الأمعاء C. ايليجانس "كنموذج" ل Morphogenesis التجويف بين الخلايا و في فيفو الاستقطاب نشوء غشاء حيوي على مستوى الخلايا المفردة: وضع العلامات تلطيخ جسم والخسارة [رني] من وظيفة تحليل وتصوير

شفافية يمكن الأمعاء C. ايليجانس بمثابة "في فيفو أنسجة دائرة" لدراسة أبيكوباسال الغشاء والتجويف نشوء حيوي على مستوى خلية واحدة وسوبسيلولار أثناء توبولوجينيسيس متعددة الخلايا. هذا البروتوكول يصف كيفية الجمع بين العلامات القياسية والوراثية فقدان لوظيفة [رني/] والنهج المجهري تشريح هذه العمليات على مستوى جزيئي.

أنابيب متعددة الخلايا، والوحدات الأساسية للأجهزة الداخلية كلها، تتكون من الخلايا الظهارية أو بطانية الاستقطاب، مع قمي أغشية بطانة الأغشية التجويف و basolateral الاتصال ببعضها البعض و/أو المصفوفة خارج الخلية. كيف عدم التكافؤ هذا الغشاء مميزة هو إنشاء وصيانة خلال morphogenesis الجهاز لا تزال دون حل مسألة بيولوجيا الخلية. ويصف هذا البروتوكول الأمعاء C. ايليجانس كنموذج لتحليل نشوء الاستقطاب غشاء حيوي خلال أنبوب morphogenesis، مع التركيز على نشوء حيوي الغشاء والتجويف قمي. يتم ترتيب C. ايليجانس العشرين خلايا ظهارة الأمعاء الطبقات واحدة في أنبوب متناظرة ثنائيا بسيطة، تسمح بتحليل على مستوى خلية واحدة. يحدث استقطاب الغشاء متزامنا مع انقسام الخلية الاستقطاب والهجرة خلال embryogenesis مبكرا، ولكن حيثياته الاستقطاب نشوء غشاء حيوي لا تزال في جميع أنحاء نمو اليرقات، عند الخلايا لم تعد تتكاثر ونقل. الإعداد الأخير يسمح أحد لفصل سوبسيلولار التغييرات التي تتوسط هذه العمليات الاستقطاب مختلفة، صعوبة التمييز في معظم الأقطاب نماذج في وقت واحد. قمي، باسولاتيرال الغشاء-، هالة-، سيتوسكيليتال-ويمكن المسمى اندوميمبراني المكونات وتتبعها البروتينات فيوجن التجارة والنقل في جميع أنحاء تطوير أو تقييم في الموقع تلطيخ جسم. جنبا إلى جنب مع التنوع الوراثي للكائن، الأمعاء C. ايليجانس مما يوفر نموذجا فريداً في فيفو للمرئي، والإنمائية والتحليل الوراثي الجزيئي لغشاء الاستقطاب ونشوء حيوي أنبوب. وتشمل أساليب محددة (جميع القياسية) الموصوفة هنا كيفية: تسمية مكونات سوبسيلولار المعوية تلطيخ جسم؛ تحليل الجينات المعنية في نشوء الاستقطاب غشاء حيوي حسب دراسات فقدان لوظيفة تكييف الجينات توبولوجينيسيس عادة ضرورية؛ تقييم العيوب القطبية خلال مراحل النمو المختلفة؛ تفسير تعمل ابيفلوريسسينسي والتدخل التفاضلية التباين (DIC) والفحص المجهري [كنفوكل]؛ التحديد الكمي للعيوب البصرية. هذا البروتوكول يمكن تكييفها لتحليل أي من الجزيئات حفظت كثيرا المشاركة في قطبية الظهارية، ونشوء غشاء حيوي، morphogenesis الأنبوبة والتجويف.

الجيل الاختلالات الخلوية وسوبسيلولار، مثل تشكيل المجالات غشاء الاستقطاب، أهمية حاسمة في morphogenesis والوظيفة ل الخلايا والأنسجة والأعضاء¹. دراسات بشأن نشوء الاستقطاب غشاء حيوي في epithelia تبقى تحديا تقنيا، نظراً للتغييرات الاتجاه في توزيع مكونات سوبسيلولار تعتمد على متعددة متتالية وتزامنت خارج الخلية وداخل الخلية الإشارات التي من الصعب فصل في معظم النماذج وتعتمد بشدة على النظام النموذجي. النموذج المعروضة هنا-مفردة الطبقات الأمعاء ايليجانس كاينورهابديتيس -نسيج بساطة الرائعة. جنبا إلى جنب مع خلية واحدة قناة C. ايليجانس مطرح (انظر المصاحبة للورق في نشوء الاستقطاب غشاء حيوي في القناة مطرح C. ايليجانس )²، فإنه يوفر العديد من المزايا الفريدة لتحديد هوية و توصيف الجزيئات اللازمة لنشوء الاستقطاب غشاء حيوي. حفظ العظة الأقطاب الجزيئية من الخميرة لرجل جعل هذا الجهاز اللافقارية بسيطة ممتازة "في فيفو الأنسجة الدائرة" لمعالجة مسائل على قطبية الظهارية التي ذات صلة مباشرة بالنظام البشري، الذي لا يزال بعيد مجمع للسماح بتشريح المرئية لهذه الأحداث في الواحد الخلية المستوى في فيفو.

