O c. elegans intestino como um modelo para intercelular Lumen morfogênese e In Vivo biogênese de membrana polarizada no nível de célula única: rotulagem por anticorpos, RNAi perda--função de análise e de imagem

O transparente c. elegans intestino pode servir como uma"em vivo câmara de tecido" para estudar a biogênese de membrana e lúmen apicobasal nível unicelular e subcellular durante tubulogenesis multicelulares. Este protocolo descreve como combinar padrão de rotulagem, genética/perda--função de RNAi e abordagens microscópicas para dissecar esses processos em um nível molecular.

Tubos multicelulares, unidades fundamentais de todos os órgãos, são compostos de células endoteliais ou epiteliais polarizadas, com membranas apicais forro as membranas lúmen e basolateral, entrar em contato com os outros e/ou a matriz extracelular. Como esta assimetria da membrana distinta é estabelecida e mantida durante a morfogênese do órgão é ainda uma questão não resolvida de biologia celular. Este protocolo descreve o intestino c. elegans como modelo de análise de biogênese de membrana polarizada durante a morfogênese de tubo, com ênfase na biogênese apical da membrana e lúmen. Epitélio intestinal de camada única de células vinte e o c. elegans é organizado em um simples tubo bilateralmente simétrico, permitindo a análise em um nível de célula única. Polarização de membrana ocorre concomitantemente com polarizada divisão celular e migração durante a embriogênese precoce, mas de novo polarizada biogênese de membrana continua durante todo o crescimento larval, quando as células já não se proliferam e se mover. A última configuração permite separar alterações subcelulares que medeiam simultaneamente estes processos de polarização diferentes, difícil distinguir na maioria dos modelos de polaridade. Apical-, basolateral da membrana-, juncional-, do citoesqueleto- e endomembranoso componentes podem ser rotulados e rastreadas durante todo o desenvolvimento por proteínas da fusão de GFP ou avaliadas por em situ mancha do anticorpo. Juntamente com versatilidade genética do organismo, o intestino de c. elegans , portanto, fornece um modelo exclusivo na vivo para o visual, no desenvolvimento e a análise genética molecular da membrana polarizada e biogênese de tubo. Incluem os métodos específicos (padrão) descritos aqui como: rotular componentes subcelulares intestinais pela mancha do anticorpo; analisar genes envolvidos na biogênese de membrana polarizada por estudos de perda-de-função adaptados para os genes tubulogenesis normalmente essencial; avaliar a polaridade defeitos durante diferentes estágios do desenvolvimento; interpretar os fenótipos de epifluorescência, contraste de interferência diferencial (DIC) e microscopia confocal; quantificar os defeitos visuais. Este protocolo pode ser adaptado para analisar qualquer das moléculas envolvidas muitas vezes altamente conservadas em polaridade epitelial, biogênese de membrana, tubo e lúmen morfogênese.

A geração de celulares e subcellular assimetrias, tais como a formação dos domínios de membrana polarizada, é crucial para a função de células, tecidos e órgãos¹e morfogênese. Estudos sobre biogênese de membrana polarizada em epitélios permanecem um desafio técnico, uma vez que mudanças direcionais na alocação de componentes subcelulares dependem de múltiplos consecutivos e coincidentes extracelulares e intracelulares sinais que são é difícil separar na maioria de modelos e fortemente dependem do sistema de modelo. O modelo apresentado aqui - a camada única Caenorhabditis elegans intestino - é um tecido de requintada simplicidade. Junto com o single-cell c. elegans excretor canal (veja papel de acompanhamento na biogênese de membrana polarizada no canal excretor c. elegans )², fornece várias vantagens exclusivas para a identificação e caracterização de moléculas necessárias para a biogênese de membrana polarizada. A conservação das indicações de polaridade molecular de leveduras ao homem fazer este órgão invertebrado simples um excelente"em vivo câmara de tecido" para responder a perguntas sobre polaridade epitelial que são de relevância directa para o sistema humano, que é ainda demasiado complexo para permitir a dissecação visual desses eventos no single cell nível em vivo.

Apesar de várias pistas de polaridade conservada da matrix (1) extracelluar, (2) a membrana plasmática e suas junções e tráfico vesicular (3) intracelular foram identificados³, os princípios subjacentes da sua integração no processo de polarizada biogênese de membrana e tecido epitelial é mal compreendido⁴. Os modelos clássica célula única na vivo (e.g.S. cerevisiae e o zigoto de c. elegans ) têm sido fundamentais para definir os princípios da divisão de células polarizada e polaridade ântero-posterior e identificaram críticos polaridade de membrana associada determinantes (pequenas GTPases/CDC-42, PARs os particionamento com defeito)^5,6, mas eles dependem da simetria única pistas (cicatriz de broto, entrada de esperma) e à faltam de junção-protegido domínios de membrana apicobasal e, presumivelmente, o correspondente apicobasal intracelular, máquinas de classificação. Nosso conhecimento atual sobre a organização do tráfico polarizada de epitélios, no entanto, principalmente se baseia em mamíferos monoculturas 2D⁷, que falta fisiológicas pistas extracelulares e do desenvolvimento que podem mudar as posições da membrana domínios e direções de trajetórias de tráfico (um interruptor de 2D para 3D em vitro cultura sistemas sozinhos é suficiente para inverter a polaridade da membrana nas células MDCK (rim canino de Madin-Darby))⁸. Na vivo do desenvolvimento estudos sobre polaridade epitelial em organismos invertebrados modelo realizaram-se inicialmente em epitélios simples, por exemplo na epiderme Drosophila melanogaster , onde identificaram a contribuição crítica da dinâmica de junção para a migração de células polarizadas e célula folha movimento⁹e de tráfico endocítica para polaridade manutenção¹⁰. O 3D in vitro e em vivo análise da morfogênese lúmen em epitélios tubulares em células MDCK e no intestino c. elegans , respectivamente, recentemente identificaram a exigência de tráfico intracelular para de novo domínio (apical) e a biogênese de lúmen e posicionamento^11,12,13. A espessura de tubular (em vez de plana) células epiteliais é uma vantagem para a análise 3D de assimetrias subcellular desde que permite uma distinção visual superior da membrana apical-lumenal, entroncamentos ápico-lateral, a membrana lateral e o posições das organelas intracelulares. A estas vantagens visuais, o modelo de c. elegans adiciona a configuração vivo em eixo do desenvolvimento, transparência, simplicidade do plano do corpo, linhagem de células definidas e invariável, analítica (genética) e vantagens adicionais descritas abaixo.

C. elegans em si é uma lombriga de estrutura tubular, cuja transparência e arquitetura simples disponibilizar seus órgãos internos da mesma forma tubulares diretamente para a análise visual da morfogênese tubo e lúmen. As vinte células de seu intestino (21 ou 22 células na ocasião)¹⁴ são derivadas de uma célula progenitora único (E) e desenvolver a partir de um dupla camada de epitélio a um passo de intercalação para um tubo bilateralmente simétrico dos nove anéis INT (em quatro células a primeiro anel; Figura 1 esquema)^14,15,16. Análise de linhagem e tecido do intestino, determinada inicialmente por óptica Nomarski através de de identidades nuclear¹⁷e posteriormente por microscopia de fluorescência através de membranas rotuladas, forneceu insights críticos sobre sua morfogênese, em particular os requisitos autónoma-célula e célula-não-autónomos para seu direcionais divisões celulares e movimentos (por exemplo, intercalação, as assimetrias de direita-esquerda, rotação anterior e posterior do tubo)^14,18 . Especificação de endodermal celular precoce e a rede reguladora de gene controlando o desenvolvimento do órgão modelo clonal são bem caracterizadas^19,20. O foco aqui, no entanto, é na análise da membrana polarizada e biogênese de lúmen único células tubulares e das assimetrias intracelulares de endomembranes, estruturas do citoesqueleto e organelas que acompanham este processo. A análise é facilitada pela simplicidade deste tubo, onde todas as membranas apicais (no nível ultraestrutural distinto por microvilli) enfrentam o lúmen, e a todas as membranas basais face a superfície exterior do tubo, com membranas laterais contactar uns aos outros, separados da membrana apical por junções (Figura 1 esquema; Veja referências (^16,21) para o c. elegans-organização específica de apertado e componentes de junção aderente). Biogênese da membrana apical, portanto, é coincidente com a morfogênese do lúmen. Além disso, o tamanho das células intestinais adultos - as maiores células deste pequeno animal (com exceção da célula excretor) - aproximado do tamanho de uma pilha mamífera, permitindo na vivo rastreamento visual dos elementos subcelulares, por exemplo trajetórias de vesículas, que geralmente é tentaram em vitro em um prato de cultura.

