse en una variedad de tamaños de tanque dependiendo el experimento e iluminación IR permite grabaciones durante los períodos de luz y oscuridad (figura 2A). Arenas individuales están marcados en seguimiento para permitir el seguimiento de los peces, y posterior procesamiento utilizando una macro personalizada proporciona una lectura de sueño (figura 2BC). Sueño se reduce significativamente en cavefish Pachón, el Molino y la Tinaja, en comparación con peces de superficie (Figura 2D). Además, este sistema permite la grabación varios peces en un solo ámbito (normalmente tanques de 10 galones), permitiendo para el análisis de las interacciones sociales cómo afectan el sueño (Figura 2EF). Vivienda social robusta reduce el sueño en los peces de superficie, sin afectar el sueño en cavefish Pachón (figura 2). La falta de efecto en cavefish es probablemente debido a un efecto del sótano, donde cavefish duermen poco, particularmente en las arenas más grandes utilizadas para examinar el comportamiento social.
Figura 1: Comportamiento de sueño de grabación en larvas y juveniles a. mexicanus. (A) esquema de configuración de comportamiento larval del sueño: la Larva se colocan en una plataforma dentro de un tubo de luz-controlada. Sistemas de iluminación infrarroja y blanco sentarse debajo de los peces en el fondo del tubo. Una cámara IR-pass se encuentra en la parte superior del tubo y se conecta a un ordenador portátil en el que se graba el video. Todos los sistemas de potencia (iluminación y laptop) están conectados a energía de respaldo. (B) configuración de Arena en el software de seguimiento. Individuales larvas se mantienen en los pozos de una placa de cultivo de tejidos, y arenas (cian) se hacen para cada animal. (C) Aparato Locomotor rastros de comportamiento locomotor de pescado después de adquirir los datos en el software de seguimiento. Trazas rojas representan 10 s de actividad en peces de 20 días de edad. (D) resultando dormir datos de software de seguimiento. Cavefish juvenil converge sobre comportamiento de sueño reducida en comparación con peces superficie morfos (One-Way ANOVA F(3, 116) = 76.12; Se aplicación análisis post-hoc de Dunnett para comparar cada población cavefish con peces de superficie, P < 0.001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Sistema de adultos a. mexicanus de sueño y comportamiento circadiano. (A) diagrama de sistema de grabación de sueño: pescado se llevan a cabo en tanques en un estante enfrente de las cámaras de seguimiento. Un sistema de iluminación infrarrojo se coloca detrás de los tanques de peces, mientras que las cámaras IR-pass están conectadas a un ordenador portátil para la grabación de comportamiento. Todos los sistemas de potencia están conectados a un sistema de batería de respaldo en caso de fluctuaciones de electricidad. (B) Arena de configuración en el software de seguimiento. Cada pez se marca mediante la creación de distintas arenas (cyan) para rastrear el comportamiento locomotor. (C) representante locomotor las pistas (líneas rojas) de cada pez después de adquirir una conducta grabación en el software de seguimiento. Rastros representan 20 s de actividad. Duración Total (D) más de 24 h se reduce significativamente en tres poblaciones distintas de cavefish frente a peces de superficie (One-Way ANOVA F(3, 106) = 52.66; Pruebas post-hoc de Dunnett se aplicaron entre peces de superficie y cada población de la cueva, P < 0.001). (E) A tank solo que contenga varios peces en el que se hace uno arena (naranja) de sueño y las interacciones sociales. (F) Aparato Locomotor rastros de múltiples peces después de la adquisición de datos en el seguimiento de software (cada línea de color representa un pez determinado). (G) datos representativos de la superficie y Pachón cavefish en sueño social de seguimiento. Superficie peces reducen significativamente el sueño en tanques de 10 litros en comparación con arenas de 2 L; Sueño peces de superficie se reduce más cuando socialmente se encuentran peces. Cavefish sueño no es alterado en cualquier condición (ANOVA de dos vías F(2,46) = 4.545; análisis post-hoc se realizó dentro de cada población para probar el efecto del tamaño del tanque y del estado social en solo 10 L de sueño total, P = 0,013; 10 L Social, P = 0.0003). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Este protocolo describe un sistema de medida para cuantificar el sueño y la actividad locomotriz en larvas y adultos cavefish. Cavefish ha surgido como un líder modelo para el estudio de la evolución del sueño que se puede utilizar para investigar la base genética y de los nerviosas de sueño Reglamento1. Los pasos críticos en este protocolo incluyen la optimización de la iluminación y calidad de vídeo para asegurar un seguimiento preciso es necesaria cuantificar el sueño. El sistema de adquisición y análisis aquí descritos son totalmente funcionales, como muchos otros sistemas, comerciales y a la medida, para cuantificar la locomoción y el comportamiento28,29,30. El anterior ensayo examen de sueño en los peces solo puede ampliarse para permitir el análisis de peces ubicado en grupo. Una consideración importante cuando solución de problemas o diseñar ensayos es la confunde comportamiento social puede tener sobre el sueño de un individuo. Por ejemplo, la agresión es común en Astyanax, y niveles de agresión difieren entre los peces de superficie y cavefish31. Optimizar el número de peces, el tamaño de la arena y la sex ratio, con el fin de minimizar la agresión permitirá mediciones reproducibles de la regulación del sueño.