على الرغم من أن كانت متعددة الأقطاب المصانة العظة من مصفوفة اكستراسيلوار (1)، (2) غشاء البلازما وتقاطعات والاتجار حويصلية (3) داخل الخلايا المحددة³، المبادئ الأساسية لإدماجها في عملية نشوء حيوي الأغشية والأنسجة الظهارية الاستقطاب هو غير مفهومة⁴. نماذج خلية واحدة الكلاسيكية في فيفو (e.g.S. cerevisiae واقحه C. ايليجانس ) حددت الحرجة وكان لها دور أساسي في تحديد مبادئ انقسام الخلية الاستقطاب والاستقطاب الأمامي الخلفي قطبية المرتبطة بغشاء المحددات (جتباسيس/مركز السيطرة على الأمراض-42 الصغيرة، بارس معيبة التقسيم)^5،6، ولكنها تعتمد على التماثل الفريد كسر العظة (ندبة برعم، دخول الحيوانات المنوية) وتفتقر إلى المضمون مفرق المجالات غشاء أبيكوباسال، ويفترض أن أبيكوباسال داخل الخلايا المناظرة الفرز الآلية. معرفتنا الحالية المنظمة للاتجار بالاستقطاب في ابيثيليا، ولكن أساسا يعتمد على الزراعات الأحادية الثدييات في 2D⁷، التي تفتقر إلى الرموز خارج الخلية وإنمائية الفسيولوجية التي يمكن تغيير مواقف غشاء مجالات واتجاهات مسارات الاتجار (بتبديل من 2D إلى 3D في المختبر نظم الثقافة وحدها تكفي لعكس قطبية الغشاء في الخلايا مدكك (مدين-داربي الكلي الناب))⁸. في فيفو الدراسات الإنمائية في قطبية الظهارية في الكائنات اللافقارية نموذج أجريت في البداية في شقة ابيثيليا، على سبيل المثال في البشرة melanogaster المورفولوجية ، حيث أنها حددت مساهمة حاسمة من مفرق ديناميات الهجرة الخلية الاستقطاب وخلية ورقة حركة⁹، والاتجار بالأشخاص اندوسيتيك للأقطاب صيانة¹⁰. 3D في المختبر و في فيفو تحليل morphogenesis التجويف في epithelia أنبوبي في الخلايا مدكك والأمعاء C. ايليجانس ، حددت على التوالي، مؤخرا شرط الاتجار داخل الخلايا دي نوفو المجال (قمي) ونشوء حيوي التجويف وتحديد المواقع^11،،من¹²¹³. السمك من أنبوبي (مقابل مسطحة) الخلايا الظهارية ميزة لتحليل أوجه عدم التماثل سوبسيلولار 3D نظراً لأنه يسمح بتمييز بصرية متفوقة من غشاء قمي لومينال، وتقاطعات أبيكو الجانبية، والغشاء الجانبي، مواقف العضيات داخل الخلية. لهذه المزايا البصرية، يضيف الطراز C. ايليجانس فيفو في الإعداد والمحور التنموي، الشفافية والبساطة في خطة الهيئة، خلية ثابتة ومحددة بالنسب، التحليلي (الجينية) والمزايا الإضافية المبينة أدناه.

C. ايليجانس نفسها هي الدودة هيكل أنبوبي الشفافية والهندسة المعمارية البسيطة التي جعل أجهزتها الداخلية وبالمثل أنبوبي يمكن الوصول مباشرة إلى تحليل البصرية morphogenesis الأنبوبة والتجويف. العشرين خلايا الأمعاء (الخلايا 21 أو 22 في بعض الأحيان) في¹⁴ مشتقة من خلية واحدة السلف (ه) ووضع من ظهارة مزدوج الطبقات الالكترود خطوة واحدة، في أنبوب متناظرة ثنائيا من تسع حلقات INT (أربع خلايا في الحلقة الأولى؛ 1 الشكل التخطيطي)^14،،من¹⁵¹⁶. وقدم تحليل النسب والأنسجة في الأمعاء، يحدد في البداية البصريات نومارسكي عبر الهويات النووية¹⁷وفي وقت لاحق مجهرية الأسفار عبر أغشية المسمى، الحرجة ثاقبة في morphogenesis، في خاصة متطلبات خلية مستقلة والخلية غير ذاتية لاتجاهي خلية الانقسامات وحركات (مثلاً، الالكترود، عدم التماثل اليمين واليسار، وتناوب الأنبوب الأمامي والخلفي)^14،18 . مواصفات الخلية اندوديرمال المبكر وشبكة تنظيمية الجينات السيطرة على تطوير هذا الجهاز النموذجي الاستنساخ هي كذلك تتسم^19،20. هنا، ومع ذلك، ينصب التركيز على تحليل الغشاء الاستقطاب ونشوء حيوي التجويف في خلايا أنبوبية واحدة، والتباينات داخل الخلايا اندوميمبرانيس وبني سيتوسكيليتال والعضيات التي تصاحب هذه العملية. تيسير التحليل ببساطة هذا الأنبوب، حيث تواجه جميع الأغشية قمي (على مستوى ultrastructural الموقر قبل زغيبات) التجويف وتواجه جميع الأغشية القاعدية على سطح الأنبوب الخارجي، مع الأغشية الجانبية الاتصال ببعضها البعض، يفصل غشاء قمي بالوصلات (1 الشكل التخطيطي؛ وانظر المراجع (²¹من^16،) C. ايليجانس-منظمة معينة من ضيق ومكونات مفرق أدهيرينس). ومن ثم نشوء حيوي غشاء قمي المصادف morphogenesis التجويف. وعلاوة على ذلك، تقريب حجم الخلايا المعوية الكبار-الخلايا أكبر من هذه الحيوانات الصغيرة (باستثناء الخلية مطرح)-حجم خلية الثدييات، سمحت في فيفو البصرية تتبع العناصر سوبسيلولار، مثل حاول مسارات حويصلة، الذي عادة في المختبر في صحن ثقافة.