Para efeitos desta análise celular e subcellular, rotulagem adequada é fundamental. Domínios de membrana plasmática ou endo intestinal, junções, do citoesqueletoestruturas, núcleos e outras organelas subcelulares podem ser visualizadas através da marcação de seus componentes moleculares específicos. Muitos desses componentes foram caracterizados e continuar a ser descoberto (atabela 1 dá alguns exemplos e refere-se aos recursos). Por exemplo, várias moléculas, distinguindo os compartimentos tubulares e/ou vesiculares do sistema endomembranoso intestinal, da emergência para o Golgi através de vesículas de Golgi-post para a membrana plasmática, foram identificadas²². O específicas proteínas (como lipídios e açúcares) podem também ser rotulados directamente, ou indirectamente através de proteínas de ligação. Este protocolo enfoca em situ mancha do anticorpo de espécimes fixos, uma das duas técnicas padrão de rotulagem (consulte o documento que acompanha no canal excretor tubulogenesis para obter uma descrição dos outros técnica² - em vivo rotulagem através de fusões de proteína fluorescente - que é directamente aplicável para o intestino; Tabela 2 fornece exemplos de promotores específicos do intestino que podem ser usados para dirigir a expressão de tais proteínas de fusão para o intestino). Duplo - ou múltiplos de rotulagem com qualquer abordagem, ou com uma combinação de ambos mais adicionais químicas de coloração, permite maior resolução visual em profundidade e o exame das mudanças espaciais e temporais na localização co e recrutamento de específicos moléculas ou de componentes subcelulares (Figura 2). A fixação e procedimentos descritos nessa preservação do suporte de protocolo de proteína verde fluorescente (GFP) rotulagem durante procedimentos de imunocoloração de coloração. Para a imagem latente, principais pontos de detecção e caracterização de tubulogenesis fenótipos através de procedimentos padrão microscópicos (microscopia de fluorescência confocal e dissecação) são descritos (Figura 3, 4). Estes podem ser estendidos para a maior resolução de imagem de abordagens, para instância superresolution microscopia e transmissão microscopia eletrônica (não descrito aqui).

Uma força chave deste sistema é a capacidade de analisar a polaridade nas células individuais em diferentes estádios de desenvolvimento, de embriogênese através da vida adulta. Por exemplo, biogênese de domínio e o lúmen da membrana apical pode ser rastreado ao longo do desenvolvimento a nível de célula única através de rotulagem com MTC-1, um vinculador de membrana altamente conservadas-actina da Yasmim-Radixin-Moesin família^23,24 . MTC-1 visualiza a biogênese de membrana apical (1) durante a morfogênese tubo embrionário, quando ocorre concomitantemente com a divisão celular polarizada e migração (movimento de células apicalmente ao redor do lúmen durante a intercalação)¹⁵; (2) durante a tarde extensão de tubo embrionário e larvar que procede na ausência de divisão celular ou migração; e (3) no intestino adulto, onde a membrana polarizada domínios são mantidos (Figura 1). No epitélio pós mitótico larval em expansão, de novo polarizada membrana biogênese, portanto, pode ser separado da morfogênese tecido polarizada, que não é possível na maioria dos modelos de polaridade epitelial in vivo e in vitro , incluindo aqueles com resolução de célula única (por exemplo, o 3D MDCK cisto modelo⁸). Com rotulagem para outros componentes, essa configuração fornece a oportunidade (particularmente na L1 larval fase quando as células têm uma maior relação citoplasma/núcleo) distinguir essas alterações intracelulares que são específicas para polarizada (biogênese de membrana por exemplo, a reorientação das trajetórias de tráfico) daqueles concomitantemente necessários para migração e divisão de células polarizada.

A versatilidade genética de c. elegans é conhecido²⁵e torna um sistema poderoso modelo para a análise molecular de qualquer questão biológica. Um estudo sobre a morfogênese, por exemplo, pode começar com uma estirpe de tipo selvagem, uma cepa transgênica onde a estrutura de interesse (por exemplo, uma membrana) é rotulada com um marcador fluorescente, ou com um mutante de perda ou ganho-de-função com um defeito no presente estrutura. Um estudo de genético reverso típico pode gerar um mutante onde o gene de interesse é excluído no germline (por exemplo, por uma deleção específica), modificado por mutagênese (tipicamente produzir mutações pontuais, com consequente perda, redução ou ganho de função do gene), ou onde a sua transcrição é reduzida por RNAi. A facilidade de RNAi, alimentando em c. elegans²⁶ também presta-se ao design de telas específicas que examinar um grupo maior de genes de interesse. Indiscutivelmente a maior força do organismo modelo genético é a capacidade de realizar na vivo frente telas (por exemplo, mutagênese, telas de RNAi sistemáticas ou todo o genoma) que permitem uma investigação imparcial sobre a causa molecular para um fenótipo de interesse. Por exemplo, um visual imparcial c. elegans RNAi tubulogenesis tela, começando com um animal geneticamente modificado com membranas apicais ERM-1-rotulados, descobriu um intrigante conversão reversível de polaridade intestinal e fenótipo lúmen ectópica, usado aqui como um exemplo para este tipo de análise. Esta tela identificou o esgotamento de glycosphingolipids (GSLs; lipídios de membrana obrigatórios, identificados através de suas enzimas biossintéticas-GLS) e componentes de Clatrina de casaco a vesícula e sua AP-1 adaptador como os defeitos moleculares específicos causando essa polaridade fenótipo de conversão, desse modo, caracterizar estes tráfico de moléculas como in vivo sugestões para a polaridade da membrana apical e lúmen posicionamento^12,13. Ao iniciar com um fenótipo específico mutação genética/morfogênese, tais telas (ou experimentos simples interação genética/RNAi) também podem examinar interações funcionais entre dois ou vários genes de interesse (veja papel de acompanhamento sobre o excretor canal para obter um exemplo de tal análise)². Este protocolo centra-se na RNAi que, além de sua capacidade de identificar diretamente o gene cuja perda faz com que o fenótipo em telas para a frente, oferece vantagens específicas para a análise da morfogênese. Desde produtos de genes direcionando morfogênese muitas vezes trabalham de uma forma dose-dependente, RNAi é geralmente bem sucedido em gerar um espectro de fenótipos. A capacidade de gerar informativos parcial-perda-de-função fenótipos também ajuda a resolver o problema que a maioria dos genes tubulogenesis importantes é essencial e que suas perdas causam esterilidade e mortalidade embrionária precoce. Este protocolo inclui estratégias de RNAi condicionais para superar esta dificuldade e sugere maneiras de otimizar a geração de um amplo espectro de fenótipos, tais como uma série alélica produzido por mutagénese.

1. Rotulagem do intestino c. elegans

Nota: consulte o documento que acompanha pelos autores na análise do canal excretor tubulogenesis ² para a construção de marcador fluorescente específica do tecido plasmídeos e a geração de animais transgênicos, incluindo discussões sobre proteínas da fusão transcriptional e translacional (este último necessário para a Localização subcellular de uma molécula de interesse). Estes procedimentos podem ser adaptados por meio de promotores específicos para conduzir a molécula de interesse para o intestino. Consulte a tabela 1 para obter exemplos de moléculas provados útil para a visualização de c. elegans intestinal endo - e membranas de plasma e seus cruzamentos, tabela 2 para obter exemplos de promotores para a condução de expressão para o intestino, e tabela 3 para recursos mais abrangentes coleções de marcadores intestinais e promotores.

