墨西哥河鱼睡眠和睡眠活动的自动测量

该协议详细介绍了在墨西哥的运动行为和睡眠的量化方法。以前的分析扩展到衡量这些行为在社会居住的鱼。该系统可广泛应用于其他鱼类的睡眠和活动研究。

在整个植物区, 睡眠的特点是高度保守的行为特征, 包括提高唤醒阈值, 睡眠剥夺后反弹, 和巩固的行为不动期。墨西哥紫外鱼是研究环境扰动下性状演化的模型. mexicanus存在于眼睛表面居住的形态和多个盲孔居住种群中, 它们具有强烈的形态和行为差异。睡眠丧失发生在多个独立进化的空基鱼种群中。该方案描述了一种定量的方法, 在a. mexicanus洞穴和水面鱼类的睡眠和运动活动。一个经济高效的视频监控系统允许个人居住的幼虫或成年鱼的行为成像一周或更长时间。该系统可应用于成年后4天的鱼类。这种方法也可以用来测量社会交往对睡眠的影响, 在一个竞技场上记录多条鱼。在行为记录之后, 使用自动跟踪软件对数据进行分析, 并使用自定义脚本进行处理, 这些脚本量化多个睡眠变量, 包括持续时间、回合长度和回合数。该系统可用于测量睡眠, 生理行为, 和运动活动, 在几乎任何鱼类物种, 包括斑马鱼和粘滞。

睡眠在生理、功能和行为水平^{1、2、3 上在}整个动物王国高度保守。虽然哺乳动物实验室动物的睡眠通常是用脑电图来评估的, 但在小的基因间可利用的模型系统中, 电生理记录就不那么实用了, 因此睡眠通常是根据行为来衡量的^,4. 与睡眠相关的行为特征在整个动物王国高度保守, 包括增加唤醒阈值、刺激可逆性和长时间^{的行为静止 5}。这些措施可以用来描述动物的睡眠, 从线虫, 线虫, 通过人类 6 .

使用行为静止来描述睡眠需要自动跟踪软件。使用跟踪软件, 活动周期和不活动期在几天内确定, 长时间不活动被归类为^{睡眠 7,8}。近年来, 开发了多个跟踪系统, 用于获取各种适合基因的小型模型系统中的活动数据;包括蠕虫、果蝇和鱼^9,10,11。这些程序附有允许自动跟踪动物行为的软件, 包括开源免费软件和商业上可用的软件^{7、12、13、14}.这些系统在灵活性上有所不同, 允许在许多基因修正模型中有效地筛选和表征睡眠表型。

斑马鱼睡眠的基因调查,达尼奥雷里奥, 已经导致识别了许多基因和神经回路, 调节睡眠^15,16。虽然这提供了一个强大的系统, 用于调查在脊椎动物实验动物的睡眠的神经基础, 更不知道睡眠是如何演变, 以及自然变化如何有助于睡眠调节。墨西哥紫鱼,马西卡努斯(a。在睡眠、运动活动和生理节律¹⁷, 18 方面发生了巨大的差异。这些鱼作为眼睛表面鱼类存在于墨西哥和南部的得克萨斯州和墨西哥东北部的 sierra del abra 地区周围至少29个洞穴^{种群 19,20,21}。值得注意的是, 许多行为差异, 包括睡眠不足, 似乎已经独立出现在多个空鱼群体 14^,22。因此, 紫鱼为研究睡眠、生理和社会行为的收敛演变提供了一个模型。

该协议描述了一种测量a中睡眠和运动行为的系统。仙人掌幼虫和成虫。一个定制的基于红外的记录系统允许在光明和黑暗的条件下对动物进行录像。商业上可用的软件可用于测量活动, 自定义宏用于量化不活动的几个方面, 并确定睡眠时间。该协议还描述了用于跟踪水箱内多个动物活动的实验修改, 提供了检查睡眠和社会行为之间相互作用的能力。这些系统可用于测量睡眠, 生理行为, 和运动活动的其他种类, 包括斑马鱼和粘滞。

注: 在幼虫和成虫中建立行为跟踪系统。

1. 构建幼虫睡眠系统

请注意:通过幼鱼在受精后4天通过 30 dpf a. mexicanus追踪幼虫的监测系统需要多种设备, 包括红外 (ir) 照明、丙烯酸红外光扩散器、自动照明控制 (定时器)、计算机、摄像机和二次材料, 如布线和电源控制器 (图 1a)。以下说明将说明如何建立一个系统, 以准确跟踪运动行为, 研究睡眠和生理节律在幼虫.

