El intestino C. elegans como modelo una morfogénesis Lumen intercelular y En Vivo biogénesis de la membrana polarizada a nivel unicelular: etiquetado de anticuerpos, ARNi pérdida-de-función análisis y proyección de imagen de

La transparente C. elegans intestino puede servir como una"en vivo cámara de tejido" para el estudio de apicobasal membrana y lumen biogénesis a nivel unicelular y subcelular durante tubulogenesis multicelulares. Este protocolo describe cómo combinar etiquetas estándar, genética/pérdida de función RNAi y enfoques microscópicos para diseccionar estos procesos a nivel molecular.

Tubos pluricelulares, unidades fundamentales de los órganos internos todo, están compuestos de células epiteliales o endoteliales polarizadas, con apicales membranas que recubren el lumen y basolateral membranas en contacto con uno a y la matriz extracelular. Cómo esta asimetría de membrana distintivo es establecida y mantenida durante la morfogénesis de órganos sigue siendo una cuestión sin resolver de la biología celular. Este protocolo describe el intestino de C. elegans como modelo para el análisis de la biogénesis de la membrana polarizada durante la morfogénesis del tubo, con énfasis en la biogénesis de la membrana y lumen apical. El C. elegans veinte células sola capa epitelio intestinal se arregla en un simple tubo bilateralmente simétrico, permitiendo análisis a nivel unicelular. Polarización de la membrana ocurre concomitante con división de célula polarizada y migración durante la embriogénesis temprana, pero de nuevo polarizado biogénesis de la membrana continúa a lo largo de crecimiento larvario, cuando las células no proliferan y moverán. El último ajuste permite separar cambios subcelulares que intervienen simultáneamente estos diferentes procesos polarizantes, difíciles de distinguir en la mayoría de los modelos polaridad. Apical, basolateral membrana-, Unión-, citoesqueleto- y endomembranoso componentes pueden etiquetados y seguimiento en todo el desarrollo de proteínas de la fusión de GFP o evaluados por en situ tinción de anticuerpo. Junto con versatilidad genética del organismo, el intestino de C. elegans proporciona así una única en vivo modelo de lo visual, desarrollo y el análisis genético molecular de la membrana polarizada y biogénesis de tubo. Los métodos específicos (estándares) aquí descritos incluyen cómo: etiquetar intestinales componentes subcelulares mediante tinción de anticuerpo; analizar genes involucrados en la biogénesis de la membrana polarizada por pérdida de función estudios adaptados a los genes tubulogenesis por lo general esenciales; evaluar defectos de polaridad durante las diferentes etapas del desarrollo; interpretar fenotipos por epifluorescencia, contraste de interferencia diferencial (DIC) y microscopía confocal; cuantificar los defectos visuales. Este protocolo puede adaptarse para analizar cualquiera de las moléculas a menudo altamente conservadas implicadas en la polaridad epitelial, biogénesis de la membrana, tubo y lumen morfogénesis.

La generación de las asimetrías celulares y subcelulares, tales como la formación de dominios de membrana polarizada, es esencial para la morfogénesis y la función de las células, tejidos y órganos¹. Los estudios en la biogénesis de la membrana polarizada en epitelios siguen siendo un desafío técnico, puesto que los cambios de dirección en la asignación de componentes subcelulares dependen de múltiples consecutivas coincidentes extracelulares e intracelulares señales y que son difíciles de separar en la mayoría de los modelos y depende fuertemente del sistema de modelo. El modelo presentado aquí - la sola capa intestino elegans de Caenorhabditis - es un tejido de exquisita sencillez. Junto con la sola célula C. elegans excretor canal (ver acompañando a papel en la biogénesis de la membrana polarizada en el canal excretor de C. elegans ) de², ofrece varias ventajas únicas para la identificación y caracterización de moléculas requeridas para la biogénesis de la membrana polarizada. La conservación de señales de polaridad molecular de levaduras al hombre hacer este simple órgano invertebrado un excelente"en vivo cámara de tejido" para responder preguntas sobre la polaridad epitelial que son de interés directo para el sistema humano, que es todavía demasiado complejo para permitir la disección visual de estos eventos en el solo nivel en vivode la célula.

Aunque múltiples señales de polaridad conservado de (1) la matriz extracelluar (2) la membrana plasmática y sus uniones y tráfico vesicular (3) intracelular han identificado³, los principios subyacentes de su integración en el proceso de biogénesis de la membrana y el tejido epitelial polarizada es mal entendido⁴. Los modelos de unicelular clásica en vivo (e.g.S. cerevisiae y C. elegans zygote) han sido fundamentales en la definición de los principios de división de célula polarizada y polaridad antero-posterior y han identificado importantes polaridad de membrana asociados determinantes (las pequeñas GTPasas/CDC-42, las igualdades de la partición defectuosa)^5,6, pero dependen única simetría romper señales (cicatriz del brote, la entrada de esperma) y carecen de seguro de cruce Dominios de membrana apicobasal y, probablemente, el correspondiente apicobasal intracelular maquinaria de clasificación. Nuestros conocimientos actuales sobre la organización del tráfico polarizado de epitelios, sin embargo, principalmente se basa en monocultivos 2D mamíferos⁷, que carecen de señales extracelulares y de desarrollo fisiológicos que pueden cambiar la posición de la membrana Dominios y direcciones de las trayectorias de la trata de personas (un cambio de 2D a 3D en vitro sistemas de cultivo solo basta para invertir la polaridad de la membrana en las células MDCK (riñón canino Madin-Darby))⁸. Inicialmente se realizaron in vivo del desarrollo estudios en polaridad epitelial en los organismos modelo de invertebrado en epitelios planos, por ejemplo en la epidermis de Drosophila melanogaster , donde identificó la contribución crítica dinámica de cruce para la migración de la célula polarizada y célula de movimiento de la hoja⁹y endocíticas trata de polaridad mantenimiento¹⁰. El 3D en vitro y en vivo análisis de la morfogénesis de lumen en epitelios tubulares en las células MDCK y en el intestino de C. elegans , respectivamente, han identificado recientemente el requisito del tráfico intracelular de de Novo dominio (apical) y biogénesis de lumen y posicionamiento^11,12,13. El grosor del tubular (frente plano) células epiteliales es una ventaja para el análisis 3D de asimetrías subcelulares puesto que permite una distinción visual superior de la membrana apical lumenal, ensambladuras apico lateral, la membrana lateral y el posiciones de los organelos intracelulares. A estas ventajas visuales, el modelo de C. elegans añade el ajuste en vivo , eje del desarrollo, transparencia, simplicidad de plan corporal, linaje de la célula invariable y definida, analítico (genética) y ventajas adicionales que se describen a continuación.

C. elegans sí mismo es un nemátodo de estructura tubular cuya transparencia y arquitectura simple hace sus órganos internos además tubulares directamente accesible al análisis visual de la morfogénesis del tubo y del lumen. Las veinte células de su intestino (células de 21 o 22 en ocasiones)¹⁴ se derivan de una célula del progenitor único (E) y desarrollo de un epitelio de dos capas por un paso de intercalación en un tubo bilateral simétrico de nueve anillos INT (cuatro células en la primer anillo; Figura 1 esquema)^14,15,16. Análisis de linaje y el tejido del intestino, inicialmente determinado por óptica Nomarski mediante identidades nuclear¹⁷y posteriormente por microscopía de fluorescencia a través de membranas marcadas, ha proporcionado penetraciones críticas en su morfogénesis, en particular los requisitos célula autónoma y celular no autónomos para sus divisiones de célula direccionales y movimientos (p. ej., intercalación, asimetrías de derecha a izquierda, rotación del tubo anterior y posterior)^14,18 . Especificación de células endodérmicas temprano y la red reguladora genes controlan el desarrollo de este órgano modelo clonal son bien caracterizado^19,20. Aquí, sin embargo, se trata en el análisis de membrana polarizada y biogénesis del lumen de las células tubulares y de las asimetrías intracelulares de endomembranas, citoesqueleto estructuras y organelos que acompañan este proceso. El análisis se facilita por la simplicidad de este tubo, donde todas las membranas apicales (en el nivel ultraestructural por microvellosidades) ante la luz y todas las membranas basales frente a la superficie externa del tubo, con membranas laterales toquen, separada de la membrana apical por uniones (esquema de lafigura 1 , ver referencias (^16,21) para C. elegans-organización específica de apretado y componentes de ensambladura de los adherens). Biogénesis de la membrana apical es coincidente con la morfogénesis del lumen. Además, el tamaño de las células intestinales adultos - las células más grande de este pequeño animal (con excepción de la célula excretora) - aproximar el tamaño de una célula mamífera, permitiendo el seguimiento visual en vivo de los elementos subcelulares, p. ej. trayectorias de la vesícula, que suele ser intentaron en vitro en una placa de cultivo.