1. Mancha do anticorpo do intestino c. elegans ^{27 , 28}
   1. fixação
      1. levar uma lâmina de vidro limpa e use poli-L-lisina para gere uma película fina para vermes colar em. Lugar 30 µ. L 0.1-0.2% poli-L-lisina sobre o slide e coloque um segundo slide sobre a queda de poli-L-lisina para fazer um " sanduíche ". Em seguida, esfregue os slides gentilmente algumas vezes para molhar as superfícies inteiras de ambos e deixe-os secar por 30 min. etiqueta do lado fosco dos slides com lápis.
         Nota: alíquotas de 0,2% poli-L-lysine de 200 µ l foram feitas por dissolução do pó na dH ₂ O; Isto pode ser armazenado em-20 ° C. uso alto peso molecular poli-L-lisina para melhor degola dos vermes. A concentração de poli-L-lisina é também crítica. Concentrações muito baixas não permitirá worms para ficar mas também altas concentrações podem gerar sinal de fundo de fluorescência. Um filme muito espesso pode descontrair na sua totalidade.
      2. Coloque um bloco liso do metal firmemente no fundo de um recipiente (por exemplo, um recipiente de poliestireno) preenchido com nitrogênio líquido.
         Nota: Pode-se usar gelo seco em vez disso, mas o nitrogênio líquido mantém mais estável um bloco de metal na parte inferior do recipiente e gela bem.
      3. Coletar vermes também por lavá-los fora de suas placas com M9 ²⁹ ou escolher palco diferentes vermes (ou ovos, L1, L2, L3 ou L4 fase larval vermes para cada slide). Normalmente, escolhe ~ 100 larvas e embriões ou ~ 20 adultos para cada slide. Lugar de 10 µ l lavado vermes no meio do slide ou escolher ovos/worms em 10 µ l M9 ou 10 µ l de 1x PBS ²⁷ (solução salina tamponada fosfato).
         1. Uso de uma pipeta, espalha-se um grande número de vermes para evitar aglutinação.
            Nota: Misto de populações de lavado vermes, devido à aglomeração e diferente espessura dos estágios, não ficar bem e são menos eficazmente congelar-rachado (veja abaixo), portanto, vermes de estágio específico de colheita (ou populações sincronizadas) dão resultados superiores. As larvas aderir melhor do que os adultos e mais animais podem ser colocados por slide.
         2. Antes de apanhar minhocas para slides, transferi-los para um prato de nematódeo crescimento médio (NGM) ²⁹ sem OP50 bactérias. Aderente de bactérias em excesso para os vermes também pode interferir com a degola. Cuide-se que minhocas não secar.
      4. Gentilmente lugar (gota) uma lamela de 22 mm × 22mm Cruz-maneiras por cima o coletados vermes tal que suas bordas pendurado em pelo menos um lado do slide. Pressione para baixo suavemente mas com firmeza com um ou dois dedos na lamela. Evitar o corte que irá danificar a integridade do tecido.
      5. Imediatamente e com cuidado transferir o slide para o bloco de metal em nitrogênio líquido e deixe descansar por cerca de 5 min congelar. Então " filme fora " lamela em um swift mover usando a borda saliente.
         Nota: Este passo deve ser feito com determinação e enquanto o slide é congelado para alcançar " craqueamento " da cutícula. Cuidado: Siga as orientações de EPI (equipamento de proteção individual) ao trabalhar com nitrogênio líquido.
      6. Imergir as lâminas de gelo-rachado em um metanol-enchido a jarra de vidro Coplin durante 5 min à-20 ° C. Em seguida, transferir para uma acetona-enchido a jarra de vidro Coplin para outro 5 min à -20 ° C.
         Nota: Metanol e acetona devem ser armazenados em-20 ° C durante pelo menos 30 min antes de usar. Após a fixação, slides podem ser armazenados em -20 ° C. PRECAUÇÃO: metanol e acetona são tóxicos.
      7. Remover slides do frasco e deixe-os secar à temperatura ambiente (RT) antes do uso.
   2. Coloração
      1. cercar a área de vermes fixos com uma camada fina de vaselina no slide. Desenhar um círculo em torno desta área na parte inferior do slide para marcar o local.
         Nota: É fundamental que o círculo de geleia permanece intacto durante todo o processo de coloração para evitar o vazamento das soluções coloração.
      2. Preparar um " molhada câmara " em uma caixa plástica com tampa, colocando toalhas de papel molhadas nele. Coloque o slide em um rack no presente " câmara molhada " para evitar a secagem dos slides durante coloração.
         Nota: Slides não devem estar em contato com água ou com os outros.
      3. , Suavemente, pipetar aproximadamente 50 µ l PBS 1x para o círculo de geleia, suficiente para cobrir a área. Fechar o " câmara molhada " com a tampa. Incubar a RT por 5 min.
         Nota: Para evitar a perda de vermes neste passo, não pipete PBS diretamente sobre as minhocas. Delicadamente, coloque a ponta da pipeta na borda do círculo e permitem que o fluido dispersar suavemente sobre os vermes.
      4. Lâmina de inclinação e Aspire lentamente a PBS com uma pipeta. Coloque o slide volta plana sobre o rack e adicionar 50 µ l (ou a quantidade necessária para cobrir a mancha) obstrui a solução cuidadosamente. Incube-isto na câmara úmida em RT por 15 min. Enquanto espera, diluir os anticorpos primários em solução de bloqueio (ver Tabela de materiais para obter exemplos de anticorpos primários e concentrações).
         Nota: Recentemente, prepare solução bloqueio usando 1X PBS (10 mL), 10% tween (50 µ l) e (0,2 g) de leite em pó. A quantidade de detergente e concentração de leite pode variar dependendo de anticorpos usados e talvez precise ser determinado empiricamente. Aspiração de líquido do slide é mais um passo para facilmente perder minhocas. Verificar o progresso, examinando o slide no âmbito de dissecação, mas tome cuidado que o slide não secar.
      5. Incline o slide e embora aspirar a solução bloqueio, usando as mesmas precauções conforme descrito acima. Coloque o slide volta plana para cremalheira e adicionar lentamente 50 µ l diluídos anticorpo primário, usando as mesmas precauções. Fechar o " câmara molhada " e incubar a 4 ° C durante a noite ou para períodos mais curtos em RT.
         Nota: O tempo de incubação pode precisar ser determinado empiricamente por um anticorpo específico.
      6. Aspirado fora a solução de anticorpo primário como feito para as outras soluções. Em seguida, lave as lâminas com solução de bloqueio por 10 min, 3 vezes, adicionando e removendo a solução da mesma forma como descrito acima.
      7. Add anticorpo secundário (fluorescente-etiquetadas) diluído em solução de bloqueio, incubar a RT por 1h. Consulte Tabela de materiais para obter exemplos de anticorpos secundários e concentrações.
      8. Remover o anticorpo secundário e lavagem, como acima, com o bloqueio a solução 2 vezes e, para cancelar fora a solução de bloqueio, com PBS 1x, durante 10 minutos cada.
      9. Aspire afastado tanto PBS quanto possível sem permitir o espécime para secar e retire com cuidado a gelatina em torno do espécime.
      10. Adicionar uma gota de meio de montagem para a amostra, e Coloque uma lamela suavemente por cima. Sele as bordas da lamela com unhas polonês. Coloque os slides em uma caixa de slides escuro para preservar a coloração e armazenar em 4 ° C.
          Nota: Manter slides no escuro por causa da sensibilidade à luz (fluorescência pode desaparecer com o tempo) e evitar a exposição do ar, mantendo-os fechados, pela mesma razão. Slides podem ser armazenados por longos períodos de tempo em 4 ° C ou a -20 ° C.

2. Interferência com a função de genes essenciais tubulogenesis no intestino c. elegans. Exemplo: RNAi.

Nota: cepas de c. elegans são cultivadas em bactérias OP50 semeadas em placas NGM, de acordo com protocolos padrão ²⁹. Para RNAi, c. elegans alimentam HT115 RNAi bactérias em placas de RNAi suplementado com 25 carbenicilina µ g/mL e 2 mM IPTG (isopropil beta-D-1-thiogalactopyranoside) para indução do promotor bacteriano que gera o encalhado dobro RNA (dsRNA) do introduzido o gene c. elegans. Antibióticos e concentração de IPTG podem variar consoante o clone/biblioteca de RNAi e força de RNAi desejada, resp. RNAi específico clones podem ser obtidas comercialmente disponível todo o genoma de RNAi alimentação bibliotecas (veja ( ^{26 , 30 , 31}) para o fundo, alimentando o RNAi em c. elegans e Tabela de materiais para materiais/reagentes e bibliotecas de RNAi).