1. 构建由红外和白光发光二极管 (LED) 组成的照明系统: 将三个红外光指示灯放置在一个三角形中, 彼此约7.62 厘米, 位于30.5 厘米 x 30.5 厘米的薄金属平台散热器上。电线灯与电线串联, 并连接到电源。
2. 将一个白光 LED 放在三个红外灯的中心, 并将其连接到电源上。
3. 将 LED 的电源连接到设置为标准生理时间的光定时器。
4. 构建幼虫跟踪系统平台。使用0.33 厘米厚的白色标志丙烯酸的平台的所有组成部分。
5. 在行为跟踪过程中, 将记录平台放在灯火通明的方形散热器上, 其中包含鱼类的竞技场将位于该散热器上。
6. 在灯和动物之间的盒子内放置第二亚克力, 以分散红外, 获得最佳照明和对比度。
   注:幼虫灯箱的尺寸如下: 两个18厘米 x 8.5 厘米和两个17厘米 x 8.5 厘米的 led, 它们被化学粘合在一起, 形成一个18厘米 x 18 厘米的正方形, 高8.5 厘米。此外, 丙烯酸可以很容易地切割或钻使用适当的工具定制的大小。
   1. 将整个幼虫跟踪阶段和照明设置放置在一个封闭的塑料管中, 然后将相机放置在管的顶部。
      请注意:重要的是要防止光线反射出现在跟踪视频上, 因为这会影响跟踪精度。将摄像机放置在环绕平台的管顶部, 可提高用于这些实验的摄像机的照明和清晰度。
7. 操作基于 ir 的录制的网络摄像头 (参见材料表)。使用旋转工具卸下制造商镜头 (参见材料表)。
8. 卸下相机背面的小银螺钉, 卸下内盖。
9. 卸下相机主体内的黑色小螺丝, 松开镜头的其余部分。使用小螺丝刀卸下切割镜头后留下的镜头外壳的任何部分。
10. 卸下带电耦合器件 (CCD) 外壳顶部的蓝色 LED。
11. 将相机放回一起, 将内部外壳放回原来的方向, 并将两个银色螺丝拧回原来的位置。
12. 使用小锯子将相机内部的路线与圆形塑料布线位配合使用。平滑多余的塑料, 直到它可以容纳镜头适配器。
13. 在尽可能靠近 CCD 的相机内安装 ir 通滤波器, 而无需与相机直接接触。
    请注意:注意不要损坏相机外壳内的 CCD 芯片。一定要尽可能地保持切割水平。密封红外滤清器外部和相机主体之间的任何开放空间, 以防止光线到达 CCD 而不被过滤。
14. 通过将相机前部的适配器拧到镜头的背面, 将相机连接到35毫米固定镜头 (见材料表) 上。
15. 将相机和镜头放在钻入舞台和灯光的管子顶部的盖子上的孔中, 并将 USB 连接到动物将被记录的电脑上。
    请注意:将鱼放置在与鱼类存放处分开的行为室, 以确保行为记录过程中的中断最小。注意最大限度地减少温度和通风的波动, 这可以满足行为实验。

2. 成人睡眠系统

1. 构建红外照明系统, 通过将红外条切割到大约46厘米的间隔来跟踪成年鱼类。一个46厘米条是足够的每个 10 L 行为坦克。
2. 将每个带材串联在一起, 将每个带材焊接到直流电线上, 并连接到 9 V 电源。
3. 将每个红外条连接到51厘米 x 5.1 厘米的铝片上, 该片将起到散热器的作用。
4. 将46厘米 x 5 厘米、0.32 厘米厚的9% 光通白色标志丙烯酸片直接放在每个红外灯带的前面, 以漫射红外光。
5. 将所有储罐放在支持后置红外照明的机架上。
6. 使用不透明的塑料隔板在 10 L 玻璃罐创建单独的竞技场。
   请注意:竞技场的大小可以根据使用的分隔线数量和坦克的大小而变化。竞技场大小影响运动活动和睡眠在洞和表面鱼²³。
7. 将摄像机安装在距离储罐约4-6 米的地方。每个相机通常可以记录从3个坦克一次, 以提供足够的分辨率跟踪。
   请注意:成人行为录音通常不需要单独的白光系统来控制白天的变化。在连接到计时器的行为室中, 简单地使用标准的架空灯可能就足够了。