غرض هذا التحليل الخلوي وسوبسيلولار، وضع العلامات المناسبة أمر بالغ الأهمية. غشاء إندو أو البلازما المعوية المجالات، تقاطعات، سيتوسكيليتاليمكن تصور الهياكل ونوى وغيرها العضيات سوبسيلولار بوصفها مكوناتها الجزيئية المحددة. العديد من مكونات هذه تميزت ولا تزال تكتشف (الجدول 1 أمثلة قليلة ويشير إلى الموارد). على سبيل المثال، كانت جزيئات مختلفة التمييز بين المقصورات أنبوبي و/أو حويصلية من النظام اندوميمبراني المعوية، ولائحة غولجي عبر حويصلات غولجي وظيفة لغشاء البلازما، حددت²². المحددة البروتينات (فضلا عن الدهون والسكريات) يمكن أما أن المسمى مباشرة أو غير مباشرة عن طريق ربط البروتينات. ويركز هذا البروتوكول في الموقع الضد تلطيخ عينات ثابت، واحد من اثنين من تقنيات وضع العلامات القياسية (انظر الورقة المرفقة على توبولوجينيسيس قناة مطرح لوصف تقنية أخرى² - في فيفو وسم عن طريق اندماج بروتين فلوري-الذي يطبق مباشرة إلى الأمعاء؛ الجدول 2 يقدم أمثلة من المروجين الأمعاء الخاصة التي يمكن استخدامها لمحرك التعبير عن هذه البروتينات الانصهار للامعاء). مزدوجة أو متعددة العلامات مع أي نهج أو بمزيج من كلا زائد إضافية الكيميائية تلطيخ، يسمح القرار البصرية متعمقة أكبر ودراسة التغيرات المكانية والزمانية في التعريب المشارك وتوظيف محددة الجزيئات أو مكونات سوبسيلولار (الشكل 2). تثبيت البرنامج وتلطيخ الإجراءات الموضحة في الحفاظ على دعم البروتوكول هذا البروتين الفلورية الخضراء (بروتينات فلورية خضراء) وسم أثناء إجراءات إيمونوستينينج. للتصوير، مفتاح النقاط للكشف عن ووصف وصف توبولوجينيسيس تعمل عن طريق الإجراءات القياسية مجهرية (الأسفار [كنفوكل] وتشريح مجهرية) (، منالشكل 3 4). ويمكن تمديد هذه بدقة أعلى التصوير النهج، لمثيل سوبيريسولوشن المجهري وانتقال الميكروسكوب الإلكتروني (غير المذكورة هنا).

أن نقطة قوة رئيسية لهذا النظام هو القدرة على تحليل الأقطاب في الخلايا الفردية في مراحل إنمائية مختلفة، من امبريوجينيسيس من خلال مرحلة البلوغ. على سبيل المثال، يمكن تتبع نشوء حيوي المجال والتجويف غشاء قمي طوال التنمية على مستوى خلية واحدة عن طريق وضع العلامات مع إدارة مخاطر المؤسسات-1، رابط عاليا يحافظ غشاء-أكتين Ezrin-راديكسين-موسين الأسرة^23،24 . 1-إدارة مخاطر المؤسسات يتصور غشاء قمي نشوء حيوي (1) خلال أنبوب الجنينية morphogenesis، عندما يحدث متزامنا مع انقسام الخلية الاستقطاب والهجرة (نقل الخلايا من حولها التجويف خلال الالكترود)¹⁵؛ (2) خلال أواخر تمديد أنبوب الجنينية واليرقات التي تشرع في غياب انقسام الخلية أو الهجرة؛ و (3) في الأمعاء الكبار، حيث يتم الاحتفاظ بمجالات استقطاب غشاء (الشكل 1). في ظهارة اليرقات بعد الانقسامية الآخذة في التوسع، نوفو دي استقطاب الغشاء وبالتالي يمكن فصل نشوء حيوي من الأنسجة الاستقطاب morphogenesis، وغير ممكن في معظم النماذج قطبية الظهارية في الجسم الحي وفي المختبر ، بما في ذلك مع القرار خلية واحدة (مثل 3D مدكك كيسه نموذج⁸). مع وضع العلامات للمكونات الأخرى، يوفر هذا الإعداد الفرصة (لا سيما في المرحلة L1 اليرقات عندما يكون أعلى نسبة السيتوبلازم/نواة الخلايا) لتمييز تلك التغييرات داخل الخلايا الخاصة باستقطاب الغشاء نشوء حيوي ( مثل إعادة توجيه مسارات الاتجار) من تلك المطلوبة في الوقت ذاته لانقسام الخلية الاستقطاب والهجرة.