Con el propósito de este análisis celular y subcelular, etiquetado adecuado es fundamental. Dominios de membrana intestinal endo o plasma, ensambladuras, citoesqueletolas estructuras, los núcleos y otros organelos subcelulares pueden ser visualizados por sus componentes moleculares específicos de etiquetado. Muchos componentes se han caracterizado y siguen a descubrirse (tabla 1 da algunos ejemplos y se refiere a los recursos). Por ejemplo, varias moléculas de distinción de los compartimentos del Sistema endomembranoso intestinal, tubulares o vesiculares de la ER al Golgi vía vesículas post-Golgi a la membrana plasmática, han sido identificados²². El específico proteínas (como los lípidos y azúcares) pueden bien etiquetarse directamente, o indirectamente a través de las proteínas. Este protocolo se centra en situ tinción de anticuerpos de muestras fijas, una de dos técnicas de etiquetado estándar (consulte el documento adjunto en canal excretor tubulogenesis para una descripción de los otros técnica² - en vivo de etiquetado a través de fusiones de la proteína fluorescente - que es directamente aplicable al intestino; Tabla 2 proporciona ejemplos de promotores específicos del intestino que pueden utilizarse para impulsar la expresión de estas proteínas de fusión en el intestino). Doble o múltiples etiquetado con cualquier enfoque o con una combinación de ambos plus adicional química coloración, permite una mayor resolución visual detallada y el examen de los cambios espaciales y temporales en la localización y contratación de la específico las moléculas o de los componentes subcelulares (figura 2). La fijación y tinción de los procedimientos descritos en esta preservación de soporte de protocolo de la proteína fluorescente verde (GFP) etiquetado durante el procedimiento de inmunotinción. Para la proyección de imagen, principales puntos de la detección y caracterización de los fenotipos mediante procedimientos microscópicos (microscopía de fluorescencia confocal y disección) son tubulogenesis describe ()figura 3, 4). Estos pueden ampliarse a enfoques, por ejemplo superresolution transmisión y microscopía microscopía electrónica (no descrita aquí) la proyección de imagen de resolución más alta.

Una fuerza de este sistema es la capacidad de analizar la polaridad de las células individuales en diferentes etapas de desarrollo, de la embriogénesis hasta la edad adulta. Por ejemplo, biogénesis de la membrana apical dominio y luz pueden ser rastreada a lo largo desarrollo en el nivel unicelular mediante etiquetado con ERM-1, un enlazador de membrana muy conservada-actina de Ezrin-Radixin-moesina familia^23,24 . ERM-1 visualiza la biogénesis de la membrana apical (1) durante la morfogénesis del tubo embrionario, cuando se produce concomitantemente con división de célula polarizada y migración (movimiento de las células apicalmente alrededor del lumen durante intercalación)¹⁵; (2) durante la última extensión del tubo embrionario y larval que procede en ausencia de división celular o la migración; y (3) en el intestino adulto, donde los dominios de membrana polarizada se mantienen (figura 1). En el epitelio larvas poste-mitotic creciente, de nuevo polarizado membrana biogénesis se puede separar así de morfogénesis de tejidos polarizados, que no es posible en modelos de polaridad epitelial más en vivo y en vitro , los unicelulares resolución (por ejemplo el 3D MDCK quiste modelo⁸) incluidos. Con el etiquetado de los demás componentes, esta configuración proporciona la oportunidad (especialmente en la etapa larval L1 cuando las células tienen una mayor relación citoplasma/núcleo) distinguir los cambios intracelulares que son específicos de polarizado (de la biogénesis de la membrana por ejemplo, la reorientación de las trayectorias de la trata de personas) de los concomitante para la migración y división de célula polarizada.

La versatilidad genética de C. elegans es conocida²⁵y es un sistema potente para el análisis molecular de cualquier cuestión biológica. Un estudio sobre morfogénesis, por ejemplo, puede empezar con una cepa de tipo salvaje, una cepa transgénica donde la estructura de interés (por ejemplo, una membrana) se etiqueta con un marcador fluorescente, o con un mutante de la pérdida o ganancia de función con un defecto en este estructura. Un típico estudio genético inverso puede generar a un mutante en el gen de interés se elimina en el germline (e.g. por una eliminación específica), modificado por mutagénesis (suelen producir mutaciones puntuales con la consiguiente pérdida, reducción o aumento en la función del gen), o que su transcripción es reducido por RNAi. La facilidad de RNAi por alimentación en C. elegans²⁶ también se presta al diseño de pantallas específicos que examinan un grupo de genes de interés. Podría decirse que mayor fortaleza de un organismo modelo genético es la capacidad para llevar a cabo en vivo adelante pantallas (por ejemplo, mutagénesis, sistemáticas o genoma pantallas de RNAi) que permitan una investigación imparcial en la causa molecular de un fenotipo de interés. Por ejemplo, una visual imparcial RNAi C. elegans tubulogenesis pantalla, a partir de un animal transgénico con membranas apicales marcada con 1 ERM, descubrió una interesante conversión reversible polaridad intestinal y fenotipo lumen ectópico, utilizado aquí como un ejemplo de este tipo de análisis. Esta pantalla denominará el agotamiento de los glicoesfingolípidos (GSLs; lípidos de membrana obliga, identificados a través de sus enzimas biosintéticas para el GLS) y componentes de la clatrina de capa de la vesícula y su adaptador AP-1 los defectos moleculares específicos que causan esta polaridad fenotipo de conversión, de tal modo caracterizar estos trata de moléculas en vivo señales de polaridad de la membrana apical y lumen posicionamiento^12,13. Cuando a partir de un fenotipo de la mutación genética específica/morfogénesis, esas pantallas (o experimentos de interacción genética/ARNi sola) también pueden examinar las interacciones funcionales entre dos o varios genes de interés (ver acompañando a papel en el excretor canal para obtener un ejemplo de dicho análisis)². Este protocolo se centra en ARNi que, además de su capacidad para identificar directamente el gen cuya pérdida provoca el fenotipo en las pantallas hacia adelantadas, proporciona ventajas específicas para el análisis de la morfogénesis. Desde productos de gen dirigir morfogénesis a menudo trabajan de manera dependiente de la dosis, ARNi generalmente es exitoso en la generación de un espectro de fenotipos. La capacidad de generar fenotipos de pérdida parcial de función informativos también ayuda a resolver el problema que la mayoría de los genes tubulogenesis importantes es esencial y que sus pérdidas causan esterilidad y mortalidad embrionaria temprana. Este protocolo incluye estrategias de RNAi condicionales para superar esta dificultad y sugiere formas para optimizar la generación de un espectro más amplio de fenotipos, como una serie alélica producida por mutagénesis.

1. Etiquetado el intestino de C. elegans

Nota: Consulte el documento adjunto por los autores en el análisis del canal excretor tubulogenesis ² para la construcción de marcador fluorescente específica de tejido plásmidos y la generación de animales transgénicos, incluyendo discusiones sobre proteínas de fusión transcripcional y traduccional (este últimas requiere de la localización subcelular de una molécula de interés). Estos procedimientos pueden ser adaptados mediante el uso de promotores específicos para la molécula de interés para el intestino. Ver cuadro 1 para ejemplos de moléculas demostrado ser útiles para la visualización de C. elegans intestinal endo y membranas del plasma y sus uniones, tabla 2 para ejemplos de promotores para la conducción de expresión al intestino, y tabla 3 para recursos para colecciones de marcadores intestinales y promotores más completa.