1. Padrão RNAi alimentando ^{26 , 31}
   1. tirar placa de RNAi biblioteca de-80 ° C e colocá-lo em gelo seco. Remova a fita da selagem e usar a ponta da pipeta estéril para transferir bactérias aderentes do clone de interesse para placas de ágar LB (Luria caldo) ²⁹ suplementado com 100 µ g/mL ampicilina e tetraciclina de 15 µ g/mL. Raia para fora as bactérias na placa de ágar. A placa de biblioteca de RNAi com uma nova fita de vedação do selo. Crescem as bactérias durante a noite a 37 ° C.
      Nota: Estas placas de ágar-ágar podem ser armazenadas a 4 ° C, durante várias semanas. Nova bactéria pode ser cultivadas diretamente deles para proteger a biblioteca original de RNAi.
   2. Dia seguinte, inocular RNAi bactérias da placa de ágar LB em 1 mL de meio líquido LB ²⁹ contendo 50 ampicilina µ g/mL cada e agitar durante 14 h (8-18) ou durante a noite a 37 ° C.
      Nota: Para obter melhores resultados usar bactérias frescas cada vez. Ver referência ( ³⁰) para comparação das condições de cultura diferentes (por exemplo, tempo de cultura).
   3. Próximo dia, semente 200 µ l por clone das bactérias cultivadas em chapas separadas de RNAi RNAi. Deixe as placas secar e deixar no RT durante a noite para a indução do promotor bacteriano.
   4. Transferência de larvas de L4-fase 4-6 em cada prato de RNAi. Incubar as placas de RNAi semeadas no RT ou 22 ° C durante 3-5 dias.
      Nota: Escolha as larvas L4 primeiro em um prato NGM sem bactérias para remover aderente OP50 que irá interferir com RNAi, ou em série transferi-los para uma nova placa NGM sem OP50 três vezes. Certifique-se de cepas não estão contaminadas, que as bactérias contaminantes - como OP50 preferido comida para os vermes - também interferem com RNAi. Ajuste a temperatura conforme necessário: por exemplo, o desenvolvimento acelera com temperatura mais elevada; tensões podem ser sensíveis à temperatura.
   5. Para estudos do desenvolvimento, verificar fenótipos da progênie F1 partir dia 2.
      Nota: É fundamental para controlar animais com frequência para evitar perder o aparecimento ou a progressão de um fenótipo (por exemplo, deslocamento de marcador) quando avaliar membrana polarizada biogênese durante o desenvolvimento. Enriquecimento da população F2 para fenótipos fortes (por exemplo, escolhendo hermafroditas pai para uma nova placa de RNAi no dia 2 para selecionar para mais fortemente afectados meado parte de seus descendentes) raramente é necessário, desde um espectro de moderada a forte fenótipos é desejável.
2. Condicional RNAi
   Nota: RNAi condições podem ser modificadas para reduzir graves, ou aumentar os efeitos leves, ou interferir em palco-especificamente; modificações são úteis para a avaliação completa dos efeitos fenotípicos da muitas vezes genes tubulogenesis letal.
   1. Larval RNAi - avaliação de RNAi efeitos na mesma geração (suave, específicos do estágio RNAi)
      Nota: para superar a esterilidade ou letalidade embrionária, ou perturbar a função dos genes na embriogênese de post estágio específico, RNAi é induzida em larvas, pós embryonically. Qualquer lugar ovos não tratados (2.2.1.1), adultos gravid (2.2.1.2) ou sincronizado L1 (ou, se desejado, depois estágio) larvas (2.2.1.3) em placas de RNAi; Avalie os efeitos de RNAi na mesma geração, por exemplo, dois dias mais tarde e em diante, as larvas e/ou adultos.
      1. Pick 30-50 adultos grávidos em uma gota solução de branqueamento (uma solução de 1: 4 de 10 M de NaOH doméstico hipoclorito de sódio) colocados à borda de uma placa de RNAi. Deixe secar e permitir L1s chocar e mudar para o gramado bacteriano.
         Nota: Branqueamento solução, geralmente usada para descontaminação, mata tudo, mas os embriões em suas cascas de ovo. Portanto, não coloque a solução de branqueamento em ou perto da bactéria de RNAi.
      2. Escolher sementes ~ 20 jovens adultos gravid na placa de RNAi e deixar eles colocam ovos para 2-3 h ou até há cerca de 300 ovos no prato, em seguida pegar os adultos.
         Nota: Este método pode causar contaminação das bactérias por OP50 RNAi. Para reduzir este risco, primeiro transferir adultos em um prato NGM sem bactérias para remover OP50 aderente para os vermes. Cuide-se que adultos não ficar muito tempo em placas de RNAi para evitar o efeito de RNAi sobre embriões.
      3. Escolha ou coloque minhocas de fase L1 diretamente sobre placas de RNAi (ver referência ( ²⁹)-para protocolos de sincronização).
         Nota: Pode-se usar um protocolo de sincronização abreviado (por exemplo, para um set-up moderadamente larga escala) lavando vermes de placas densamente povoadas com M9 para várias vezes até que os ovos apenas permanecem. Depois de 2-3h de incubação L1s pode então ser coletado em M9 estas placas, limpeza por lavagens adicionais para remover as bactérias (3x em M9) e semeado em placas de RNAi.
   2. Diluição de RNAi bactérias com bactérias de RNAi vetor vazio (RNAi suave)
      Nota: redução na quantidade de dsRNA diluindo a quantidade de bactérias de RNAi pode ser suficiente para induzir efeitos mais suaves e também pode reduzir a mortalidade embrionária sem abolir todos os efeitos embrionários. Diluição de RNAi bactérias também é usada para experimentos de RNAi duplos e titula-se condições para experiências de interação genética (por exemplo, para gerar efeitos leves para a avaliação de realce e fortes efeitos para a avaliação da supressão).
      1. Grow RNAi e emPTY vector HT115 RNAi bactérias no meio de 1 mL LB com ampicilina 50 de µ g/mL, como feito para condições padrão de RNAi.
      2. Diluir as bactérias de RNAi com bactérias de RNAi vetor vazio para conseguir uma gama de concentrações diferentes, por exemplo, de 5%, 15%, 30%, 50%, 70%. Misture as bactérias bem pipetando para cima e para baixo. Pipetar 200 µ l misturado as bactérias em uma placa de RNAi.
      3. Escolhe as larvas L4 de 4-6 em cada placa de RNAi. Verifique o fenótipo do 2º dia em diante.
   3. RNAi estirpes sensíveis (forte RNAi)
      1. usar cepas de RNAi sensíveis disponíveis, por exemplo, eri-1 (mg366), rrf-3 (pk1426) ou (mg366) eri-1 lin-15B (n744) (a último super-sensibilidade) e siga procedimentos de RNAi padrão descritos em 2.1 ^{31 , 32 , 33}.
         Nota: RNAi estirpes sensíveis (por exemplo 3-rrf e eri-1) podem ter tamanhos de ninhada menores do que animais selvagem-tipo e ser estéril a 25 ° C. Eles também podem ter um baixo fundo de fenótipos próprios, por exemplo, baixa penetrante letalidade embrionária, que tem que ser levado em conta ao avaliar efeitos específicos de RNAi.

3. Na vivo por imagens do intestino c. elegans por dissecando a microscopia de fluorescência

1. antes de visualizar os animais sob a luz de fluorescência, verificar placas de RNAi sob luz brilhante em qualquer microscópio de dissecação. Avaliar (e potencialmente grave) fenótipos visíveis sob a luz brilhante que possa afetar a análise, tais como a letalidade, esterilidade (menor número de descendentes), desenvolvimento (por exemplo, prisão larval) e outros fenótipos visíveis que podem ajudar caracterizar a função de um gene envolvido na morfogênese biogênese e lúmen de membrana polarizada.
   Nota: Placas de Pontuação única que têm descendência suficiente para avaliação (pelo menos 50), caso contrário tente condições alternativas de RNAi. Para avaliação quantitativa certifique-se que as placas não são contaminadas ou crescer OP50 (que interferem com RNAi).
2. Para visualizar os animais sob luz fluorescente, retire a tampa e coloque a placa de RNAi diretamente sob o microscópio de fluorescência a dissecação.
   Nota: Para detectar sutis fenótipos intestinais será necessário um microscópio dissecação com um acessório de fluorescência estéreo de poder mais elevado que permite uma gama suficiente de ampliação. Este protocolo descreve o uso de um escopo com um 1,5 e 10 x objetivo e uma faixa de zoom de 3.5 a 45.
3. Primeiro encontrar animais sob luz brilhante para se concentrar. Em seguida, examine os animais sob luz fluorescente na ampliação baixa (por exemplo, no âmbito do objectivo de 1,5 x), usando o filtro apropriado. Examine a placa sistematicamente do canto superior esquerdo ao canto inferior direito para digitalizar o prato inteiro para fenótipos.
4. Selecione animal de interesse e altere para o objectivo n º 10 x. Concentre-se no intestino e usar o zoom para avaliar o fenótipo de morfogênese de tubulogenesis/lúmen. Consulte a seção 5 para marcar de fenótipos. Em primeiro lugar, tire fotos em baixa ampliação. Em seguida, mudar para alta ampliação.
   Nota: Desde animais saudáveis rápidos, trabalha rapidamente, com uma mão no mouse do computador para aquisição de imagem ao focalizar o microscópio com a outra mão. Retardar os animais (por exemplo, pela colocação transitória das placas a 4 ° C) não pode ser exigido quando trabalhando com fenótipos tubulogenesis em principalmente preso embriões e larvas de início. As imagens podem ser capturadas por uma câmera CCD microscópio montado e software de captura de imagem.