براعة الوراثية C. ايليجانس معروف²⁵ويجعل من نظام نموذج قوية للتحليل الجزيئي لأي مسألة بيولوجية. دراسة بشأن morphogenesis، على سبيل المثال، يمكن أن تبدأ مع سلالة البرية من نوع، سلالة محوره وراثيا حيث يسمى هيكل مصلحة (مثل غشاء) مع علامة مضيئة أو بخسارة أو الربح-من-وظيفة متحولة مع وجود خلل في هذا الهيكل. دراسة وراثية عكس نموذجية قد تولد متحولة حيث يتم حذف الجينات للفائدة في germline (مثلاً قبل حذف مستهدفة)، تعديل بواسطة الطفرات (عادة ما تنتج الطفرات مع ما يترتب عليه من خسائر أو الحد من مكاسب في الدالة من الجينات)، أو حيث ينخفض نسخة من [رني]. السهولة [رني] عن طريق تغذية في C. ايليجانس²⁶ كما يفسح لتصميم شاشات المستهدفة التي تدرس مجموعة أكبر من الجينات للفائدة. يمكن القول أن أعظم قوة كائن الطراز الوراثي هي القدرة على إجراء في فيفو الأمام شاشات (مثل الطفرات، شاشات [رني] منتظمة أو على نطاق الجينوم) التي تسمح بتحقيق غير منحازة في سبب الجزيئية النمط الظاهري الفائدة. على سبيل المثال، البصرية غير متحيزة [رني] C. ايليجانس توبولوجينيسيس الشاشة، بدءاً الحيوانات المحورة وراثيا مع إدارة مخاطر المؤسسات-1-المسمى الأغشية قمي، اكتشفت فضول قطبية المعوية عكسها التحويل والنمط الظاهري التجويف حمل خارج الرحم، تستخدم هنا كمثال لهذا النوع من التحليل. هذه الشاشة تحديد استنفاد جليكوسفينجوليبيدس (جسلس؛ الدهون غشاء تلزم، حددت عن طريق هذه الإنزيمات GLS-السكروز) ومكونات كلاثرين معطف حويصلة وبه محول AP-1 كالعيوب الجزيئية المحددة تسبب هذه الأقطاب وبذلك تميز هذه الاتجار الجزيئات في فيفو العظة تحويل النمط الظاهري، قطبية غشاء قمي والتجويف^12،13لتحديد المواقع. عندما بدءاً النمط الظاهري الطفرات وراثية محددة/morphogenesis، مثل شاشات (أو تجارب التفاعل الوراثية/[رني] مرة واحدة) يمكن أيضا دراسة التفاعلات الوظيفية بين اثنين أو متعددة الجينات للفائدة (انظر المصاحبة للورقة على مطرح قناة للحصول على مثال لمثل هذا التحليل)². ويركز هذا البروتوكول على [رني] الذي، بالإضافة إلى قدرتها على تحديد الجينات الخسارة التي يتسبب النمط الظاهري في الشاشات إلى الأمام، مباشرة ويوفر مزايا محددة لتحليل morphogenesis. منذ منتجات الجينات توجيه morphogenesis غالباً ما تعمل بطريقة تعتمد على الجرعة، عادة ما تكون ناجحة في توليد طائفة تعمل [رني]. القدرة على توليد المعلومات فقدان جزئي للدالة تعمل كما يساعد على معالجة هذه المشكلة أن غالبية الجينات توبولوجينيسيس مهمة ضرورية وأن خسائرهم تسبب العقم والفتك الجنينية المبكرة. هذا البروتوكول يتضمن الشرطي [رني] استراتيجيات للتغلب على هذه الصعوبة ويقترح سبلاً لتحسين توليد طائفة أوسع من تعمل، مثل سلسلة الاليلي الطفرات التي تنتجها.

1. وسم الأمعاء C. ايليجانس

ملاحظة: انظر الورقة المرفقة بالكتاب على تحليل قناة مطرح توبولوجينيسيس ² لبناء الأنسجة محددة علامة نيون البلازميدات وتوليد الحيوانات المحورة وراثيا، بما في ذلك المناقشات بشأن البروتينات الانصهار النسخي ومتعدية الجنسيات (الأخيرة اللازمة لتوطين سوبسيلولار جزيء فائدة). يمكن تكييف هذه الإجراءات باستخدام المروجين محددة لدفع جزيء الفائدة إلى الأمعاء. انظر الجدول 1 للاطلاع على أمثلة للجزيئات التي أثبتت أنها مفيدة لتصور C. ايليجانس المعوية إندو-والأغشية البلازمية وتلك الوصلات، الجدول 2 للحصول على أمثلة من المروجين لقيادة التعبير للامعاء، و الجدول 3 للموارد لمجموعة أكثر شمولاً من علامات المعوية والمروجين.