3. 录制点活动

请注意:所有行为录音都是使用标准的笔记本电脑或带有备用电池源的台式机进行的。由于24小时录制 (60-100 GB) 的文件大小较大, 因此将所有录制保存在外部硬盘驱动器上。

1. 在启动录音前, 4-30 dpf 的鱼年龄为18-24。第一次放入记录室时, 用活盐水虾喂幼鱼, 并在开始录制前1小时喂幼鱼。在记录行为前 4-5, 对成年鱼进行补充, 每天用片状食物或活黑虫喂养一次。
   请注意:在记录之前, 一定要将幼鱼放入淡水中, 因为剩余的盐水虾在以后的分析中会导致跟踪问题。与轮虫共培养提供了另一种选择, 因为它们体积小不会干扰跟踪。
2. 将 4-6 dpf 年龄的鱼放入24孔组织培养板中。家鱼年龄 20-30 dpf 在12孔组织培养板记录。
3. 记录成人在 10 L 坦克适合分隔线, 以容纳5个单独居住的鱼, 或没有分隔线记录睡眠和活动在社交环境中。
   请注意:在启动录制之前, 请注意对焦相机, 以便最大限度地提高跟踪精度。不要把相机镜头的虹膜打开得太远, 因为这会大大降低图像的清晰度。然而, 有一种平衡;如果虹膜关闭太远, 视频的帧速率将下降到 15.00 fps 以下。对于以后的分析, 帧速率保持在每个秒的15.00 帧中, 以便与某些自定义编写的睡眠脚本^23,24一起使用, 这一点非常重要。
4. 设置亮度/亮度背景照明。
5. 在开始录制之前优化照明。始终保持在尽可能高的水平的对比度, 并使用亮度和背景照明来调整亮度, 直到动物是最清晰的。
6. 记录鱼24或48小时。
   请注意:在停电的情况下, 应购买为所有照明、计算机和相机供电的紧急备用电池组。如果可能, 所有电池组也应插入紧急电源插座。电池组一般最多不给设备供电几分钟到一个小时以上, 在失去主电源和转移到应急电力系统之间牵线搭桥。

4. 利用自动跟踪软件分析独立任务鱼的生物活性

1. 若要开始分析行为, 请打开跟踪软件,从 "模板" 中选择 "新建实验", 然后选择"应用预定义模板"。
2. 由于该计划现在将询问要跟踪的物种, 请选择"鱼"。使用下拉框选择斑马鱼幼虫的斑马鱼成年根据实验范例 。
3. 设置每个动物都将被跟踪的竞技场。对于幼虫, 选择 "井板"、"圆井" 和"无区域模板"。对于成人, 请使用"开放字段"、" 无区域模板"的正方形。然后确定合适的竞技场数量, 视频中跟踪的每只动物一个竞技场。
4. 选择最佳跟踪模型, 单击 "跟踪中心点",并确保选择的动物颜色比背景颜色深。应用获取视频的帧速率。跟踪软件应自动检测到这一点。
5. 绘制一个刻度来校准物体的真实世界距离, 以便使用"竞技场设置"准确地确定鱼类的运动行为。
6. 编辑竞技场, 以确保跟踪鱼所在的整个区域;否则样品将在采集过程中丢失。
   请注意:设置区域时要小心。如果竞技场太大或太小, 幼鱼尤其对跟踪错误很敏感。实验中光线错误也会在井板的墙壁上产生阴影, 程序可能认为这是一种动物, 从而产生假阳性。
7. 点击高级。在"检测设置中的方法" 下, 选择 "动态减法", 然后单击 "背景", 然后选择 "开始学习"。调整暗度对比度/噪声比, 直到对动物进行良好的跟踪, 而背景不会导致跟踪跳转。
   请注意:视频质量可能因实验而异, 因此每个试验可能需要使用相应的不同设置。使用"主题轮廓"和"主题大小" 功能可以显著提高跟踪结果。
8. 选择 "试用" 列表并加载适当的参数, 然后再开始将数据记录到程序中。
9. 单击 "获取"选项卡, 选择"跟踪所有计划的试用" , 然后单击 "记录" 按钮。
10. 在"分析配置文件"下, 确保选择了"距离" 和 "时间 &" 移动"。
    请注意:为了进行以后的睡眠分析, 这些设置必须正确, 因为. perl 文件必须以正确的顺序读取这些数据才能计算睡眠。
11. 在 "导出" 下, 选择 "原始数据", 将数据导出为 unicode 文本。