1. Tinción de anticuerpo del intestino de C. elegans ^{27 , 28}
   1. fijación
      1. tomar un portaobjetos de vidrio limpio y use poly-L-lisina a generar una fina película de gusanos pegar. Lugar 30 μL 0.1-0.2% poly-L-lisina en la diapositiva y el lugar una segunda diapositiva en la caída de la polivinílico-L-lisina para hacer un " sandwich ". Luego frote las diapositivas suavemente varias veces para humedecer las superficies enteras de ambos y dejarlos secar 30 min etiqueta lo helado de las diapositivas al aire con lápiz.
         Nota: se hicieron alícuotas de poli-l-lisina 0.2% de 200 μL disolviendo el polvo en dH ₂ O; Esto puede almacenarse a-20 ° C. uso polivinílico de alto peso molecular-L-lisina para mejorar la que se pega de los gusanos. La concentración de poly-L-lisina es también crítico. Concentraciones demasiado bajas no permitirá gusanos pegar sino también altas concentraciones pueden generar una señal de fondo de fluorescencia. Una película demasiado gruesa puede aflojar en su totalidad.
      2. Coloque un bloque de metal plana firmemente en la parte inferior de un contenedor (por ejemplo, un contenedor de poliestireno) llenado de nitrógeno líquido.
         Nota: Se puede usar hielo seco en lugar de ello, pero mantiene un bloque de metal más estable sobre la base del contenedor de nitrógeno líquido y enfría bien.
      3. Recoger gusanos o lavarlos por fuera sus placas con M9 ²⁹ o recoger gusanos de etapa diferente (ya sea huevos, L1, L2, L3 o L4 larvas gusanos) en cada diapositiva. Por lo general, escoge ~ 100 larvas y embriones o adultos de ~ 20 a cada diapositiva. Lugar 10 μl lavada de gusanos en el centro de la diapositiva o recoger huevos/gusanos en 10 μl M9 o 10 μl de 1 x PBS ²⁷ (tamponada fosfato salino).
         1. Uso una pipeta a un gran número de gusanos para evitar agrupar.
            Nota: Mezclar poblaciones de lavada de gusanos, debido a la apretadura y diferente grosor de etapas, no se pegan bien y son menos con eficacia congelación roto (véase abajo), por lo tanto gusanos específicos de la etapa de cosecha (o poblaciones sincronizadas) da resultados superiores. Larvas del palillo mejor que los adultos y más animales se pueden colocar por diapositiva.
         2. Antes de recoger gusanos en diapositivas, transferirlas a una placa de medio de crecimiento de nematodos (NGM) ²⁹ sin OP50 bacterias. Adherente de exceso de las bacterias a los gusanos también puede interferir con que se pega. Tenga cuidado de que los gusanos no sequen.
      4. Suavemente lugar (drop) un cubreobjetos de 22 x 22 mm Cruz-maneras sobre la recogida gusanos de tal forma que sus bordes se cuelguen en por lo menos un lado de la diapositiva. Presione hacia abajo suavemente pero firme con uno o dos dedos en el cubreobjetos. Evitar el corte que pueden dañar la integridad del tejido.
      5. Inmediatamente y suavemente transfiera el porta al bloque de metal en nitrógeno líquido y déjelo reposar unos 5 min congelar. Luego " la película de " el cubreobjetos en un swift mover usando el borde voladizo.
         Nota: Este paso debe hacerse con decisión y mientras que la diapositiva está congelada para lograr " craqueo " de la cutícula. PRECAUCIÓN: Por favor, siga las pautas PPE (equipo de Protección Personal) cuando trabaje con nitrógeno líquido.
      6. Sumerja los portaobjetos craqueada a congelar en un metanol-llena la jarra de Coplin de vidrio durante 5 minutos a-20 ° C. Luego se transfieren a una acetona-llena la jarra de Coplin durante otros 5 minutos a -20 ° C.
         Nota: El metanol y la acetona deben almacenarse en-20 ° C durante al menos 30 minutos antes de su uso. Después de la fijación, las diapositivas pueden almacenarse a -20 ° C. PRECAUCIÓN: metanol y la acetona son tóxicos.
      7. Eliminar diapositivas de la jarra y dejarlos secar a temperatura ambiente (RT) antes de su uso al aire.
   2. Tinción
      1. rodean de gusanos fijadas con una fina capa de vaselina en la diapositiva. Dibuja un círculo alrededor de esta área en la parte inferior de la diapositiva para marcar el lugar.
         Nota: Es crítico que el círculo de jalea permanece intacto durante todo el procedimiento de tinción para evitar la fuga de las soluciones de tinción.
      2. Preparar una " cámara húmeda " en un recipiente plástico con tapa colocando mojado toallas de papel en él. Coloque el portaobjetos en un rack en este " cámara húmeda " para prevenir el secado de los portaobjetos durante la tinción.
         Nota: Diapositivas no deben estar en contacto con agua o con los demás.
      3. Pipetee suavemente aproximadamente 50 μL 1 x PBS en el círculo de jalea, suficiente para cubrir el área. Cierre la " cámara húmeda " con la tapa. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos
         Nota: Para evitar perder gusanos en este paso, no pipetear PBS directamente sobre las lombrices. Suavemente Coloque la punta de la pipeta en el borde del círculo y que el líquido dispersar suavemente sobre los gusanos.
      4. Inclinar el portaobjetos y aspirar lentamente el PBS con una pipeta. Coloque el portaobjetos atrás plana en la bandeja y añadir 50 μl (o la cantidad necesaria para cubrir el lugar) bloqueando la solución cuidadosamente. Incubar esto en la cámara húmeda a TA durante 15 minutos. Mientras espera, diluir los anticuerpos primarios en solución de bloqueo (véase Tabla de materiales para ejemplos de anticuerpos primarios y las concentraciones).
         Nota: Recién preparar solución bloqueo 1 x PBS (10 mL), 10% tween (50 μL) y leche en polvo (0.2G). La cantidad de detergente y la concentración de la leche puede variar dependiendo de los anticuerpos utilizados y deba determinarse empíricamente. Aspiración del líquido de la diapositiva es un paso más fácilmente perder gusanos. Controlar mediante el examen de la diapositiva en el ámbito de la disección, pero tenga cuidado de que la corredera no se deseque.
      5. Inclinar el portaobjetos y aspirar a la solución de bloqueo, utilizando las mismas precauciones como se describió anteriormente. Coloque el portaobjetos atrás planos sobre la rejilla y lentamente agregue 50 μl diluido anticuerpo primario, usando las mismas precauciones. Cierre la " cámara húmeda " e incubar a 4 ° C durante la noche o por períodos más cortos en RT.
         Nota: El tiempo de incubación puede necesitar ser determinado empíricamente por un anticuerpo específico.
      6. Aspirado fuera de la solución de anticuerpo primario como hecho para las otras soluciones. Luego lavar los portaobjetos con solución de bloqueo durante 10 min, 3 veces, añadir y eliminar la solución de la misma manera como se describe arriba.
      7. Añadir anticuerpo secundario (marcada con fluorescencia) diluido en solución de bloqueo, incubar a temperatura ambiente 1 h. Véase Tabla de materiales para ejemplos de anticuerpos secundarios y concentraciones de.
      8. Quitar el anticuerpo secundario y lavado, como el anterior, con solución de bloqueo 2 veces y para eliminar de la solución de bloqueo, con PBS 1 x durante 10 minutos.
      9. Aspirar a tanto PBS como sea posible sin permitir que la muestra a secar y retire con cuidado la gelatina alrededor de la muestra.
      10. Añadir una gota de medio de montaje sobre el espécimen, y colocar suavemente un cubreobjetos encima. Sellar los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas. Coloque los portaobjetos en una caja de la diapositiva oscura para preservar la coloración y almacenar en 4 ° C.
          Nota: Mantenga las diapositivas en la oscuridad debido a la sensibilidad a la luz (fluorescencia puede descolorarse con el tiempo) y evitar la exposición al aire por mantenerlos sellados por la misma razón. Diapositivas se pueden almacenar por largos períodos de tiempo a 4 º C ó -20 ° C.

2. Interferencia con la función de genes esenciales tubulogenesis en el intestino de C. elegans. Ejemplo: ARNi.

Nota: se cultivan cepas de C. elegans en OP50 bacterias sembradas en placas NGM según protocolos estándar ²⁹. Para RNAi, C. elegans se alimentan de HT115 ARNi bacterias en placas de ARNi con 25 carbenicilina μg/mL y 2 mM IPTG (isopropil beta-D-1-tiogalactopiranósido) para la inducción del promotor bacteriano que genera la doble trenzado RNA (dsRNA) de introducido genes de C. elegans. Concentración de IPTG y antibióticos pueden variar según ARNi clon/biblioteca y fuerza deseada de ARNi, o ARNi específico clones pueden obtenerse comercialmente disponibles en todo el genoma ARNi alimentación bibliotecas (véase ( ^{26 , 30 , 31}) para el fondo en la alimentación de RNAi en la C. elegans y Tabla de materiales reactivos de materiales y bibliotecas de RNAi).