1. جسم تلطيخ الأمعاء C. ايليجانس ²⁸
   1. 1. من التثبيت تأخذ شريحة زجاجية نظيفة واستخدام بولي-L-يسين إلى إنشاء طبقة رقيقة للديدان عصا على. مكان 30 ميليلتر 0.1-0.2 % بولي-L-يسين على الشريحة ومكان شريحة ثانية في إسقاط بولي-L-يسين جعل " ساندويتش ". ثم فرك الشرائح بلطف عدة مرات الرطب السطوح كاملة على حد سواء والسماح لهم بالهواء الجاف للحد الأدنى 30 تسمية الجانب متجمد الشرائح مع قلم رصاص.
         ملاحظة: أدلى مختبرين بولي-L-يسين 0.2% من 200 ميليلتر إذابة المسحوق في dH ₂ س؛ ويمكن تخزين هذا في-20 درجة مئوية. استخدام الوزن الجزيئي عالية بولي-L-يسين لتحسين الالتصاق من الديدان. كما أن تركيز بولي-L-يسين أمر بالغ الأهمية. بتركيزات منخفضة جداً لن تسمح للديدان عصا ولكن تركيزات مرتفعة جداً قد تولد الإشارات الخلفية الفلورية. فيلم سميكة جداً قد تخفف حتى في مجملها-
      2. ضع كتلة مسطحة معدنية بشدة على الجزء السفلي من الحاوية (مثل حاوية البوليستيرين) مملوءة بالنيتروجين السائل-
         ملاحظة: يمكن للمرء استخدام الثلج الجاف بدلاً من ذلك، لكن النتروجين السائل وتبقى كتلة معدنية أكثر استقرارا في أسفل الحاوية وقشعريرة جيدا.
      3. جمع الديدان أما غسلها قبالة اللوحات مع M9 ²⁹ أو اختيار ديدان مرحلة مختلفة (أما بيض، L1، L2، L3، أو L4 مرحلة اليرقات الديدان) على كل شريحة. وبشكل نموذجي, بيك ~ 100 اليرقات والأجنة أو الكبار ~ 20 لكل شريحة. المكان 10 ميليلتر غسله الديدان إلى منتصف الشريحة أو التقاط البيض/الديدان إلى 10 ميليلتر M9 أو 10 1 x ميليلتر برنامج تلفزيوني ²⁷ (الفوسفات مخزنة المالحة).
         1. استخدام ماصة انتشرت إعداد كبيرة من الديدان لتجنب التثاقل.
            ملاحظة: مختلطة السكان من غسله الديدان، بسبب الازدحام ومختلف سمك مراحل، لا عصا جيدا، وهي أقل فعالية تجميد--متصدع (انظر أدناه)، ولذلك الانتقاء الخاصة بمرحلة الديدان (أو السكان متزامنة) يعطي نتائج متفوقة. يرقات العصا أفضل من الكبار وأكثر الحيوانات يمكن أن توضع على كل شريحة.
         2. قبل الانتقاء الديدان إلى شرائح، ونقلها إلى لوحة متوسطة النمو ديدان أسطوانية (NGM) ²⁹ دون البكتيريا OP50. يمكن أن تتداخل ملتصقة البكتيريا الزائدة للديدان أيضا مع الخلاف. العناية بأن الديدان لم تجف.
      4. بلطف مكان (إسقاط) 22 مم × 22 مم ساترة عبر طرق على رأس جمع الديدان مثل هذا أن حوافها يخيم على جانب واحد على الأقل من الشريحة. اضغط إلى أسفل بلطف لكن قوة مع واحد أو اثنين من أصابع ساترة. تجنب إمالة التي سوف تضر بسلامة الأنسجة.
      5. فورا ولطف نقل الشريحة إلى كتلة معدنية في النتروجين السائل والسماح لها الجلوس لمدة حوالي 5 دقائق لتجميد. ثم " نفض الغبار قبالة " ساترة في سويفت أحد التحرك باستخدام حافة المتدلية.
         ملاحظة: هذه الخطوة يجب أن يتم حسم وحين يتم تجميد الشريحة لتحقيق " تكسير " لبشرة. تنبيه: يرجى اتباع المبادئ التوجيهية معدات الوقاية الشخصية (معدات الوقاية الشخصية) عند العمل مع النيتروجين السائل-
      6. تزج الشرائح تجميد متصدع في الميثانول-شغل الزجاج كوبلين جرة لمدة 5 دقائق في-20 درجة مئوية. ثم نقل إلى الأسيتون-شغل الزجاج كوبلين جرة لآخر 5 دقائق في-20 درجة مئوية.
         ملاحظة: يجب تخزين والميثانول والاسيتون في-20 درجة مئوية على الأقل 30 دقيقة قبل الاستخدام. بعد التثبيت، يمكن تخزين الشرائح في-20 ° "تنبيه جيم": والميثانول والاسيتون ومواد سامة.
      7. إزالة الشرائح من جرة والسماح لهم بالهواء الجاف في درجة حرارة الغرفة (RT) قبل استخدام.
   2. ستينينج
      1. تطويق منطقة ديدان الثابتة مع طبقة رقيقة من الفازلين على الشريحة. رسم دائرة حول هذا المجال على الجانب السفلي الشريحة للاحتفال البقعة.
         ملاحظة: من الأهمية بمكان أن دائرة جيلي لا تزال سليمة طوال فترة الإجراءات المصبوغة لمنع تسرب الحلول المصبوغة.
      2. إعداد " الرطب الدائرة " في حاوية بلاستيكية مع غطاء بوضع الرطب المناشف الورقية في ذلك. ضع الشريحة على حامل في هذا " الدائرة الرطب " لمنع تجفيف الشرائح أثناء تلطيخ.
         ملاحظة: لا ينبغي أن تكون الشرائح عند اتصالها بالماء أو مع بعضها البعض.
      3. بلطف "الماصة؛" حوالي 50 ميليلتر 1 x برنامج تلفزيوني في جيلي دائرة، ما يكفي لتغطية المنطقة. الوثيق " الدائرة الرطب " مع الغطاء. تبني على RT للحد الأدنى 5
         ملاحظة: لتجنب فقدان الديدان في هذه الخطوة، لا "الماصة؛" برنامج تلفزيوني مباشرة على الديدان. بلطف ضع تلميح ماصة على حافة الدائرة وتسمح للسائل سلاسة تنثر فوق الديدان.
      4. إمالة الشريحة ونضح ببطء في برنامج تلفزيوني مع ماصة. ضع الشريحة شقة مرة أخرى على الرف وإضافة 50 ميليلتر (أو المبلغ المطلوب لتغطية المكان) عرقلة الحل بعناية. احتضان هذا في قاعة الرطب في RT لمدة 15 دقيقة. بينما كان ينتظر، تضعف الأجسام المضادة الأساسي في عرقلة الحل (انظر الجدول للمواد للحصول على أمثلة من الأجسام المضادة الأولية وتركيزات).
         ملاحظة: إعداد طازجة حل حظر استخدام برنامج تلفزيوني 1 x (10 مل)، 10% توين (50 ميليلتر) والحليب المجفف (0.2 g). قد تختلف تبعاً للأجسام المضادة المستخدمة الكمية من المنظفات وتركيز الحليب وقد تحتاج إلى أن تحدد تجريبيا. الطموح للسوائل من الشريحة خطوة أخرى تفقد الديدان بسهولة. التحقق من التقدم عن طريق فحص الشريحة تحت نطاق تشريح، ولكن الحرص على أن الشريحة لم تجف.
      5. إمالة الشريحة ونضح بعيداً من عرقلة الحل، باستخدام نفس الاحتياطات كما هو موضح أعلاه. ضع شريحة مسطحة مرة أخرى على الرف وإضافة 50 ميليلتر المخفف الابتدائي الأجسام المضادة، باستخدام نفس الاحتياطات ببطء. الوثيق " الدائرة الرطب " واحتضان في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها أو لفترات أقصر في الرايت
         ملاحظة: قد تحتاج وقت الحضانة يتحدد تجريبيا لجسم معين.
      6. Aspirate قبالة حل جسم الأولية كما فعلت للحلول الأخرى. ثم يغسل الشرائح مع حل حظر لمدة 10 دقائق، 3 مرات، إضافة وإزالة الحل بنفس الطريقة كما هو موضح أعلاه.
      7. إضافة جسم الثانوي (فلوريسسينتلي-المسمى) مخففة في عرقلة الحل، احتضان على RT ح 1. انظر الجدول للمواد للحصول على أمثلة من الأجسام المضادة الثانوية وتركيزات.
      8. إزالة الأجسام المضادة الثانوية والمياه والصرف الصحي، كما ذكر أعلاه، ومع عرقلة الحل 2 مرات، وإلغاء إيقاف حظر الحل، مع برنامج تلفزيوني 1 x، لمدة 10 دقائق في كل.
      9. نضح بعيداً من برنامج تلفزيوني قدر ممكن دون السماح بالعينة تجف وإزالة الهلام حول العينة بعناية.
      10. إضافة قطره واحدة متوسطة المتصاعدة على العينة، و ضع ساترة لطف على أعلى. ختم حواف ساترة مع طلاء الأظافر. ضع الشرائح في مربع شريحة الظلام للحفاظ على تلطيخ وتخزينها في 4 ° C.
          ملاحظة: تبقى الشرائح في الظلام بسبب حساسية للضوء (الفلورية قد تتلاشى مع مرور الوقت)، ومنع التعرض للهواء بإبقائها مغلقة، لنفس السبب. قد يتم تخزين الشرائح لفترات طويلة من الزمن في 4 درجات مئوية أو-20 درجة مئوية.