4. O intestino de c. elegans em maior resolução de imagem pelo laser de varredura microscopia confocal ^{34 , 35}

1. de montagem e imobilização
   1. uso ponta do dedo para fina espalhe uma pequena quantidade de graxa ou vaselina em um círculo em uma lâmina de vidro (~ 6-8 mm de diâmetro).
      Nota: A espessura do círculo de graxa é crítica para a montagem. Para melhores resultados de imagem, apenas uma ou várias larvas de imagem de cada vez e use um círculo de graxa ultrafinos com como pouco líquido possível tal que o animal está preso diretamente entre a lâmina de vidro e lamínulas (se feito perfeitamente, animal vai ser imobilizada sem anestésico). Montagem de ovos e de animais mais velhos requerem um círculo um pouco mais grosso para evitar a destruição da amostra ao adicionar lamínula.
   2. Adicionar uma gota de tipicamente 3,5 µ l 10 mM solução de azida de sódio para o meio do círculo e pegar vermes ao microscópio dissecação.
      Nota: Prepare uma solução em stock do azida de sódio 1m dissolvendo 65,01 mg NaN3 em 1ml dH ₂ O; Adicione 200 µ l de solução 1M em 20 mL de tampão de M9. Pegar vermes rapidamente à gota de solução de azida de sódio para evitar a solução para secar. Escolha fases separadamente para a montagem ideal, com o objetivo de cerca de 50 embriões por slide e cerca de 20 larvas quando examinar as maiores populações. Pode-se usar M9 em vez de solução de azida de sódio ao escolher os embriões. Se usando a azida de sódio, animais devem ser fotografados dentro de 30 min para evitar danos aos tecidos desta substância química tóxica.
      Cuidado: azida de sódio é tóxica.
   3. Coloque delicadamente uma lamela de 22 mm × 22mm no slide. Tenha cuidado para não esmagar os vermes. Use pressão suave e verificar sob microscópio para certificar-se de que os vermes são fixos bem entre lâmina e lamínula de dissecção. Rotular o slide.
      Nota: A quantidade correta de pressão é essencial para evitar danificar a amostra (muita pressão) e não o tratando bem (pressão muito pouco: animais flutuam em vez de grudar o slide). Animais flutuantes essencialmente impedem de imagem apropriada.
2. Imagem
   1. slide lugar sob o microscópio confocal. Busca de vermes com objetivo e foco de 10x.
      Nota: Usar luz brilhante para foco sempre que possível para evitar fotobranqueamento.
   2. Mudança de x 60 ou 100 x objetivo e foco no intestino.
      Nota: O intestino pode ser facilmente identificado sob a luz brilhante por seu lúmen correndo no meio do animal, da faringe até o ânus perto da ponta da cauda. Tenha cuidado ao aplicar o óleo para o x 60 ou 100 x objetivo de óleo. Misturar diferentes tipos de óleos pode interferir com mais imagens. Pequena gota de lugar de óleo no slide quando usando um microscópio vertical ou no objetivo ao usar um escopo invertido, tomando cuidado para não contaminar outros objectivos ou partes do microscópio.
   3. Estabelecer Kohler DIC/Nomarski iluminação para o objetivo a ser usado para a digitalização de ³⁶. Inspecione o animal sob luz fluorescente com canal adequado para verificar a rotulagem do intestino e/ou verificar o fenótipo, a fim de selecionar o modelo apropriado para a imagem latente. Trabalhar rapidamente para evitar descoramento.
   4. Interruptor de digitalização para restringir a imagem em perspectiva para o intestino, definindo limites ao seu lado dorsal e ventral de digitalização a laser.
      Nota: Bracketing intestino desta forma é essencial se fluoróforo também rotula estruturas fora do intestino. Durante esta verificação piloto, trabalho com condições de digitalização rápidas para avOID fotobranqueamento.
   5. Parar de digitalização para selecionar os parâmetros de digitalização para o experimento. Conjunto de 6-20 seções para digitalização intestinal ao longo do eixo z, por exemplo, intervalos de 0,2 µm, dependendo da pergunta, palco das considerações de animais e/ou técnicos. Definir o quadro em média por imagem dependendo da complexidade da rotulagem e necessária resolução para reduzir o ruído.
      Nota: Detalhes de configuração variam de acordo com microscópio e experimentar. Um pode ser necessário reduzir a quantidade de seções para evitar o branqueamento se realizando a varredura sequencial de três diferentes fluorophores. Ajuste o número de quadros para o número de seções (deve ser menor que o número de seções para evitar distorção da imagem; também pesam no aumento fotobranqueamento). 4-6 frames são geralmente suficientes.
   6. Voltar a digitalização com definitiva as condições de exploração (lento) do laser e ajustar: brilho (uso mínimo ganho para reduzir o plano de fundo); a laser poder (tão alto quanto necessário, tão baixo quanto possível - aumentos fotobranqueamento; geralmente configuração mínima é adequada); pinhole (evitar abertura se não for necessária, para manter a resolução).
      Nota: Digitalização condições dependem do espécime e necessita de ser determinado empiricamente no início da sessão de digitalização. Certifique-se de que o brilho não exceda saturação (limitará a capacidade de modificar a imagem posteriormente pelo software de imagem). Ao definir as condições de exploração, também considerar que condições idênticas devem ser utilizadas para todas as imagens em experimentos que comparar animais experimentais com controles.
   7. Série de captura de imagem. Mesclar imagens em uma imagem de projeção única.
      Nota: Pode ter que salvar imagens de projeção e/ou sobreposições separadamente, dependendo do microscópio.
   8. Quando a tomada de imagens de multi-canal usa varredura sequencial para evitar infiltração entre canais (críticos para estudos de localização co).
      Nota: As configurações de imagem podem precisam ser alterados dado aumento fotobranqueamento conectado para mais tempo de digitalização.
   9. Sempre adquirir imagens DIC/Nomarski correspondentes (seções) para Marcos e estado geral da morfologia da animal digitalizado.

5. Quantificação de biogênese de membrana polarizada defeitos no intestino c. elegans

Nota: exemplo: Basolateral deslocamento apical ERM-1::GFP e formação ectópica lúmen lateral induzido por deixe-767 e APS-1 RNAi.

1. Marcando fenótipos sob o microscópio dissecação ( Figura 5 A, D, E)
   1. definir categorias para marcar. Exemplo: (i) tipo selvagem (WT), (ii) basolateral deslocamento de ERM-1::GFP (defeito de polaridade) e (iii) formação de lúmen ectópicas (desenvolve posterior deslocamento basolateral).
      Nota: Uma análise visual de baixa ampliação presta-se a marcar números de animais com ou sem um fenótipo específico. Aqui, nós selecionamos um exemplo das três categorias fenotípicas qualitativamente diferentes que estão com o mesmo indicativo de tempo de um agravamento do fenótipo polaridade que é analisado. No entanto, pode ser marcou uma variedade de diferentes fenótipos qualitativos e quantitativos, como o lúmen morfogênese defeitos, ausência/presença (ou números) de vacúolos citoplasmáticos positivos de GFP, lúmen Diâmetro e tamanho ou número de cistos intralumenal (veja < classe forte = "xfig" > Figura 3 para exemplos).
   2. Dependendo na magnitude das diferenças esperadas, marcar aproximadamente 100 minhocas ao vivo em suas placas de ágar sob o microscópio dissecação em um conjunto duplicado ou triplicado de experimentos.
      Nota: Um deve marcar cada animal que entra em exibição na digitalização de placas sistematicamente, por exemplo, da esquerda superior para inferior direito da placa (certifique-se de vermes têm preenchido as placas uniformemente).
   3. Repita isso para 3 jogos independentes de experimentos. Gerar o gráfico de barras e avaliar a significância dos resultados.
2. Pontuação fenótipos sob o microscópio confocal ( Figura 5 B)
   1. definir categorias para marcar, por exemplo, o número de gravidez ectópica lumens por animal
      Nota: uma maior ampliação análise Visual presta-se para marcar um marcador quantificável ou fenótipo por animal e permite marcar de marcadores subcellular que podem não ser perceptíveis por microscopia de dissecação. O presente exemplo de contagem ectópica lumens por animal em um subconjunto de vermes da mesma experiência anteriormente avaliados por microscopia (5.1.1, categoria 3) de dissecação refina a avaliação do fenótipo agravamento da polaridade que é examinado aqui. No entanto, uma variedade de outros parâmetros ou fenótipos pode ser marcado, por exemplo, o número de vesículas, presença/ausência ou número de componentes subcelulares que co localizar, intensidade de fluorescência (este último quantificada pelo ImageJ; ver acompanhando o papel na canal excretor) ².
   2. Dependendo da magnitude das diferenças esperadas, quantificar o marcador fenotípico (aqui, gravidez ectópica lúmens) em cerca de 20 animais em um conjunto duplicado ou triplicado de experiências sob o microscópio confocal.
   3. Repeat para 3 conjuntos independentes de experimentos. Gerar gráficos de barra e avaliar a significância dos resultados.

Este protocolo descreve como molecularmente, analisar e Visualizar membrana polarizada morfogênese biogênese e lúmen no intestino c. elegans , a nível subcelular e única célula. A camada única de células vinte e c. elegans intestino é formado por dirigido a divisão celular e migração durante a embriogênese meado. A este tempo, polarizada membrana domínios se estabeleceu, no entanto, de novo membrana polarizada biogênese continua no maduro mas expandindo o epitélio ao longo de quatro estágios larvas até a idade adulta, permitir focalizar a análise polarizado biogênese da membrana (figura 1A).