Una limitación de la técnica, como se describe, es la falta de fiabilidad tras cada pez a lo largo del ensayo. Automatizado seguimiento animal cambiará a menudo animales cuando entran en contacto. Esto puede abordarse por la optimización cuidadosa de los umbrales, o corrigiendo manualmente los interruptores. Además, el sistema descrito no es un sistema de flujo, y por lo tanto, la calidad del agua puede convertirse en un problema después de grabaciones duran más de unos pocos días. Se han descrito otros flujo a través de sistemas en pez cebra13 y estos podían aplicarse fácilmente a la sty de cavefish mexicano.
La metodología descrita es significativa debido a su amplia aplicabilidad para medir el comportamiento de diversas especies. Sueño aún no se ha caracterizado en casi cualquier pez de agua dulce o Marina incluyendo espinosos, cíclidos y swordtails32,33,34. La versatilidad de este sistema para medir el sueño en a. mexicanus y otros modelos de peces puede abordar diversas preguntas sobre la evolución y los fundamentos genéticos del sueño. El hardware asociado a este sistema es altamente rentable, lo que es muy accesible y ofrece potencial de análisis de alto rendimiento de farmacológico y ecotoxilogical de sueño y actividad locomotora.
Los autores declaran que no tienen intereses que compiten.
Este trabajo fue apoyado por NIGMS GM127872 ACK, NINDS Premio 105072 ERD y ACK y Premio NSF 1656574 ACK.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
12 V power adaptor | Environmental Lights | 24 Watt 12 VDC Power Supply | |
Acrylic dividers (adults) | TAP Plastic | Order sheets in sizes as needed | |
Adult infrared light power source | Environmnental Lights 24 Watt 12 VDC Power Supply | ||
Battery pack | CyberPower | CP850PFCLCD | |
Camera lens (adult) | Navitar Zoom 7000 | Zoom 7000 | |
Camera lens (larval) | Fujian 35mm f/1.7 | B01CHX7668 | Purchase on Amazon |
Camera lens adapter | d | 1524219 | |
Camera mount | CowboyStudio Super Clamp | B002LV7X1K | Purchase on Amazon |
Fish tank | Deep Blue Professional | ADB11006 | |
Heat sink (adult) | M-D Building products | SKU: 61085 | Cut to fit |
Heat sink (larval) | M-D Building products | SKU: 57000 | Cut to fit |
Infrared lights (adults) | Environmental Lights Infrared 850 nm 5050 LED strip | irrf850-5050-60-reel | Cut to fit |
Infrared lights (larval) | LED World | B00MO9H7H4 | Purchase on Amazon |
IR-diffusing acrylic | TAP Plastic | Order sheets in sizes as needed | |
Laptop/computer | N/A | N/A | Any laptop will work. |
LED light | Chanzon 10 High Power Led Chip 3W White (6000K-6500K/600mA-700mA/DC 3V-3.4V/3 Watt) | B06XKTRSP7 | Use with Chanzon 25 pcs 1 W, 3 W, 5 W LED Heat Sink (2 pin Black) Aluminum Base Plate Panel |
light timer | Century 24 Hour Plug-in Mechanical Timer Grounded | ||
Plastic wall mount for IR | Everbilt Plastic pegboard | Model # 17961 | |
Power cable | BNTECHGO 22 Gauge Silicone Wire | B01K4RPE0Y | |
Power source | Rapid LED | MOONLIGHT DRIVER (350MA) | |
Tissue culture plates | Fisherbrand | 12-well (FB012928) 24-well (FB012929) | |
Tripod Ball head | Demon DB-44 | B00TQ54CZO | Purchase on Amazon |
USB Hardrive | Seagate 3TB backup | STDT3000100 | |
USB Webcam | Microsoft LifeCam | Q2F-00014 | Purchase on Amazon |
Wall mount for camera | LDR Industries 1/2" Steel pipe | 307 12X36 | Mounted on wall with Flange and 90° pipe elbow. Could also use a tripod to hold camera. |
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