2. التدخل مع وظيفة الجينات الأساسية توبولوجينيسيس في الأمعاء C. ايليجانس. على سبيل المثال: [رني].

ملاحظة: تستزرع سلالات C. ايليجانس على البكتيريا OP50 المصنف على لوحات NGM وفقا للبروتوكولات القياسية ²⁹. ل [رني], C. ايليجانس تتغذى على HT115 البكتيريا [رني] على [رني] لوحات وتستكمل مع 25 ميكروغرام/مل كاربينيسيلين و 2 مم إيبتج (الأيزوبروبيل بيتا-د-1-ثيوجالاكتوبيرانوسيدي) لتحريض المروج البكتيرية التي تولد ضعف الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي (dsRNA) من أدخلت C. ايليجانس الجينات. المضادات الحيوية وتركيز إيبتج قد تختلف وفقا [رني] استنساخ/مكتبة والمطلوب [رني] قوة, [رني] محددة يمكن الحصول على الحيوانات المستنسخة من المتاحة تجارياً على نطاق الجينوم [رني] تغذية المكتبات (انظر ( ^{26 ،} التركيب. ^{30 ، 31}) لمعلومات أساسية عن تغذية [رني] في C. ايليجانس و جدول المواد للمواد/الكواشف والمكتبات [رني]).