5. 追踪社会生活中的鱼

1. 按照步骤 4.1-4.4 在跟踪软件中设置实验。
2. 在下拉菜单中, 选择要跟踪实验的动物数量。
3. 在"竞技场" 设置中, 绘制正确的刻度以校准真实世界的距离。
4. 在"检测设置" 中, 使用动态减法, 并调整暗色对比度以最好地跟踪动物。
5. 在检测设置下调整拍摄对象的大小, 以便只跟踪动物的很小一部分。
   请注意:通过只跟踪动物的一小部分, 这将减少动物在采集过程中交叉路径时的切换量。
6. 一旦获得轨道, 使用轨道编辑器手动修复鱼可能交叉路径的时间。

6. 从睡眠活动中提取睡眠数据

请注意:幼虫和成虫睡眠的行为定义均为 1分钟或更多。这个定义是用唤醒阈值实验来确定的, 与醒着^的14^,17 相比, 需要更大的感官刺激才能在睡眠状态下启动行为反应。为了考虑到鱼类常见的小运动和漂移, 采用了速度阈值来隔离真实的运动与噪音或漂移。通过比较距离和睡眠持续时间之间的相关性来求取最高的 r 平方值, 从而计算出这些阈值;从而确定最精确的运动和睡眠速度。对于幼鱼, 上限和下限都是 12 mm--因为几乎没有漂移。成年鱼的下限为2克, 上限为 4 cm/s, 以解释漂移。

1. 在分析计算机上安装 Cygwin 来执行定制编写的脚本, 以提取运动和睡眠行为。
2. 在 Cygwin 主目录中创建一个新的实验文件夹。
3. 从跟踪软件导入原始 Unicode 数据, 并在 Cygwin 中执行. sh 文件, 将编码从 UTF-16 转换为 UTF-8。
4. 执行 Cygwin 中的. perl 文件以提取睡眠数据。
5. 打开宏文件, 并按照电子表格中的说明完成所需的数据分析。
   请注意:要执行这部分分析, 需要基本级别的命令行编码。一般的 Linux 命令就足够了。如果正确读取数据的程序出现问题, 请在任何免费提供的文本编辑器中检查跟踪软件中的数据, 以确保编码和顺序正确, 可执行文件能够正确写入。

4-30 dpf 年龄的幼虫可以可靠地记录在图 1所述的自定义构建的闭合系统中。该系统包括红外和可见光照明, 以便在光线和黑暗条件下、在各种可见光条件下进行录制 (图 1a)。然后使用跟踪软件 (图 1b, c) 对视频进行分析, 并使用自定义睡眠宏进行后处理 (请参阅补充下载)。与表面鱼类 (图 1d) 和 20 dpf 相比, 三个独立的洞穴鱼类种群的睡眠显著减少, 这种睡眠损失在发育阶段是一致的。对睡眠进行分析的鱼的年龄往往取决于实验操作。例如, mexicanus在4天的时间里不食用食物, 因此, 检查睡眠和喂养之间相互作用的实验通常发生在年龄较大的幼虫25 中。相反, 吗啡只在早期鱼苗中有效 (通常低于 4 dpf), 因此这个年龄被用来评估睡眠^{24、26、27.}

在实验室里可以活到 30年, 但使用成人的实验通常是在6个月至3岁的鱼类中进行的。根据实验的不同, 鱼可以记录各种储罐大小, 红外照明允许在光明和黑暗时期进行记录 (图 2 a)。在跟踪中对各个竞技场进行标记, 以允许跟踪鱼类, 使用自定义宏进行后处理可提供睡眠读数 (图 2b, c)。与水面鱼类相比, 帕孔、莫利诺和蒂纳贾气的睡眠显著减少 (图 2d)。此外, 该系统允许在一个竞技场记录多条鱼 (通常为10加仑的鱼缸), 从而分析社会交往如何影响睡眠 (图 2e, f)。社会住房有力地减少了水面鱼类的睡眠, 而不会影响帕雄的睡眠 (图 2g)。在空鱼中缺乏效果很可能是由于基底效应, 其中空鱼睡眠很少, 特别是在用于检查社会行为的较大的竞技场。

图 1: 记录幼体和幼体的睡眠行为. (a) 幼虫睡眠行为设置示意图: 幼虫被放置在光控管内的平台上。红外线和白色照明系统位于管底的鱼下方。一个 ir 通道相机位于管的顶部, 并连接到笔记本电脑上的视频记录。所有供电系统 (照明和笔记本电脑) 都已插入备用电源。(b) 跟踪软件中的竞技场设置。单个幼虫保存在组织培养板的井中, 并为每种动物制作竞技场 (青鱼)。(c) 在跟踪软件中获取数据后, 鱼类运动行为的生物痕迹。红色痕迹代表了20天老鱼的10种活动。(d) 从跟踪软件生成睡眠数据。与表面鱼类形态 (单向方差分析 F(3, 116) = 76, 12;采用邓内特事后分析法, 将每只紫鱼种群与表面鱼类 p < 0.001) 进行了比较。请点击这里查看此图的较大版本.