1. ARNi estándar de alimentación ^{26 , 31}
   1. sacar la placa de la biblioteca de ARNi de-80 ° C y póngalo en hielo seco. Quitar el precinto y utilizar pipeta estéril para transferir las bacterias adherentes de clones de interés a las placas de agar LB (caldo de Luria) ²⁹ complementado con 100 μg/mL ampicilina y tetraciclina 15 μg/mL. Raya a las bacterias en la placa de agar. Sellar la placa de la biblioteca de ARNi con una nueva cinta de sellado. Crecer las bacterias durante la noche a 37 ° C.
      Nota: Estas placas de agar pueden almacenarse a 4 ° C durante varias semanas. Nuevas bacterias pueden ser cultivadas directamente de ellos para proteger la original biblioteca de ARNi.
   2. Día siguiente, inocular bacterias de ARNi de placa de agar LB en 1 mL de medio líquido LB ²⁹ que contiene 50 ampicilina μg/mL y agitar durante 14 h (8-18) o durante la noche a 37 ° C.
      Nota: Para obtener resultados óptimos utilice bacterias frescas cada vez. Ver referencia ( ³⁰) para la comparación de las condiciones de cultivo diferentes (por ejemplo, la sincronización de la cultura).
   3. Siguiente día semilla 200 μL por clon de las bacterias cultivadas de ARNi en placas separadas de ARNi. Dejar las placas secan y dejan a temperatura ambiente durante la noche para la inducción del promotor bacteriano.
   4. Transferencia de larvas de L4-etapa 4-6 en cada plato de RNAi. Incubar las placas sembradas de ARNi en RT o 22 ° C durante 3-5 días.
      Nota: Recoger las larvas L4 primero en un plato NGM sin bacterias para quitar adherente OP50 que interferir con ARNi, o transferirlos en serie a una nueva placa NGM sin OP50 tres veces. Asegúrese de que las cepas no están contaminadas, como las bacterias contaminantes - como OP50 preferido de comida para los gusanos - también interferirá con ARNi. Ajustar la temperatura según sea necesario: por ejemplo, desarrollo se acelera con la temperatura más alta; las cepas pueden ser sensibles a la temperatura.
   5. Para estudios del desarrollo, comprobar los fenotipos de la progenie F1 de día 2 en adelante.
      Nota: Es fundamental para controlar los animales con frecuencia para evitar la falta de la aparición o progresión de un fenotipo (por ejemplo, desplazamiento de marcador) cuando evalúan la biogénesis de la membrana polarizada durante el desarrollo. Enriquecimiento de la población F2 para fenotipos fuertes (por ejemplo, escogiendo hermafroditas de padre a una nueva placa de RNAi en el día 2 para seleccionar para la más fuertemente afectada la porción media de su progenie) rara vez es necesaria, desde un espectro desde leve a fuerte fenotipos es deseable.
2. RNAi condicional
   Nota: condiciones de RNAi pueden modificarse para reducir severa, o aumentar los efectos leves o interferir etapa específicamente; modificaciones son útiles para la evaluación completa de los efectos fenotípicos de las a menudo genes letales tubulogenesis.
   1. Efectos de larvas ARNi - evaluación de RNAi en la misma generación (ARNi suave, etapa-específica)
      Nota: para superar la esterilidad o mortalidad embrionaria, o para interrumpir la función génica en una embriogénesis de post de la fase específica, ARNi es inducida en larvas, post catequizador. Ponga huevos sin tratar (2.2.1.1), adultos grávidos (2.2.1.2) o sincronizado L1 (o, si lo desea, después de la etapa) larvas (2.2.1.3) en placas de RNAi; evaluar los efectos de RNAi en la misma generación, por ejemplo, dos días más tarde y a partir de larvas y adultos. Adultos grávidos
      1. pico 30-50 en una gota de solución del blanqueo (una solución de 1: 4 de 10 M NaOH y hogar hipoclorito de sodio) colocado al borde de una placa de RNAi. Deje secar y permite L1s portilla y moverse en el césped bacteriano.
         Nota: Decoloración de la solución, generalmente utilizada para la descontaminación, matará a todo pero los embriones en sus cáscaras de huevo. Por lo tanto, no coloque la solución de blanqueaba en o cerca de las bacterias de ARNi.
      2. Recoger semillas ~ 20 jóvenes grávidas en ARNi placa y dejar que ellos ponen huevos para 2-3 h o hasta que hay alrededor de 300 huevos en el plato, luego recoger de los adultos.
         Nota: Este método puede causar la contaminación de las bacterias de RNAi por OP50. Para reducir este riesgo, en primer lugar transferencia de adultos en un plato NGM sin bacterias para eliminar OP50 adherente a los gusanos. Tenga cuidado de que adultos no permanezcan demasiado tiempo en las placas de RNAi para evitar efecto de RNAi sobre embriones.
      3. Recoger o colocar gusanos de fase L1 directamente en placas de RNAi (ver referencia ( ²⁹)-protocolos de sincronización).
         Nota: Se puede utilizar un protocolo de sincronización abreviado (por ejemplo, para un montaje de moderado a gran escala) por lavado gusanos de placas densamente pobladas con M9 para varias veces hasta que queden sólo huevos. Después de 2-3h eclosión L1s pueden recogerse luego en M9 de estas placas, limpia por lavados adicionales para eliminar las bacterias (3 x en M9) y sembradas en placas de ARNi.
   2. Dilución de ARNi bacterias con bacterias de RNAi vectores vacíos (ARNi suave)
      Nota: reducción en la cantidad de dsARN diluyendo la cantidad de bacterias de RNAi puede ser suficiente para inducir efectos más leves y también puede reducir la mortalidad embrionaria sin abolir todos los efectos embrionarios. Dilución de las bacterias de RNAi también se utiliza para experimentos de RNAi doble y a valorar las condiciones para los experimentos de interacción genética (por ejemplo, para generar efectos leves para la evaluación de mejora y efectos fuertes para la evaluación de supresión).
      1. Crecer ARNi y emPTY vector ARNi HT115 bacterias en medio de 1 mL LB con ampicilina 50 en μg/mL, como hecho para las condiciones estándar de ARNi.
      2. Diluir las bacterias de ARNi con bacterias de RNAi vectores vacíos para lograr una gama de diferentes concentraciones, por ejemplo, de 5%, 15%, 30%, 50%, 70%. Mezclar la bacteria bien transfiriendo hacia arriba y hacia abajo. Pipetee 200 μL de mezcla de bacterias en una placa de ARNi.
      3. Recoger las larvas L4 de 4 a 6 en cada plato de RNAi. Compruebe el fenotipo desde el día 2 en adelante.
   3. ARNi cepas sensibles (ARNi fuerte)
      1. Use disponibles cepas sensibles a ARNi, por ejemplo, eri-1 (mg366), rrf-3 (pk1426) o eri-1 (mg366) lin-15B (n744) (el último supersensitive) y siga procedimientos estándar de ARNi se describe en 2.1 ^{31 , 32 , 33}.
         Nota: ARNi cepas sensibles (e.g. rrf-3 y eri-1) que tienen tamaños menor cría de animales de tipo silvestre y estéril a 25 ° C. También pueden tener un bajo fondo de fenotipos propios, por ejemplo bajo penetrante letalidad embrionaria, que tiene que tenerse en cuenta al evaluar los efectos específicos de ARNi.

3. En vivo la proyección de imagen del intestino de C. elegans por fluorescencia microscopía de disección

1. antes de visualizar los animales bajo la luz de la fluorescencia, verifique placas ARNi bajo luz brillante en cualquier microscopio de disección. Evaluar (y potencialmente grabar) fenotipos visibles bajo luz brillante que pueda afectar el análisis, tales como mortalidad, esterilidad (menor número de progenie), desarrollo (e.g. larval paro) y otros fenotipos accesibles que pueden ayudar a caracterizar la función de un gen implicado en la morfogénesis de la biogénesis y lumen de membrana polarizada.
   Nota: Sólo placas de puntuación que tienen suficiente progenie para la evaluación (por lo menos 50), de lo contrario trate de condiciones alternativas de RNAi. Para la evaluación cuantitativa, asegúrese de que las placas no estén contaminadas o crecer OP50 (que interfieren con RNAi).
2. Visualizar animales bajo luz fluorescente, retire la tapa y coloque la placa de ARNi directamente bajo el microscopio de fluorescencia disección.
   Nota: Para detectar sutiles fenotipos intestinales será necesario un microscopio de disección con un accesorio de fluorescencia estéreo potencia superior que permite una gama suficiente de ampliación. Este protocolo describe el uso de un ámbito con un 1.5 y 10 x objetivo y un rango de zoom de 3,5 a 45.
3. Primero encontrar animales bajo una luz brillante para foco. A continuación, examinar los animales bajo luz fluorescente en baja magnificación (por ejemplo, bajo el objetivo de 1,5 x), utilizando el filtro apropiado. Examinar la placa sistemáticamente de izquierda superior a derecha inferior para escanear toda la placa para fenotipos.
4. Seleccionar el animal de interés y cambia al objetivo de 10 x. Centrarse en el intestino y utilizar zoom para evaluar el fenotipo de morfogénesis tubulogenesis/lumen. Vea la sección 5 para puntuación de fenotipos. En primer lugar, tomar imágenes en baja magnificación. Luego cambiar a alto aumento.
   Nota: Puesto que animales sanos moverse rápido, trabajar con rapidez, con una mano en el ratón de la computadora para la adquisición de la imagen mientras se enfoca el microscopio con la otra mano. Disminución de animales (por ejemplo, por la colocación transitoria de las placas a 4 ° C) puede no ser necesario cuando trabajando sobre todo con tubulogenesis fenotipos en embriones y larvas de primeros. Las imágenes puede ser capturadas por una cámara de CCD montado en microscopio y software de captura de la imagen.