1. 1. [رني] القياسية عن طريق تغذية ^{26 ، 31} إخراج لوحة المكتبة [رني] من-80 درجة مئوية ووضعها على الثلج الجاف. إزالة الشريط الختم واستخدام تلميح ماصة معقمة لنقل البكتيريا ملتصقة من استنساخ فائدة إلى لوحات أجار رطل (مرق لوريا) ²⁹ وتستكمل مع 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين والتتراسيكلين 15 ميكروغرام/مل. متواصلة من البكتيريا على لوح أجار. إغلاق لوحة المكتبة [رني] مع شريط ختم جديد. تنمو هذه البكتيريا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن تخزين هذه اللوحات أجار في 4 درجات مئوية لعدة أسابيع. بكتيريا جديدة يمكن أن تكون مثقف مباشرة منها لحماية المكتبة [رني] الأصلي-
   2. في اليوم التالي، تطعيم البكتيريا [رني] من لوحة أجار رطل في 1 مل رطل السائلة المتوسطة ²⁹ التي تحتوي على 50 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين كل ويهز 14 ح (8-18) أو بين ليلة وضحاها في 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: لتحقيق أفضل النتائج استخدام بكتيريا جديدة في كل مرة. انظر المرجع ( ³⁰) لمقارنة شروط ثقافة مختلفة (مثل توقيت الثقافة)-
   3. التالي اليوم، بذور 200 ميليلتر كل استنساخ للبكتيريا [رني] مثقف على ألواح [رني] مستقلة. تمكنك اللوحات الجاف وترك في الرايت بين عشية وضحاها لتحريض المروج البكتيرية.
   4. نقل اليرقات L4-المرحلة 4-6 على كل لوح [رني]. احتضان اللوحات [رني] المبذورة في الرايت أو 22 درجة مئوية لمدة 3-5 أيام-
      ملاحظة: اختيار اليرقات L4 الأولى على صفيحة NGM دون البكتيريا لإزالة تمسكا OP50 التي تتداخل مع [رني]، أو تسلسلياً نقلها إلى لوحة NGM جديدة دون OP50 ثلاث مرات. تأكد من سلالات غير ملوثة، كما البكتيريا تلويث-مثل الغذاء OP50 المفضل للديدان-سوف تتدخل أيضا مع [رني]. ضبط درجة الحرارة حسب الحاجة: مثل التنمية تتسارع مع ارتفاع درجة الحرارة؛ سلالات قد تكون درجة الحرارة الحساسة.
   5. للدراسات الإنمائية، تحقق تعمل ذرية F1 من اليوم فصاعدا 2-
      ملاحظة: من المهم للتحقق من الحيوانات كثيرا لتجنب فقدان المظهر أو التقدم النمط الظاهري (مثل علامة التشرد) عند تقييم نشوء الاستقطاب غشاء حيوي أثناء التطوير. تخصيب السكان F2 لتعمل قوي (مثلاً بانتقاء المنحرفين الأصل للوحة [رني] جديدة في اليوم الثاني لتحديد الأكثر متأثرة بشدة جزء متوسط من ذرياتهم) نادراً ما يلزم، منذ طائفة من معتدلة إلى قوية تعمل أمر مرغوب فيه.
2. الشرطي [رني]
   ملاحظة: يمكن تعديل شروط [رني] لتقليل الالتهاب، أو زيادة تأثيرات خفيفة، أو للتدخل في مرحلة التحديد؛ وتعديلات مفيدة لتقييم كامل للآثار المظهرية غالباً ما جينات توبولوجينيسيس الفتاكة.
   1. من آثار اليرقات [رني]-تقييم [رني] في الجيل نفسه (معتدل، والخاصة بمرحلة [رني])
      ملاحظة: للتغلب على العقم أو الفتك الجنينية، أو لتعطيل وظيفة الجينات في embryogenesis بعد مرحلة معينة، هو فعل [رني] في مرحلة ما بعد اليرقات، شأن. أما وضع البيض غير المعالجة (2.2.1.1)، جرابيد الكبار (2.2.1.2) أو مزامنة L1 (أو، إذا رغبت في ذلك، في وقت لاحق المرحلة) اليرقات (2.2.1.3) على ألواح [رني]؛ تقييم الآثار [رني] في الجيل نفسه، مثلاً يومين في وقت لاحق وما بعدة، في اليرقات و/أو البالغين. الكبار gravid
      1. بيك 30-50 واحد قطره تبيض الحل (حل 1:4 من 10 M هيدروكسيد الصوديوم والأسر المعيشية تحت كلوريت الصوديوم) وضعت على حافة صفيحة [رني]. اسمحوا جافة والسماح L1s لفتحه والانتقال إلى الحديقة البكتيرية.
         ملاحظة: تبيض الحل، تستخدم عادة لإزالة التلوث، سوف تقتل كل شيء ولكن الأجنة في قشرة البيض على. ولذلك، لا تضع الحل تبيض على أو بالقرب من البكتيريا [رني].
      2. بيك أو البذور ~ 20 الشباب جرافيد على لوحة [رني] وتتيح لهم وضع البيض ح 2-3، أو حتى هناك حوالي 300 البيض على اللوحة، ثم اختيار إيقاف الكبار-
         ملاحظة: هذا الأسلوب قد يسبب التلوث بالبكتريا [رني] من OP50. للحد من هذه المخاطر، أولاً نقل الكبار على صفيحة NGM دون البكتيريا لإزالة OP50 ملتصقة بالديدان. العناية بأن البالغين لا تبقى طويلاً على ألواح [رني] لتجنب تأثير [رني] في الأجنة-
      3. بيك أو وضع الديدان المرحلة L1 مباشرة على لوحات [رني] (انظر المرجع ( ²⁹)-لبروتوكولات المزامنة).
         ملاحظة: يمكن للمرء استخدام بروتوكولا مزامنة مختصر (مثلاً لمجموعة كبيرة متوسطة حجم) بغسل الديدان من لوحات مكتظة بالسكان مع M9 لعدة مرات حتى تبقى البيض فقط. بعد 2-3 ح الفقس L1s يمكن ثم جمعها في M9 من هذه اللوحات، تنظيف بواسطة يغسل إضافية لإزالة البكتيريا (x 3 في M9)، والمصنف على لوحات [رني].
   2. البكتيريا تمييع [رني] مع متجه فارغة [رني] البكتيريا (معتدل [رني])
      ملاحظة: تخفيض مبلغ قدرة دسرنا بإضعاف كمية البكتيريا [رني] قد يكفي لحمل تأثيرات أكثر اعتدالا وقد يقلل أيضا من فتك جنينية دون إلغاء جميع آثار الجنينية. كما يستخدم إضعاف البكتيريا [رني] مزدوجة [رني] تجارب وأن تيتراتي الظروف للتجارب الجينية التفاعل (مثلاً لتوليد تأثيرات خفيفة للتقييم لتعزيز وآثار قوية للتقييم لقمع).
      1. تنمو حتى [رني] وطب الطوارئpty ناقل البكتيريا HT115 [رني] في المتوسط 1 مل رطل مع 50 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين، كما فعلت للشروط القياسية [رني].
      2. تضعف البكتيريا [رني] مع متجه فارغة [رني] البكتيريا لتحقيق طائفة من تركيزات مختلفة، على سبيل المثال، من 5%، 15%، 30%، 50%، 70%. مزيج من البكتيريا جيدا من قبل بيبيتينج صعودا وهبوطاً. "الماصة؛" 200 ميليلتر مختلطة البكتيريا على صفيحة [رني].
      3. بيك 4-6 L4 اليرقات في كل لوح [رني]. التحقق من النمط الظاهري من اليوم فصاعدا 2-
   3. [رني] سلالات حساسة (قوية [رني])
      1. استخدام سلالات حساسة [رني] المتاحة، على سبيل المثال، eri-1 (mg366)، قوة الرد السريع-3 (pk1426) أو 15 لين باء eri-1 (mg366) (n744) (سوبيرسينسيتيفي الأخيرة)، ومتابعة معيار [رني] الإجراءات الموضحة في 2.1 ^{31 ، ،} من ^{32 33}-
         ملاحظة: قد يكون انخفاض أحجام أمهات من الحيوانات البرية من نوع [رني] سلالات حساسة (مثل قوة الرد السريع-3 وعيري-1) وتكون عقيمة عند 25 درجة مئوية. قد تكون لديهم أيضا خلفية منخفضة لتعمل الخاصة، مثل تدني الفتك الجنينية الاختراق، التي يجب أن تؤخذ في الاعتبار عند تقييم آثار [رني] محددة.