图 2:成人 a. mexicanus系统的睡眠和生理行为。(a) 睡眠记录系统示意图: 鱼被放在跟踪摄像机对面的架子上的储罐中。一个红外照明系统被放置在鱼缸后面, 而 ir 通行证摄像机则连接到笔记本电脑上进行记录行为。在电源波动的情况下, 所有供电系统都插入了备用电池系统。(b) 跟踪软件中的竞技场设置。单独的鱼的标志是创建单独的竞技场 (青色) 来跟踪运动行为。(c) 在获取跟踪软件上的行为记录后, 代表单个鱼类的运动轨迹 (红线)。跟踪表示活动的20秒。(d) 与水面鱼类相比, 三个不同的空鱼种群的总睡眠时间大大减少, 超过 24小时 (单向方差分析 F(3, 106) = 52.66;在水面鱼类和每个洞穴种群之间进行了 Dunnett 事后试验, P < 0.001)。(e) 一个装有多条鱼的单一鱼缸, 其中一个竞技场 (橙色) 被制作, 以跟踪社会交往和睡眠。(f) 跟踪软件中数据采集后多条鱼的生物痕迹 (每行颜色代表单个鱼)。(g) 在社会睡眠跟踪方面的表面和帕雄的代表性数据。与2升竞技场相比, 表层鱼在10升储罐中显著减少睡眠;当鱼类被安置在社会环境中时, 水面鱼类的睡眠会进一步减少。在任何情况下, 洞穴睡眠都没有明显变化 (双向方差分析 F(2,46) = 4.545; 在每个人群中进行了事后分析, 以测试坦克大小和社会状态对总睡眠的影响 10 L 单, P = 0.013; 10 L social, P = 0.0003)。请点击这里查看此图的较大版本.

该协议描述了一个定制系统, 用于量化幼虫和成虫的睡眠和运动活动。紫鱼已成为研究睡眠演变的主要模型, 可用于研究睡眠调节¹的遗传和神经基础。该协议中的关键步骤包括优化照明和视频质量, 以确保准确的跟踪, 这是量化睡眠所必需的。这里描述的采集和分析系统功能齐全, 许多其他商业和定制系统也是如此, 可以量化运动和行为^{28、29、30.}以前的检测单条鱼睡眠的方法可以扩展, 以便对小组所在的鱼进行分析。当排除故障或设计检测是社会行为可能对个人睡眠造成的混乱时, 一个重要的考虑因素。例如, 攻击性在 Astyanax中很常见, 而表面鱼类和警告³¹之间的攻击性水平不同。优化鱼的数量、竞技场的大小和性别比例, 以最大限度地减少攻击性, 将允许对睡眠调节进行可重复的测量。

如图所述, 该技术的一个局限性是在整个检测过程中, 单个鱼之后缺乏可靠性。当动物接触密切时, 自动跟踪往往会切换动物。这可以通过仔细优化阈值或手动校正任何开关来解决。此外, 所描述的系统不是一个流动系统, 因此, 在录制持续几天以上之后, 水质可能成为一个问题。斑马鱼¹³中描述了其他通过系统的流动, 这些流动可以很容易地应用于墨西哥的空鱼。

所描述的方法是重要的, 因为它的广泛适用于测量不同鱼类物种的行为。睡眠尚未在几乎任何海洋或淡水鱼, 包括刺背, 西奇利兹, 和剑尾 32^,33^,34的特点。该系统的多功能性测量睡眠在a. mexicanus和其他鱼类模型可能解决有关睡眠的进化和遗传基础的各种问题。与该系统相关的硬件具有很高的成本效益, 使其易于获取, 并为睡眠和运动活动的药理和生态毒理学分析提供了高吞吐量分析的潜力。

提交人声明他们没有相互竞争的利益。

这项工作得到了 NIGMS 奖 GM127872 ack 奖、NINSD 奖105072对 ERD 和 ACK 的支持, NSF 奖对 ack 的支持。