4. El intestino de C. elegans a mayor resolución de imagen por láser de barrido confocal de la microscopia ^{34 , 35}

1. inmovilización y montaje
   1. uso punta de los dedos finamente extender una pequeña cantidad de grasa o vaselina en un círculo sobre un portaobjetos de vidrio (~ 6-8 mm de diámetro).
      Nota: Espesor del círculo de grasa es fundamental para el montaje. Para obtener los mejores resultados de la proyección de imagen, la imagen sólo una o varias larvas en un momento y usar un círculo de grasa ultrafino con como poco líquido como sea posible que el animal se pega directamente entre el vidrio portaobjetos y cubreobjetos (si se hace perfectamente, animal va ser inmovilizado sin anestésico). Montaje de huevos y de los animales más viejos requieren un círculo un poco más grueso para evitar la destrucción de la muestra al agregar cubre-objetos.
   2. Añadir una gota de típicamente 3.5 μl de 10 mM solución de azida de sodio en el centro del círculo y recoger gusanos en él con el microscopio de disección.
      Nota: Preparar una solución madre de la azida de sodio de 1 M disolviendo 65,01 mg NaN3 1 ml dH ₂ O; Añadir 200 μL de esta solución de 1 M en 20 mL de tampón de M9. Recoger gusanos rápidamente en la gota de solución de azida de sodio para evitar la solución se seque. Escoger las etapas por separado para montaje óptimo, con el objetivo de cerca de 50 embriones por diapositiva y cerca de 20 larvas al examinar poblaciones más grandes. Uno puede utilizar M9 en lugar de solución de azida de sodio al escoger embriones. Si se usa azida de sodio, los animales deben ser reflejados dentro de 30 minutos para evitar daño a los tejidos de esta sustancia química tóxica.
      PRECAUCIÓN: la azida sódica es tóxica.
   3. Colocar suavemente un cubreobjetos de 22 x 22 mm en diapositiva. Tenga cuidado de no aplastar a los gusanos. Use una presión suave y comprobar bajo disección microscopio para asegurarse de que los gusanos se fijan bien entre portaobjetos y cubreobjetos. Etiqueta de la diapositiva.
      Nota: La cantidad correcta de presión es fundamental para evitar dañar el espécimen (demasiada presión) y no fijar bien (demasiado poca presión: animales flotan en lugar de apegarse a la diapositiva). Animales flotantes esencialmente impiden la proyección de imagen apropiada.
2. Imágenes
   1. diapositiva de lugar al microscopio confocal. Búsqueda de gusanos con 10 x objetivo y enfoque.
      Nota: Use una luz brillante para foco en lo posible evitar el fotoblanqueo.
   2. Cambio x 60 o 100 x objetivo y enfoque en el intestino.
      Nota: El intestino puede identificarse fácilmente bajo luz brillante por la luz corriendo a través del centro del animal, desde la faringe hasta el ano cerca de la punta de la cola. Tenga cuidado al aplicar aceite de 60 x o 100 x aceite objetivo. Mezcla de diferentes tipos de aceites puede interferir con más proyección de imagen. Gota pequeña lugar de aceite sobre la diapositiva cuando se utiliza un microscopio vertical o sobre el objetivo cuando se usa un ámbito invertido, teniendo cuidado de no para contaminar otros objetivos o partes del microscopio de.
   3. Establecer Kohler DIC/Nomarski iluminación para el objetivo de ser utilizado para el escaneo de ³⁶. Inspeccione el animal bajo luz fluorescente con canal para comprobar etiquetado del intestino o para comprobar el fenotipo, con el fin de seleccionar el ejemplar adecuado para la proyección de imagen. Trabajo con rapidez para evitar blanqueo.
   4. Interruptor a exploración para restringir posibles imagen al intestino mediante el establecimiento de límites en su parte dorsal y ventral de la exploración del laser.
      Nota: Sucesión el intestino de esta forma es crítico si el fluoróforo etiquetas también estructuras fuera del intestino. Durante esta exploración piloto, trabajar con condiciones de escaneo rápidas a avOID fotoblanqueo.
   5. Detener la exploración para seleccionar parámetros de digitalización para el experimento. SET 6 20 secciones para análisis intestinal a lo largo del eje z, por ejemplo, intervalos de 0,2 μm, dependiendo de la investigación, etapa del animal o técnicas consideraciones. Establecer marco promedio por imagen dependiendo de la complejidad de las etiquetas y necesaria resolución para reducir el ruido.
      Nota: Los datos de configuración varían dependiendo del microscopio y experimentaran. Uno puede necesitar reducir la cantidad de secciones para evitar blanqueo si se realiza un escaneo secuencial de tres fluoróforos diferentes. Ajustar el número de fotogramas al número de secciones (debe ser menor que el número de secciones para evitar la distorsión de la imagen, también pesan en el aumento de fotoblanqueo). 4-6 marcos son generalmente suficientes.
   6. Volver a la exploración con láser (lento) definitivo las condiciones y ajuste: brillo (ganancia mínima de uso para reducir el fondo); energía (alto posible requiere, como - aumentos photobleaching; generalmente ajuste mínimo es adecuado); agujero de alfiler (apertura si no es necesario, para mantener la resolución).
      Nota: Análisis de las condiciones depende ejemplar y necesario determinar empíricamente el principio de la sesión de escaneado. Asegúrese de que brillo no mayor saturación (limitará capacidad para modificar la imagen posteriormente por software de imágenes). Al establecer las condiciones de exploración, también tener en cuenta que deben utilizarse condiciones idénticas para toda proyección de imagen en experimentos que comparan los animales de experimentación con controles de.
   7. Imagen de captura de la serie. Combinar imágenes en una imagen de proyección solo.
      Nota: Puede tener que guardar imágenes de proyección o recubrimientos por separado dependiendo del microscopio.
   8. Al tomar imágenes de varios canales utiliza exploración secuencial para evitar el repintado entre canales (fundamentales para estudios de colocalización).
      Nota: Ajustes de imagen pueden necesitar cambiarse teniendo en cuenta mayor photobleaching conectarse ya escaneado tiempo.
   9. Siempre adquirir imágenes DIC/Nomarski correspondientes (secciones) de hitos y estado general de la morfología del animal escaneada.

5. Cuantificación de la biogénesis de la membrana polarizada defectos en el intestino de C. elegans

Nota: ejemplo: desplazamiento de Basolateral de ERM-1::GFP apical y formación ectópica de luz lateral inducida por let-767 y APS-1 Arni.

1. Puntuación fenotipos bajo el microscopio de disección ( figura 5 A, D, E)
   1. definir categorías de puntuación. Ejemplo: (i) tipo salvaje (WT), desplazamiento (ii) basolateral de ERM-1::GFP (defecto de polaridad) y (iii) formación de lumen ectópico (que se convierte después de desplazamiento basolateral).
      Nota: Un análisis visual de ampliación baja presta a anotar el número de animales con o sin un fenotipo específico. Aquí, hemos seleccionado un ejemplo de tres categorías fenotípicas cualitativamente diferentes que se encuentran en el mismo indicativo de tiempo de un empeoramiento del fenotipo de polaridad que se analiza. Sin embargo, se anotó una variedad de diferentes fenotipos cuantitativos y cualitativos, tales como diámetro de lumen de luz morfogénesis defectos, ausencia/presencia (o números) de vacuolas citoplásmicas positivo de GFP y tamaño o número de quistes intralumenal (vea < fuerte clase = "xfig" > Figura 3 por ejemplo).
   2. Dependiendo de la magnitud de las diferencias esperadas, puntuación de aproximadamente 100 gusanos vivos en sus placas de agar con el microscopio de disección en un conjunto de experimentos duplicado o triplicado.
      Nota: Se debe anotar cada animal que entra en vista al analizar las placas sistemáticamente, por ejemplo de superior izquierda a inferior derecha de la placa (Asegúrese de gusanos han poblado las placas uniformemente).
   3. Repetir este proceso para 3 sistemas independientes de experimentos. Generar gráfico de barras y evaluar la significación de los resultados.
2. Fenotipos de puntuación bajo el microscopio confocal ( figura 5 B)
   1. definir categorías de puntuación, por ejemplo, número de lúmenes del ectópicos por animal
      Nota: un aumento mayor análisis visual se prestan a anotar un marcador cuantificable o fenotipo por animal y permite la puntuación de marcadores subcelulares, que pueden no ser perceptibles por microscopía de disección. En el ejemplo presente de contar ectópicos lúmenes por animal en un subconjunto de gusanos del mismo experimento previamente evaluados por disección microscopía (5.1.1, categoría 3) refina la evaluación del fenotipo empeoramiento de polaridad que se examina aquí. Sin embargo, una variedad de otros fenotipos o parámetros puede ser anotado, p. ej. número de vesículas, presencia/ausencia o número de componentes subcelulares que co su localización, intensidad de la fluorescencia (este último cuantificado por ImageJ; vea acompañando a papel en la canal excretor) ².
   2. Dependiendo de la magnitud de las diferencias esperadas, cuantificar marcador fenotípico (aquí, ectópicos lúmenes) en aproximadamente 20 animales en un sistema duplicado o triplicado de experimentos bajo el microscopio confocal.
   3. Repetición de 3 conjuntos independientes de experimentos. Generar gráficos de barra y evaluar la significación de los resultados.

Este protocolo describe cómo visualizar morfogénesis biogénesis y lumen de la membrana polarizada en el intestino de C. elegans , a nivel subcelular y celular solo y analizar molecularmente. Las veinte celdas sola capa C. elegans intestino está formado por dirigida la división celular y la migración durante la embriogénesis mediados. En esta membrana polarizada, tiempo establecidos dominios todavía de novo biogénesis de la membrana polarizada continúa en la pero ampliando el epitelio a través de cuatro fases larvarias hasta la edad adulta, lo que permite centrar el análisis en polarizado biogénesis de la membrana (figura 1A).