Para visualizar os componentes celulares e subcelulares de c. elegans , duas estratégias são usadas: imunofluorescência (detalhada no presente protocolo, seção 1; Figura 2 , Figura 4 -F) e a expressão de proteínas da fusão da fluorescência (detalhada no livro de acompanhamento sobre canal excretor polarizada membrana biogênese²; Figura 1B, Figura 2, Figura 4, Figura 5). Duplo e vários rótulos, combinando diferentes rótulos de cada ou os dois métodos, podem resolver assimetrias de membrana tais como apical e domínios de membrana basolateral e a relação dos diferentes componentes subcelulares uns aos outros (Figura 2-, -E Figura 4). O vinculador de membrana-citoesqueleto ERM-1::GFP é mostrado aqui como um indicador de biogênese de membrana apical que coincide com a morfogênese do lúmen nesta camada única de epitélio. Usando este marcador, uma matriz de intestinal membrana apical/lúmen biogênese defeitos e os defeitos do gene causador pode ser identificada por estudos de perda-de-função, por exemplo por imparciais telas de todo o genoma usando RNAi (RNAi abordagens adoptadas para o geração de tais fenótipos são descritas na secção 2 do presente protocolo). Figura 3 e Figura 4 mostram exemplos de imagens de baixa a moderada ampliação da membrana apical/lúmen fenótipos biogênese adquiridos por um microscópio de fluorescência dissecação, equipado com um objectivo de alta potência; e de maior ampliação imagens adquiridas por um laser confocal microscópio (estas abordagens microscópicas são descritas nas seções 3 e 4). Como exemplo de quantificar a membrana polarizada biogênese defeitos, os efeitos de RNAi deixe-767 (codificação uma esteroide desidrogenase/3-ketoacyl-CoA redutase), com e aps-1 (codificação a subunidade sigma a clatrina AP-1 adaptador) na MTC–1::GFP localização e posicionamento do lúmen são mostrados na Figura 5.

Figura 1 : Estrutura celular e subcellular e morfogênese do selvagem-tipo C. elegans intestino. () Esquemática do desenvolvimento intestinal de c. elegans , composição celular e endo - e membranas de plasma. O intestino de c. elegans é gerado uma relação clonal do blastômero E nascido na fase de 8 células. Depois de quatro rodadas de divisão celular, suas 16 células forma (E16 etapa) um epitélio valvas simétrico duplicar camadas¹⁵. Nesta fase o citoplasma de cada célula polariza, com núcleos movendo-se para os futuros componentes apicais e citoplasmáticos rumo o oposto (futuro basal), domínios de membrana. Em uma etapa de intercalação células à esquerda e direita ventrais mover (em paralelo) para a camada de células dorsal para formar o tubo bilateralmente simétrico de 9 anéis INT. Cada célula enfrenta e constrói o lúmen com sua membrana apical/lumenal (verde; estruturalmente distintos por membrana específicos microdomains, microvilli) e contatos vizinhas de células ou a cavidade do corpo com suas membranas basolateral (azul), exceto a primeira Anel INT que é formado por quatro células. Entroncamentos apicais (vermelho) separam domínios de membrana apicais e basolateral. Depois de intercalação, biogênese de membrana de novo continua acompanhando o crescimento do intestino durante a embriogênese tarde e os quatro estágios larvais na idade adulta, onde apenas mínimo crescimento ocorre (fase de manutenção de membrana polarizada ). A única célula ampliada indica o sistema endomembranoso com ER e Golgi acima do núcleo (N) e vesículas CDDP. (B) DIC/Nomarski e sobreposição confocal micrografias do intestino em desenvolvimento c. elegans rotulado com o marcador de membrana apical-citoesqueleto ERM-1::GFP. O intestino na fase de vírgula é descrito por uma linha branca (ERM-1::GFP já fraca é expressa na membrana apical no início de intercalação, mas não pode ser apreciada nesta imagem). Os animais aqui e abaixo são mostrado com anterior (cabeça), posterior (cauda) bem, até dorsal, ventral para baixo. Barra de escala: 5 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : Exemplos de duplos e triplos etiquetar o desenvolvimento selvagem-tipo C. elegans intestino usando anticorpos e proteínas da fusão. (A, B) Embriões. (A) fase de vírgula. PAR-6::GFP (verde; componente da polaridade apical do PAR complexa), anticorpo anti-sub-par-3 (vermelho/TRITC (isotiocianato de tetrametil rodamina); outro componente da polaridade apical do PAR complexo) e MH33 (azul/Cy5 (Cyanine5); anti-IFB-2/intermediário filamento). PAR-6::GFP e o anticorpo PAR-3 etiqueta a membrana apical do intestino c. elegans (entre parênteses). IFB-2, outro marcador apical em fases posteriores, é panmembraneously localizada nesta fase inicial. PAR-6::GFP e sub-par-3 também rotular a faringe (à esquerda); o lúmen intestinal é indicado pela sua sobreposição com a IFB-2 (turquesa) e o tubo intestinal é delineado pelo azul anti-IFB-2 (à direita). (B) fase 2 vezes. AJM-1::GFP (verde; componente de junção), anticorpo ICB4 (vermelho/Alexa, ICB4 detecta um antígeno intestinal membranosa desconhecido). AJM-1::GFP rotula as junções apicais do intestino c. elegans , visível como padrão de peri-lumenal escada (também rotula hypodermal entroncamentos; não visível desde a imagem é focada no intestino; ver secção 4, imagem latente confocal). ICB4 manchas todas as membranas do intestino c. elegans . Setas apontam para as membranas basolateral manchadas pelo anti-ICB4. (C, D) Larvas de L2. (C) deixe-413::GFP (verde), faloidina (Vermelho/Texas, um phallotoxin, vinculando a F-Actina) e MH33 (azul/Cyanine5, anti-IFB-2). LET-413/rabisco é um componente da polaridade basal complexa e localiza-se nas membranas basolateral do intestino c. elegans (entre parênteses). Faloidina e o anticorpo IFB-2 etiqueta o citoesqueleto submembraneous apical do intestino c. elegans (roxo). Faloidina também fortemente manchas de músculos da parede corporal, esmagadora a coloração intestinal. Baixo-relevo mostra maior ampliação da área de box. (E) larva L3. SLCF-1::GFP (verde; integral membtransportador de componente/açúcar Rodrigues), ERM-1::mCherry (vermelho) e anticorpo MH27 (azul/Cyanine5, anti-AJM-1). SLCF-1::GFP rotula a membrana basolateral, enquanto ERM-1::mCherry rotula a membrana apical do intestino c. elegans (entre parênteses); AJM-1 rotula seus entroncamentos apicais. (F-F' ') Larva de L2. (F, F') Imagens de cor única. SLCF-1::GFP (verde) rotula a membrana basolateral (membranas laterais indicadas pelas setas brancas finas). MH27 junções apicais (azul/Cyanine5) rótulos (setas amarelas curtas). (F''F' ') Sobreposição de imagens com e sem actina. As inserções mostram maior ampliação das áreas de box. Nota clara distinção de apicolateral ângulo de células intestinais por estes marcadores de membrana/junção diferentes que aparecem superficialmente semelhante em imagens de cor única (F, F'). Setas brancas grossas em F' 'apontar para o citoesqueleto de actina apical/lumenal etiquetado por faloidina (caso contrário oprimido por actina do músculo). Todas as imagens são projeções confocal (z-pilhas de 0,2 µm), adquiridas pela varredura sequencial para evitar infiltração entre canais. Escala de barras (para A-E, F-F ' ' e todas as inserções): 5 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 : Exemplos de C. elegans morfogênese polarizada de membrana e lúmen intestinal defeitos na ampliação de baixa a moderada (dissecando micrografias de fluorescência). Todas as imagens são adquiridas por um microscópio fluorescente dissecação, equipado com um acessório feito por fluorescência de estéreo de alta potência (Tabela de materiais). São mostradas diferentes ampliações. Todos os fenótipos foram obtidos por RNAi com genes diferentes em uma cepa rotulado com ERM-1::GFP (localizado na membrana apical/lumenal canal intestinal e excretor em embrionários e primeiros estágios larvas, mostrados aqui). Os fenótipos de polaridade e lúmen intestinais são: embrião de tipo selvagem (A, B) (A) e larva (B); (C, D) deslocamento basolateral de ERM-1::GFP; células intestinais são ampliadas e aparecer inchadas neste embrião (C, setas apontam para as células intestinais única), mas são do tamanho do selvagem-tipo e arranjo nestas larvas (D, pontos de seta lateral nas membranas entre INT II e III); (E) alargado e complicado lúmen em três embriões; (F) ERM-1::GFP ampliação para área de junção lateral (lúmen em zigue-zague) e no citoplasma intestinal que contém vacúolos GFP-negativo (setas); (G) cistos lumenal inbetween intralumenal aderências (setas ponto dois cistos). (H) citoplasmáticos e basolateral ERM-1::GFP deslocamento com gravidez ectópica lúmens (setas); (eu) ERM-1::GFP deslocamento para partitura de GFP-positivo (setas) no citoplasma. Canais excretores e fenótipos canal excretor não são descritos aqui (canal é mostrado para o intestino à esquerda, à direita em todas as imagens). Barras de escala: 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4 : Exemplos de C. elegans intestinal polarizada membrana e lúmen morfogênese defeitos na maior ampliação (imagens confocal). (A, C, E, G, I, K) Embriões. (B, D, F, H, J, L) Larvas. Todos os fenótipos foram obtidos por RNAi com genes diferentes em uma cepa rotulado com ERM-1::GFP (verde em todas as imagens). Imagem latente está voltada para o intestino. Imagens de embriões também mostram canais excretores (lado esquerdo da imagem), incluindo os fenótipos de canal (não descritos). (A, B) Embrião de tipo selvagem (A) e larva (B). (C) Basolateral deslocamento apical ERM-1::GFP (estágio vírgula; intercalação final). (D) conversão de polaridade: basolateral deslocamento apical ERM-1::GFP e acúmulo apical de basolateral ICB4, revelada através da marcação dupla. F-Actina (etiquetado por faloidina-TRITC) descreve os animais pela coloração de feixes musculares longitudinais (animal é rotulado de triplo). (E) deslocamento Basolateral de ERM-1::GFP na tarde de 3 vezes do embrião. O anticorpo apical do IFB-2 (azul/Cyanine5) indica o lúmen intacta e peri-lumenal filamentos intermediários. (F) gravidez ectópica lúmens etiquetados por anti-IFB-2 (azul/Cyanine5). (G) ERM-1::GFP negativa vacúolos no citoplasma intestinal. (H) ERM-1::GFP positivos vacúolos no citoplasma intestinal. (I, J) Ausência de lúmen em embriões e larvas, respectivamente. (K) grande intestino. Cística (L) e intestino contorcido. (A, D, H, I, J, K, L) são projeções confocal. (B, C, E, F) são seções confocal. Brilho foi aumentado em G para destacar vacúolos citoplasmáticos de GFP-negativo. Barras de escala: 10 µm (mesmo para todos os embriões e larvas, respectivamente). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5 : Conversão de polaridade intestinal e reversão: um exemplo para a quantificação de defeitos de biogênese de membrana e lúmen polarizadas. (A, B, C) deixe-767e aps-1RNAi ambos causam deslocamento de ERM-1::GFP basolateral (BL) e formação de lúmen ectópicas (EL), mas em diferentes estádios de desenvolvimento. (A) quantificação por microscópio de dissecção: contagem dos embriões (esquerda) e larvas (àdireita) com fenótipos de polaridade 2 dias após a semeadura vermes nas placas de RNAi. Nota: todos os animais de simulação e let-767(RNAi) eclodiram nesta época (assim não há nenhum embriões, que tinha, no entanto, todos selvagem-tipo polaridade; quebrado colunas de linha). APS-1 RNAi induz a polaridade defeitos já em embriões, Considerando que deixe-767RNAi induz-los em larvas. O maior percentual de gravidez ectópica lúmens (vs basolateral deslocamento) em embriões de RNAi aps-1contra larvas é devido à detenção de embriões com gravidez ectópica lúmens. (B) quantificação por microscopia confocal: contagem de uma gravidez ectópica lumens por animal no início do desenvolvimento de gravidez ectópica lúmen em larvas. deixe-767 RNAi induz mais ectópicos lúmens em larvas do que aps-1RNAi (aps-1RNAi larvinhas "vestimentas" que têm não arresTed como embriões). (C) imagens Confocal para larvas do selvagem-tipo e larvas com deslocamento de basolateral ERM-1::GFP (BL) e gravidez ectópica lúmens (EL); barra de escala: 5µm. reversão de polaridade (D, E) em animais de RNAi deixe-767(contagem dos animais com e sem defeito de polaridade [BL/EL] por microscópio de dissecção). 20 let-767(RNAi) animais com fenótipos lúmen ectópica suave foram transferidos de uma placa de RNAi para uma placa de OP50 no dia 4 e avaliados após 40 horas. (D) mais de 50% de larvas foram revertidos para o selvagem-tipo polaridade (ERM-1 na membrana apical). (E) 20% de animais estão crescendo além da fase larval de L1 (let-767(RNAi) resulta em prisão de L1). Todos os dados são mostrados como média + /-SEM, n = 3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Este protocolo descreve como combinar perda-de-função padrão genético/RNAi e imaging (rotulagem e microscópicas) abordagens para aproveitar-se do epitélio intestinal de c. elegans como modelo para o visual e molecular dissecação de in vivo polarizada biogênese de membrana e lúmen.