Para visualizar los componentes celulares y subcelulares C. elegans , se utilizan dos estrategias: inmunofluorescencia (detallada en el presente Protocolo, sección 1; Figura 2 , Figura 4 -F) y la expresión de la fluorescencia de proteínas de fusión (detallada en el documento de acompañamiento en el canal excretor polarizado membrana biogénesis²; Figura 1B, figura 2, figura 4, figura 5). Doble y etiquetado múltiples, combinando diferentes etiquetas de cada uno o los dos métodos, pueden resolver las asimetrías de la membrana tales como apical y dominios de la membrana basolateral y la relación de los distintos componentes subcelulares entre sí (figura 2, Figura 4-E). El vinculador de membrana-citoesqueleto ERM-1::GFP se muestra aquí como un indicador de la biogénesis de la membrana apical que coincide con la morfogénesis de la luz en esta sola capa de epitelio. Mediante el uso de este marcador, una serie de defectos de biogénesis de la membrana apical/al lumen intestinal y sus defectos de gene causativo puede identificarse por estudios de pérdida de función, por ejemplo por las pantallas de todo el genoma imparciales usando RNAi (ARNi enfoques adoptan para la generación de estos fenotipos se describen en la sección 2 del presente Protocolo). Figura 3 y figura 4 muestran ejemplos de imágenes de bajo a moderado aumento de membrana apical/lumen biogénesis fenotipos adquiridos por un disección microscopio de fluorescencia equipado con un objetivo de alta potencia; y de la magnificación mayor imágenes obtenidas por láser confocal de un microscopio (estos enfoques microscópicos se describen en las secciones 3 y 4). Como ejemplo de cuantificación de defectos en biogénesis membrana polarizada, los efectos de ARNi con let-767 (codificación de un esteroide deshidrogenasa/3-ketoacyl-CoA reductase) y aps-1 (codificación de la subunidad sigma de la clatrina AP-1 adaptador) en ERM–1::GFP localización y posicionamiento de lumen se muestran en la figura 5.

Figura 1 : Estructura subcelular y celular y la morfogénesis del tipo salvaje C. elegans intestino. (A) Esquemático del desarrollo intestinal C. elegans , composición celular y endo - y membranas del plasma. El intestino de C. elegans se genera clonalmente de la blastómera E nacido en la etapa de 8 células. Después de cuatro rondas de división celular, su 16 células forma (etapa E16) radialmente simétrico se duplicó capa epitelio¹⁵. En esta etapa el citoplasma de cada célula se polariza, con núcleos a los futuros componentes apicales y citoplásmicos hacia el contrario (futuro basal), dominios de membrana. En un solo paso de intercalación ventrales derecho e izquierdas las células se mueven (en paralelo) en la capa dorsal de la célula para formar el tubo bilateral simétrico de 9 anillos INT. Cada célula se enfrenta y crea la luz con su membrana apical/lumenal (verde; estructural caracterizado por microdominios de membrana específicos, microvellosidades) y contactos los vecinos células o la cavidad del cuerpo con sus membranas basolateral (azul), excepto el primero Anillo INT que está formado por cuatro células. Ensambladuras apicales (rojo) separan los dominios apicales y basolateral de la membrana. Después de la intercalación, biogénesis de la membrana de novo sigue junto con el crecimiento del intestino durante la embriogénesis tardía y las cuatro etapas larvales en la edad adulta, donde un mínimo crecimiento ocurre (fase de mantenimiento de la membrana polarizada ). La única célula ampliada indica el Sistema endomembranoso con ER y Golgi sobre el núcleo (N) y vesículas endosomal. (B) DIC/Nomarski y micrografías confocal superposición del intestino en desarrollo de C. elegans con el marcador de membrana-citoesqueleto apical ERM-1::GFP. El intestino en la fase de coma está contorneado por una línea blanca (ERM-1::GFP ya apenas se expresa en la membrana apical al principio de intercalación pero no puede apreciarse en esta imagen). Animales aquí y debajo son se muestra con la anterior (cabeza) izquierda, posterior (cola) derecha, hasta dorsal, ventral hacia abajo. Barra de escala: 5 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 : Ejemplos de dobles y triples de etiquetado de los países en desarrollo tipo salvaje C. elegans intestino utilizando anticuerpos y proteínas de fusión. (A, B) Embriones. (A) fase de coma. PAR-6::GFP (verde, componente de la polaridad PAR apical compleja), anticuerpo anti-PAR-3 (rojo/TRITC (tetrametil rodamina isotiocianato); otro componente de la polaridad PAR apical compleja) y MH33 (azul/Cy5 (Cyanine5), anti-SIB-2 intermedio filamento). PAR-6::GFP y el anticuerpo de PAR-3 etiqueta de la membrana apical del intestino de C. elegans (entre corchetes). Sib-2, otro marcador apical en etapas posteriores, es panmembraneously localizado en esta primera etapa. PAR-6::GFP y anti-PAR-3 etiqueta también la faringe (izquierda); la luz intestinal está indicada por su solapamiento con IFB-2 (turquesa) y el tubo intestinal se contornea por azul anti-SIB-2 (derecha). (B) etapa 2 veces. AJM-1::GFP (verde; componente de unión), anticuerpos ICB4 (rojo/Alexa, ICB4 detecta un antígeno intestinal membranosa desconocido). AJM-1::GFP etiquetas las ensambladuras apicales del intestino de C. elegans , visible como patrón de la escala peri lumenal (también etiquetas de ensambladuras hypodermal no visible desde la imagen se centra en el intestino; vea la sección 4, proyección de imagen confocal). ICB4 manchas de todas las membranas del intestino de C. elegans . Las flechas señalan las membranas basolateral por anti-ICB4. (C, D) Larvas L2. (C) LET-413::GFP (verde), phalloidin (Texas-rojo, un phallotoxin atando a la F-actina) y MH33 (azul/Cyanine5, anti-SIB-2). LET-413/Scribble es un componente de la polaridad basal compleja y se localiza en las membranas basolateral del intestino de C. elegans (entre corchetes). Phalloidin y el anticuerpo de la Sib-2 etiqueta del citoesqueleto submembraneous apical del intestino de C. elegans (púrpura). Phalloidin también fuertemente las manchas de los músculos de la pared del cuerpo, abrumadora la tinción intestinal. El recuadro muestra el mayor aumento de zona en caja. (E) la larva L3. 1::GFP SLCF (verde; integral membRane transportador de componente/azúcar), ERM-1::mCherry (rojo) y el anticuerpo MH27 (azul/Cyanine5, anti-AJM-1). 1::GFP SLCF etiquetas la membrana basolateral, mientras que ERM-1::mCherry etiquetas la membrana apical del intestino de C. elegans (entre corchetes); AJM-1 etiquetas de sus ensambladuras apicales. (F-F''') Larva L2. (F, F') Imágenes en color individuales. SLCF-1::GFP (verde) etiquetas de la membrana basolateral (membranas laterales indicadas por flechas blancas finas). MH27 ensambladuras apicales (flechas amarillas cortas) de etiquetas (azul/Cyanine5). (F''F''') Superposición de imágenes con y sin actina. Márgenes muestran mayor aumento de áreas en caja. Nota una distinción clara del ángulo apicolateral de células intestinales de estos marcadores de membrana/conexiones diferentes que aparecen superficialmente similares en imágenes de color único (F, F'). Flechas blancas gruesas en F'''punto para el citoesqueleto de actina apical/lumenal etiquetado por phalloidin (de lo contrario abrumado por la actinia del músculo). Todas las imágenes son proyecciones confocales (z-pilas de 0.2 μm), adquiridas por la exploración secuencial para evitar el repintado entre canales. Barras de escala (para A-E, F y F'' ' e inserciones todas): 5 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 : Ejemplos de C. elegans intestinal morfogénesis membrana y luz polarizada los defectos en el aumento de bajas a moderadas (disección micrografías de fluorescencia). Todas las imágenes son adquiridas por un disección microscopio de fluorescencia equipado con un accesorio de alta potencia a la medida de la fluorescencia estéreo (Tabla de materiales). Se muestran diferentes aumentos. Todos los fenotipos se obtuvieron por ARNi con diferentes genes en una cepa con ERM-1::GFP (localizada en las membranas apicales/lumenal canal intestinal y excretor en embrionarios y primeros estadios larvarios, que se muestra aquí). Los fenotipos intestinales lumen y polaridad son: embrión de tipo salvaje (A, B) (A) y larva (B); (C, D) desplazamiento basolateral de ERM-1::GFP; las células intestinales se agrandan y aparece hinchadas en este embrión (C, las flechas apuntan a las células intestinales), pero son de tipo tamaño y arreglo en estas larvas D, puntas de flechas a las membranas laterales entre INT II y III; (E) ampliado y enrevesados lumen en tres embriones; (F) ERM-1::GFP ampliación en área de cruce lateral (zig-zag lumen) y en citoplasma intestinal que contiene vacuolas de GFP-negativo (flechas); (G) quistes lumenal inbetween intralumenal las adherencias (punto flechas a dos quistes). (H) citoplásmicos y basolateral ERM-1::GFP desplazamiento con ectópicos lúmenes (flechas); () ERM-1::GFP desplazamiento a GFP-positivas puncta (flechas) en el citoplasma. Canales excretores y canal excretor fenotipos no se describen aquí (canal se muestra en el intestino de izquierda, a la derecha en todas las imágenes). Barras de escala: 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4 : Ejemplos de C. elegans intestinal polarizado membrana lumen morfogénesis defectos y a mayor aumento (imágenes confocales). (A, C, E, G, I, K) Embriones. (B, D, F, H, J, L) Larvas. Todos los fenotipos se obtuvieron por ARNi con diferentes genes en una cepa con ERM-1::GFP (verde en todas las imágenes). La proyección de imagen se centra en el intestino. Imágenes de embriones también muestran canales excretores (izquierda de la imagen), incluyendo fenotipos de canal (no descritos). (A, B) Embrión de tipo salvaje (A) y larva (B). (C) desplazamiento Basolateral de ERM-1::GFP apical (etapa coma; intercalación finales). (D) conversión de polaridad: desplazamiento basolateral de ERM-1::GFP apical apical acumulación de basolateral ICB4, revelado por doble etiquetado. F-actina (marcada por phalloidin-TRITC) describe los animales por la coloración paquetes de músculo longitudinal (animal es triple etiquetada). (E) desplazamiento Basolateral de ERM-1::GFP tarde 3-fold embrión. El anticuerpo de SIB-2 apical (azul/Cyanine5) indica luz intacta y peri-lumenal filamentos intermedios. (F) ectópico lúmenes por anti-SIB-2 (azul/Cyanine5). (G) ERM-1::GFP negativa vacuolas en citoplasma intestinal. (H) 1::GFP ERM positivas vacuolas en citoplasma intestinal. (I, J) Ausencia de lumen en embriones y larvas, respectivamente. Intestinal amplia (K). Quística (L) y los intestinos enrollados. (A, D, H, I, J, K, L) son proyecciones confocales. (B, C, E, F) secciones confocal. Brillo fue aumentado en G para resaltar vacuolas citoplásmicas de GFP-negativo. Barras de escala: 10 μm (igual para todos los embriones y larvas, respectivamente). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5 : Conversión de polaridad intestinal y reversión: un ejemplo para la cuantificación de los defectos de la biogénesis membrana y luz polarizadas. (A, B, C) Let-767y aps-1RNAi tanto causan desplazamiento basolateral de ERM-1::GFP (BL) y formación ectópica de lumen (EL), pero en diferentes etapas de desarrollo. (A) la cuantificación por microscopio de disección: conteo de embriones (izquierda) y las larvas (derecha) con fenotipos polaridad 2 días después de la siembra de lombrices en las placas de RNAi. Nota: todos los animales mock y let-767(RNAi) han urdido en este momento (así no hay ninguna embriones, que tenían, sin embargo, todos de tipo salvaje de polaridad; rotas columnas de línea). APS-1 Arni induce defectos de polaridad ya en embriones, mientras que dejó-767ARNi les induce en las larvas. El mayor porcentaje de lúmenes ectópicos (vs basolateral desplazamiento) en aps-1ARNi embriones y larvas es debido a la detención de los embriones con ectópicos lúmenes. (B) cuantificación mediante microscopía confocal: recuento de ectópicos lúmenes por animal al inicio del desarrollo de lumen ectópico en larvas. Let-767 Arni induce más ectópicos lúmenes en larvas de aps-1RNAi (aps-1ARNi larvas son "escapers" que tienen no arresTed como embriones). Imágenes confocales (C) para larvas de tipo salvaje y las larvas con ERM-1::GFP basolateral desplazamiento (BL) y ectópicos lúmenes (EL); barra de escala: 5 μm. reversión de polaridad (D, E) en animales de ARNi let-767(conteo de animales con y sin defectos de polaridad [BL/EL] por microscopio de disección). 20 animales de let-767(RNAi) con fenotipos de suave luz ectópico se transfiere de una placa de ARNi a una placa OP50 el día 4 y evaluaron después de 40 horas. (D) más del 50% de larvas ha vuelto a la polaridad de tipo salvaje (ERM-1 en la membrana apical). (E) 20% de animales crecen más allá de la etapa larval L1 (let-767(RNAi) resultados en la detención de la L1). Todos los datos se muestran como media +/-SEM, n = 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Este protocolo describe cómo combinar estándar pérdida de función genética/ARNi y proyección de imagen (Etiquetadoras y microscópicos) enfoques para aprovechar el epitelio intestinal C. elegans como modelo para la disección molecular y visual de en vivo membrana y luz polarizada de la biogénesis.

Etiquetado

Este protocolo se centra en anticuerpos. In situ el etiquetado por los anticuerpos es una alternativa altamente específica al etiquetado por fusión fluorescente proteínas (descritas en el documento de acompañamiento en la biogénesis de la membrana del canal excretor)². Aunque los anticuerpos no permite la proyección de imagen vivo, puede proporcionar confirmación para la localización de una proteína de interés (ni método de etiquetado es sin falta). Por otra parte, preguntas relacionadas con la morfogénesis y la localización subcelular de una proteína a menudo pueden ser evaluadas en los animales fijos. Inmunotinción es útil para doble y etiquetado múltiples y pueden combinarse con el etiquetado por las proteínas fluorescentes de fusión si éstos pueden ser conservados a través de los procedimientos de fijación y permeabilización requeridos. El protocolo se describe aquí permite normalmente (figura 2). In situ de etiquetado de los animales fijos por anticuerpos o tintes químicos también puede proporcionar ventajas de superresolución técnicas microscópicas como la tormenta (microscopia óptica estocástica de la reconstrucción). La inmunofluorescencia detecta el antígeno endógeno y puede ser adaptada, por ejemplo, para distinguir modificaciones específicas de proteína posttranslational. Puede producir resultados rápidos si los anticuerpos están disponibles, una vez en situ técnicas de tinción - no como sencillo en C. elegans se han establecido las muestras como en cultivo celular.

La generación de un nuevo anticuerpo (no descrita aquí), sin embargo, es mucho tiempo. Desafortunadamente, la selección de comercios C. elegans anticuerpos primarios sigue siendo algo pequeño, y no todos son capaces de detectar el antígeno en situ (ver cuadro 1 para ejemplos de anticuerpos demostraron a detectar antígenos intestinales en situy tabla 3 recursos adicionales). La mayoría anticuerpos generados contra los antígenos vertebrados no se cruz-reaccionan con sus homólogos de C. elegans . La selección de anticuerpos secundarias debe tener en cuenta la especie del primer anticuerpo (discutido en general inmunofluorescencia protocolos^27,28). Grandes selecciones están comercialmente disponibles con tintes fluorescentes (e.g. Alexa Fluor tintes) la mejora continua. Optimizada la coloración, tintes pueden ser seleccionados por su capacidad para que coincida con el microscopio utilizado para la proyección de imagen, por ejemplo, el láser del microscopio confocal, o, si super resolución microscopia se planea también, por su capacidad de "parpadear"³⁷. Las manchas directamente etiquetados anticuerpos primarios o química (por ejemplo etiquetado fluorescente phalloidin) también están disponibles y son particularmente útiles para la doble tinción.

La dificultad para el anticuerpo en situ de coloración en C. elegans es la impermeabilidad de la cáscara de huevo del embrión y la cutícula de la larva, adulto que ambos requieren la interrupción química o mecánica para permitir el acceso del anticuerpo a los tejidos. Aunque se han desarrollado protocolos de tinción de anticuerpo líquido complejo para superar este problema^27,28, la mayoría incluyen colagenasa para la permeabilización, que tiende a dañar el tejido de la blanco. En contraste, el método de congelación-crack descrito aquí es una forma sencilla de abrir las cutículas o cáscaras de huevo de la lombriz. Se realiza directamente sobre el vidrio diapositiva donde se recogen las muestras (y donde también se realiza el resto de la mancha), y funciona particularmente bien para huevos y larvas que se adhieren mejor a portaobjetos de vidrio (es decir, los escenarios examinados predominante en estudios de tubulogenesis). Además no interfiere con la preservación de proteínas de fusión fluoróforo. La técnica requiere cierta destreza manual, como la presión correcta sobre el cubreobjetos (antes del parpadeo) y la evitación de la presión de corte son críticos para la preservación de la muestra (como un manejo suave y uso durante todo el procedimiento de tinción).