Rotulagem

Este protocolo centra-se na mancha do anticorpo. In situ de rotulagem por anticorpos é uma abordagem alternativa altamente específica para rotulagem por fusão fluorescente proteínas (descritas no documento que acompanha na biogênese de membrana do canal excretor)². Embora anticorpos não permite imagens ao vivo, pode fornecer confirmação para localização de uma proteína de interesse (nenhum método de rotulagem é sem falhar). Além disso, perguntas sobre morfogênese e/ou a localização subcelular de uma proteína muitas vezes podem ser avaliadas em animais fixos. Immunostaining é útil para duplo e vários rótulos e pode ser combinada com rotulagem por proteínas da fusão fluorescente se estas podem ser preservadas através dos procedimentos de fixação e permeabilização necessários. O protocolo descrito aqui normalmente permite que este (Figura 2). In situ de rotulagem de animais fixos por anticorpos ou manchas químicas também pode fornecer vantagens para superresolution técnicas microscópicas como tempestade (microscopia de reconstrução óptica estocásticos). Imunofluorescência detecta o antígeno endógeno e pode ser adaptada, por exemplo, para distinguir as modificações do posttranslational de proteína específica. Pode produzir resultados rápidos se os anticorpos estão disponíveis, uma vez em situ técnicas de coloração - não como simples em c. elegans espécimes como na cultura de pilha - foram estabelecidos.

A geração de um novo anticorpo (não descrito aqui) é, no entanto, demorada. Infelizmente, a seleção de comercialmente disponível c. elegans anticorpos primários continua a ser bastante pequeno, e nem todos são capazes de detectar o antígeno em situ (ver tabela 1 para exemplos de anticorpos demonstraram detecte antígenos intestinal em situe tabela 3 para recursos adicionais). A maioria dos anticorpos gerados contra antígenos vertebrados não serão reagem de forma cruzada com seus homologs de c. elegans . A seleção de anticorpos secundários deve levar em conta a espécie do primeiro anticorpo (discutido na imunofluorescência geral protocolos^27,28). Grandes seleções estão comercialmente disponíveis com corantes fluorescentes (por exemplo, Alexa Fluor corantes) de melhorar continuamente. Para otimizado de coloração, corantes podem ser selecionados por sua capacidade de combinar o microscópio usado para geração de imagens, por exemplo, o laser do microscópio confocal, ou, se a microscopia de super resolução também está prevista, por sua capacidade de "piscar"³⁷. Etiquetados diretamente os anticorpos primários ou químicos, manchas (por exemplo, fluorescente etiquetado faloidina) também estão disponíveis e são particularmente úteis para a dupla coloração.

A dificuldade para o anticorpo em situ coloração em c. elegans é a impermeabilidade da casca de ovo do embrião e a cutícula larval/adulto que ambos requerem interrupção química e/ou mecânica para permitir o acesso do anticorpo para o tecido. Embora os protocolos de coloração complexo anticorpo líquido foram desenvolvidos para superar este problema^27,28, a maioria inclui colagenase por permeabilização, que tende a danificar o tecido-alvo. Em contraste, o método de congelamento-rachadura descrito aqui é uma maneira simples para abrir as cutículas do worm ou cascas de ovos. É realizada diretamente sobre o vidro deslizar onde as amostras são coletadas (e onde o resto da coloração é realizado também), e funciona particularmente bem para ovos e larvas que grudar melhor (ou seja, os estágios predominantemente examinados em lâminas de vidro estudos de tubulogenesis). Também não interfere com a preservação das proteínas da fusão fluoróforo-rotulados. A técnica requer alguma destreza manual, como a pressão correta na lamela (antes de passar rapidamente) e evitar a pressão de cisalhamento são essenciais para a preservação da amostra (como é o tratamento gentil e pipetagem durante todo o procedimento de coloração).