Condiciones de fijación deba ser empíricamente determinado y ajustado para el antígeno estructura que debe teñirse (discutido en el²⁷). Más leves (por ejemplo basados en formaldehído) técnicas de fijación pueden conservar mejor antigenicidad, aunque esto debe equilibrarse con la necesidad de mantener la morfología del tejido, crítica para el análisis de la morfogénesis. Fijación más suave las condiciones también ayuda a preservar las proteínas fluorescentes de fusión en los experimentos de etiquetado doble. Del mismo modo, la cantidad de bloqueo de agente (por ejemplo leche o albúmina sérica bovina y la BSA) y detergente en la solución de lavado requiere un ajuste empírico a fondo con la tinción específica del balance. Información sobre aspectos generales de las técnicas de inmunofluorescencia, por ejemplo, discusión de diferentes técnicas de tinción, diseño de los controles adecuados y consejos para la optimización de estos procedimientos para intestinos de gusano (por ejemplo, reduciendo al mínimo intestinal Autofluorescencia) puede encontrarse en general y protocolos de inmunofluorescencia específica de C. elegans , como referencia a lo largo.

Interferencia con la función genética y evaluación de los fenotipos tubulogenesis

Este protocolo pone de relieve los enfoques específicos de RNAi que son útiles al evaluar genes con funciones de primera, esenciales y omnipresentes, cuya pérdida parcial (más completa) es más informativo, como es el caso para la mayoría de los genes tubulogenesis (nuestro genoma pantalla en ERM-1::GFP-intestinos etiquetados sugirieron que interferencia con tales causas de genes > 90% de todos los fenotipos de tubulogenesis informativo en esta particular configuración¹²). Las ventajas que ofrece C. elegans para manipulaciones genéticas (p. ej. su tiempo de generación corto) y los diferentes enfoques que perturban la función del gene por adelante (a partir del función/del fenotipo) y atrás (a partir de la enfoques genéticos gen) se discuten en el general C. elegans literatura^31,38. La disponibilidad de ARNi de genoma comercialmente disponible alimentación bibliotecas también permite usar esta técnica genética como una herramienta de cribado genético hacia adelante (véase Tabla de materiales de recursos). Las ventajas específicas de RNAi para el análisis de tubulogenesis incluyen su capacidad de: generar una variedad de fenotipos equivalentes a una serie alélica mutante (esto generalmente funciona bien para genes de morfogénesis dependiente de la dosis); para extraer ARN maternal (normalmente involucrados en la morfogénesis temprana/tubulogenesis); etapa-específicamente interferir (útil para la evaluación de efectos en la biogénesis de la membrana polarizada durante el crecimiento larval postmitotic).

Información sobre aspectos generales de los procedimientos de ARNi se discute en refs (^26,s = "xref" > 31). Clave para el análisis de los fenotipos tubulogenesis letal es la capacidad para modular las condiciones de RNAi para aumentar el espectro de fenotipos. Fenotipos de tubulogenesis informativo generalmente se pueden generar en un fondo de tipo salvaje sin necesidad de intestino específico RNAi cepas³⁹. Sin embargo, estas cepas son disponible si este falla y también pueden utilizarse para distinguir células autónomas de efectos no autónomos. Se han reportado diferentes enfoques para modular la fuerza de ARNi, por ejemplo, la valoración de las concentraciones de IPTG para la inducción de dsRNA, un enfoque que puede producir los resultados más reproducibles³⁰. Sin embargo, cuantitativamente exacta valoración puede no ser necesario cuando con el objetivo de generar un espectro de fenotipos diferentes. En general, el éxito de este análisis no depende tanto maximizar el efecto de RNAi en determinar condiciones de RNAi que generan un espectro informativo de fenotipos (que a menudo puede ser el resultado de subóptima (e.g. más leves) ARNi condiciones).

Para la evaluación visual de los fenotipos tubulogenesis inducida por ARNi es importante determinar la ventana óptima para la evaluación fenotípica. Lo mejor es empezar evaluando las placas temprano (por ejemplo, dos días después de escoger los animales a sus placas de ARNi en condiciones estándar de RNAi) y seguirlos durante tiempo suficiente para posibles efectos finales. Por ejemplo, un curso de tiempo de desarrollo de un defecto de polaridad empeoramiento, debe cubrir 3-7 días en larvas típicamente arrestadas. Condiciones para el análisis de la biogénesis de la membrana polarizada en postmitotic células no se dividen del intestino larval pueden mejorarse aún más al utilizar mutantes o ARNi animales con enlentecimiento del crecimiento (como, por ejemplo, let-767(RNAi) o mutantes animales ¹², figura 5). Cualquier curso de tiempo debe interrumpirse si aparecen animales F2 (puede quitar L4s en experimentos donde detener a la mayoría pero no todos los animales como las larvas). Cada experimento requiere la evaluación concomitante de adecuados controles positivos y negativos (e.g. bacteriano ARNi clones que inducir un fenotipo definido tubulogenesis y vaciar el vector o revuelto ARNi de clones, respectivamente). Otro requisito para la evaluación es un tamaño cría suficiente (mínimo 50). Si no se cumplen, otras condiciones (e.g. condicional) RNAi pueden ser juzgados. Por último, algunos fenotipos de tubulogenesis particularmente interesantes ocurren en la baja penetrancia, por lo tanto un número suficiente de animales debe ser evaluado.

Microscopia

Ampliación de baja a moderada disección microscopía fluorescente y microscopía confocal de alta magnificación, los dos procedimientos de proyección de imagen estándar descritos aquí, son por lo general suficiente para caracterizar los aspectos básicos de un tubo o lumen fenotipo en la C.elegans intestino y puede emplearse a visualmente conjuntos más grandes de animales en las pantallas hacia delanteras de la pantalla. Permite la disección microscopía de fluorescencia: en vivo la proyección de imagen de los animales en sus placas (sin embargo, animales vivos, inmovilizados transitoriamente por anestésicos, también pueden ser recuperados de monturas después de confocal o proyección de imagen de DIC); cribado de grandes grupos de animales; eventos desarrollo de seguimiento (por ejemplo, el desplazamiento y reemplazo de un marcador polarizado durante la expansión de la membrana); seguimiento de patrones de expresión concreta (algunos patrones y asimetrías mejor se distinguen aumento inferior); selección y recolección gusanos fluorescentes adecuados para su posterior análisis (por ejemplo microscopia confocal) o para el mantenimiento de los transgenes extracromosómicos. Visualización en gran aumento por microscopia confocal permite caracterizar el fenotipo a nivel subcelular y celular único. Este protocolo describe la proyección de imagen con un láser de barrido confocal microscopio que ofrece el mejor confocality sobre alternativas tales como un microscopio confocal de disco giratorio. Un microscopio confocal de disco giratorio es, sin embargo, el microscopio de elección para estudios dinámicos y lapso de tiempo ya que induce menos fototoxicidad (ver refs (^34,35) para la discusión adicional de la alta y baja magnificación microscopia en la C. elegans). Novela así como las técnicas microscópicas convencionales ofrecen ventajas adicionales y permitan la proyección de imagen en mayor resolución en la gama de escala nanométrica (por ejemplo, transmisión electrónica y súper resolución microscopía; discutido en^{37, 40}).

Cuando los intestinos de C. elegans en un microscopio confocal de imágenes, montaje y la inmovilización es fundamental. Entre los diferentes productos químicos para la inmovilización, azida de sodio - aunque tóxico - trabajos más confiablemente si la exploración se realiza inmediatamente. Levamisole, aunque no tóxica, produce hypercontraction que a veces interfiere con la evaluación de fenotipos de morfogénesis. Algunos anestésicos pueden interferir con proteínas fluorescentes asociada a la membrana y pueden producir artefactos que pueden verse como defectos de polaridad. C. elegans es un espécimen de espesor y análisis 3D (seccionamiento) es esencial para tomar ventaja de la fuerza específica del epitelio intestinal tubular que permite excelente visualización de cruces apicales y la membrana lateral (no fácilmente accesible en epitelio plano). Configuración confocal debe ajustarse para que cada diapositiva y el objetivo de obtener imágenes de buena calidad, incluyendo parámetros como la sucesión, con un promedio de, energía del laser, aumento, agujero de alfiler y brillo. Un problema particular de la proyección de imagen intestinal es contenido de este órgano de gránulos autofluorescent verde/amarillo (lisosoma relacionadas con organelos (LROs)) que pueden interferir con la interpretación de los resultados, particularmente al evaluar desplazamiento de GFP marcado componentes asociados de endo - y -membrana plasmática. Este problema es bien reconocida en el campo y puede abordarse por diferentes enfoques (dependiendo del microscopio), incluyendo scanner empírico ajustes^13,41, huella espectral y exclusión DAPI.

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Agradecemos a Mario de Bono (MRC laboratorio de Biología Molecular, Cambridge, Reino Unido), Kenneth J. Kemphues (Cornell University, Ithaca, Estados Unidos), Michel Labouesse (Institut de Biologie Paris Seine, Université Pierre et Marie Curie, París, Francia), Grégoire Michaux (Université deRennes 1, Rennes, Francia) y el CGC, financiado por los NIH oficina de programas de infraestructura de investigación (P40 OD010440), para las cepas y los anticuerpos. Este trabajo fue financiado por subvenciones NIH GM078653, MGH es 224570 223809 SAA a V.G.