Condições de fixação podem precisar de ser empiricamente determinado e ajustado para o estrutura/antigénio que está a ser manchado (discutidas no²⁷). Mais suave (por exemplo, com base em formol) técnicas de fixação podem melhor preservar a antigenicidade, embora esta deve ser equilibrada com a necessidade de manter a morfologia do tecido, fundamental para a análise da morfogênese. Fixação mais suave condições também ajuda a preservar as proteínas da fusão fluorescente em experimentos duplos de rotulagem. Da mesma forma, a quantidade de agente (por exemplo, leite ou soro Albumina bovina/BSA) e detergente na lavagem de solução de bloqueio requer um ajuste empírico para equilibrar o fundo com coloração específica. Detalhes sobre aspectos gerais de técnicas de imunofluorescência, por exemplo, a discussão das diferentes técnicas de coloração, o design de controlos adequados e dicas para otimizar esses procedimentos para intestinos worm (por exemplo, minimizando intestinal autofluorescência) pode ser encontrada em geral e protocolos de imunofluorescência específica de c. elegans , referenciado em todo.

Interferência com a função dos genes e avaliação dos fenótipos tubulogenesis

Este protocolo destaca abordagens específicas de RNAi que são úteis ao avaliar genes com funções precoce, essenciais e onipresentes, cuja perda parcial (ao invés de completa) é mais informativa, como é o caso para a maioria dos genes tubulogenesis (nosso genoma-largo tela na ERM-1::GFP-intestinos rotulados sugeriram que a interferência com tais causas de genes > 90% de todos os fenótipos de tubulogenesis informativo nesta determinada configuração¹²). As muitas vantagens que c. elegans oferece para manipulações genéticas (por exemplo, seu tempo de geração curto) e as diferentes abordagens para perturbar a função dos genes pelo frente (começando com o função/fenótipo) e reverter (começando com o abordagens genéticas de gene) são discutidas no geral c. elegans literatura^31,38. A disponibilidade de comercialmente disponível todo o genoma RNAi, alimentando as bibliotecas também permite que se use esta técnica genética reversa como uma ferramenta de rastreio genético para a frente (ver Tabela de materiais de recursos). As vantagens específicas para a análise de tubulogenesis de RNAi incluem sua habilidade: para gerar uma variedade de fenótipos equivalentes a uma série de alelos mutante (isso geralmente funciona bem para os genes da morfogênese dose-dependente); para remover maternas RNAs (normalmente envolvido na morfogênese início/tubulogenesis); estágio-especificamente interferir (úteis para avaliar efeitos na biogênese de membrana polarizada durante o crescimento larval postmitotic).

Detalhes sobre aspectos gerais dos procedimentos de RNAi são discutidos em árbitros (^26,s = "xref" > 31). Chave para a análise de fenótipos tubulogenesis letal é a capacidade de modular a RNAi condições para aumentar o espectro de fenótipos. Informativo tubulogenesis fenótipos geralmente podem ser gerados em um fundo do selvagem-tipo sem a necessidade de intestino específicos RNAi cepas³⁹. No entanto, essas estirpes estão disponível se este falhar e também podem ser usados para distinguir células autónomas de efeitos não-autónomos. Diferentes abordagens para a força de RNAi de modulação foram relatadas, por exemplo, a titulação das concentrações de IPTG para indução do dsRNA, uma abordagem que pode produzir resultados mais reprodutíveis³⁰. No entanto, titulação quantitativa exata não pode ser necessária quando visando gerar um espectro de fenótipos diferentes. No geral, o sucesso desta análise não é muito dependente de maximizar o efeito de RNAi como é relativo à determinação de condições de RNAi que geram um espectro informativo dos fenótipos (que muitas vezes pode ser o resultado de qualidade inferior (por exemplo, mais suave) RNAi condições).

Para a avaliação visual dos fenótipos tubulogenesis induzida por RNAi é importante determinar a janela ideal para avaliação fenotípica. É melhor para começar a avaliar as placas mais cedo (por exemplo, dois dias após a colheita os animais para suas placas de RNAi sob condições normais de RNAi) e segui-los o tempo suficiente para possíveis efeitos tardios. Um curso de tempo no desenvolvimento de um agravamento da defeito de polaridade, por exemplo, deve cobrir 3-7 dias em larvas normalmente presos. Condições para a análise de biogênese de membrana polarizada em postmitotic non-dividir células do intestino larval podem ser melhoradas quando usando mutantes ou RNAi animais com crescimento abrandou (como, por exemplo, let-767(RNAi) ou mutante de animais ¹², Figura 5). Qualquer curso de tempo tem que ser anulado se aparecem animais F2 (pode remover L4s em experiências onde a maioria mas não todos os animais prende como larvas). Cada experimento requer a avaliação concomitante de apropriados controles positivos e negativos (por exemplo, RNAi bacteriano clones que induzir um fenótipo tubulogenesis definidos e vazio vector ou mexidos clones de RNAi, respectivamente). Outro requisito para a avaliação é um tamanho de ninhada suficiente (pelo menos 50). Se não atendidas, outras condições de RNAi (por exemplo, condicional) podem ser tentadas. Finalmente, alguns fenótipos particularmente interessante de tubulogenesis ocorrerem em baixa penetrância, assim, um número suficiente de animais deve ser avaliado.

Microscopia

Ampliação de baixa a moderada, dissecando a microscopia fluorescente e microscopia confocal de alta ampliação, os dois procedimentos de imagem padrão descritos aqui, são normalmente suficientes para caracterizar os aspectos básicos de um fenótipo de tubo ou lúmen na C intestino e também pode ser usado para conjuntos maiores de animais em telas para a frente de tela visualmente. Dissecando a microscopia de fluorescência permite: no vivo imagens dos animais em suas placas (no entanto, animais vivos, transitoriamente, imobilizados pelos anestésicos, também podem ser recuperados de montagens depois confocal ou imagem DIC); triagem de grandes conjuntos de animais; rastreamento de eventos do desenvolvimento (por exemplo, o deslocamento e a substituição de um marcador polarizada durante a expansão de membrana); acompanhamento de testes padrões da expressão específica (alguns padrões e assimetrias melhor distinguem-se na ampliação baixa); selecionando e escolhendo vermes fluorescentes apropriados para posterior análise (por exemplo, microscopia confocal) ou manutenção dos transgenes extracromossômico. Visualização de alta ampliação pela microscopia confocal permite caracterizar o fenótipo a nível subcelular e única célula. Este protocolo descreve a imagem com um laser confocal microscópio que oferece o melhor confocality sobre alternativas tais como um microscópio confocal de disco girando. Um microscópio confocal de disco girando é, no entanto, o microscópio de escolha para estudos de dinâmicos e lapso de tempo desde que induz menor fototoxicidade (ver juízes (^34,35) para uma discussão mais aprofundada de baixa e alta ampliação microscopia em c. elegans). Romance, bem como técnicas microscópicas convencionais oferecem vantagens adicionais e permitam imagens com resolução mais alta para a faixa de escala nanométrica (por exemplo, elétron e super-resolução microscopia de transmissão; discutido em^{37, 40}).

Quando a imagem de c. elegans intestinos sob um microscópio confocal, montagem e imobilização é fundamental. Entre os produtos químicos diferentes para a imobilização, azida de sódio - embora tóxico - funciona na maioria confiantemente se a verificação é feita imediatamente. Levamisole, embora não tóxicas, produz hypercontraction que por vezes interfere com a avaliação dos fenótipos de morfogênese. Alguns anestésicos podem interferir com membrana-associado a proteínas fluorescentes e podem produzir artefatos que podem parecer defeitos de polaridade. C. elegans é um espécime de espesso e, portanto, análise 3D (seccionamento) é essencial para aproveitar a força específica do epitélio intestinal tubular que permite excelente visualização de cruzamentos apicais e a membrana lateral (não facilmente acessível em epitélios planos). Confocal configurações devem ser ajustadas para cada slide e o objetivo de obter imagens de boa qualidade, incluindo parâmetros como sucessão de, em média, poder do laser, ganho, pinhole e brilho. Um problema particular de imagem intestinal é conteúdo a este órgão de grânulos autofluorescent verde/amarelo (lisossoma relacionados organelas (LROs)) que pode interferir com a interpretação dos resultados, particularmente quando avaliar o deslocamento do GFP-etiquetado endo - e -membrana plasmática componentes associados. Este problema é bem reconhecido no campo e pode ser resolvido por diferentes abordagens (dependendo do microscópio), incluindo DAPI exclusão espectral impressões digitais e scanner empírica configurações^13,41.

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Agradecemos a Mario de Bono (MRC laboratório de Biologia Molecular, Cambridge, Reino Unido), Kenneth J. Kemphues (Universidade de Cornell, Ithaca, Estados Unidos da América), Michel Labouesse (Institut de Biologie Paris Seine, Université Pierre et Marie Curie, Paris, França), Grégoire Michaux (Université deRennes 1, Rennes, França) e o CGC, financiado pelo NIH escritório de programas de infra-estrutura de pesquisa (P40 OD010440), para tensões e anticorpos. Este trabalho foi apoiado por subsídios GM078653 NIH, MGH é 224570 e 223809 de SAA a V.G.