3. في فيفو تصوير الأمعاء C. ايليجانس بالأسفار تشريح مجهرية

1. قبل تصور الحيوانات تحت الضوء الفلورية، تحقق من لوحات [رني] تحت الضوء الساطع على أي مجهر تشريح. تقييم (ويحتمل أن تسجل) تعمل مرئية تحت الضوء الساطع قد تؤثر على التحليل، مثل القدرة على الفتك، العقم (عدد أقل من ذرية)، الإنمائية (مثل اليرقات القبض) وأخرى تعمل المرئية التي قد تساعد توصيف وظيفة الجينات المشتركة في morphogenesis نشوء حيوي والتجويف غشاء المستقطبة.
   ملاحظة: لوحات نقاط فقط أن يكون ذرية كافية للتقييم (على الأقل 50)، خلاف ذلك محاولة البديلة [رني] شروط. التقييم الكمي للتأكد من أن لوحات غير ملوثة أو تنمو OP50 (التي تتداخل مع [رني]).
إزالة الغطاء
2. لتصور الحيوانات تحت ضوء الفلورسنت، ووضع اللوحة [رني] مباشرة تحت المجهر fluorescence تشريح.
   ملاحظة: للكشف عن تعمل الأمعاء الدقيقة واحد سوف تحتاج مجهر تشريح مع مرفق fluorescence ستيريو سلطة العليا التي تسمح لمجموعة كافية من التكبير. ويصف هذا البروتوكول استخدام نطاق مع 1.5 و 10 × هدف ونطاق تكبير من 3.5 إلى 45-
3. أولاً أن تجد الحيوانات تحت الضوء الساطع للتركيز. بعد ذلك، فحص الحيوانات تحت ضوء الفلورسنت تكبير منخفضة (مثل إطار هدف 1.5 x)، باستخدام عامل التصفية المناسب. دراسة اللوحة بشكل منهجي من أعلى اليسار إلى أسفل اليمين المسح الضوئي لوحة كاملة لتعمل-
حدد الحيوان لمصلحة
4. وتغيير هدف x 10. التركيز على الأمعاء واستخدام التكبير/التصغير لتقييم توبولوجينيسيس/التجويف morphogenesis النمط الظاهري. انظر القسم 5 للتهديف لتعمل. أولاً، أن الصور في تضخم منخفض. قم بالتبديل إلى تضخم عالية.
   ملاحظة: نظراً لصحة الحيوانات تتحرك بسرعة، العمل سريعاً، مع جهة واحدة على فأرة الكمبيوتر للحصول على الصور في حين تركز المجهر باليد الأخرى. تباطؤ الحيوانات (مثلاً بوضع عابر من الألواح إلى 4 درجات مئوية) قد لا تكون مطلوبة عند العمل مع توبولوجينيسيس تعمل في الغالب القبض على الأجنة واليرقات المبكر. الصور يمكن التقاطها بواسطة كاميرا محمولة على مجهر مكافحة التصحر وبرامج التقاط الصور-

4. تصوير الأمعاء C. ايليجانس دقة أعلى بالليزر الفحص المجهري [كنفوكل] ^{34 ، 35}

1. التركيب والتثبيت
   1. الاستخدام الإصبع لنشر رقيقة كمية صغيرة من الشحوم أو هلام البترول في دائرة على شريحة زجاج (~ 6-8 ملم في القطر)-
      ملاحظة: سمك الدائرة الشحوم أمر بالغ الأهمية للتركيب. للتصوير نتائج أفضل، صورة يرقات واحدة أو عدة في وقت واحد واستخدام دائرة سامسونج الشحوم مع كسائل قليلاً ممكن أن الحيوان مباشرة عالق بين الشرائح الزجاجية وكشف الغطاء (إذا فعلت تماما، الحيوان سوف تكون معطلة دون مخدر). المتصاعدة من البيض ومن كبار السن الحيوانات تتطلب دائرة سمكا نوعا ما لتجنب تدمير العينة عند إضافة كشف الغطاء-
   2. إضافة قطره من عادة 3.5 ملم 10 ميليلتر الحل أزيد الصوديوم في منتصف الدائرة وانتقاء الديدان إلى أنه تحت مجهر تشريح.
      ملاحظة: إعداد حل أسهم أزيد صوديوم 1 م بتذويب ملغ 65.01 NaN3 في 1 مل dH ₂ س؛ إضافة 200 ميليلتر لهذا الحل م 1 إلى 20 مل M9 المخزن المؤقت. اختيار الديدان سريعاً إلى إفلات حل أزيد الصوديوم لتجنب حل لتجف. اختر المراحل على حدة للتركيب الأمثل، ترمي الأجنة حوالي 50 كل الشرائح واليرقات حوالي 20 عند النظر في عدد أكبر من السكان. يمكن للمرء استخدام M9 بدلاً من حل أزيد الصوديوم عند اختيار الأجنة. في حالة استخدام أزيد الصوديوم، يجب تصويرها الحيوانات داخل 30 دقيقة لتجنب تلف الأنسجة من هذه المادة الكيميائية السامة.
      تنبيه: أزيد الصوديوم السامة.
   3. بلطف ضع ساترة 22 مم × 22 مم على الشريحة. كن حذراً لا لسحق الديدان. استخدام الضغط الخفيف والاختيار تحت تشريح المجهر للتأكد من أن يتم إصلاحها الديدان جيدا بين الشرائح وكشف الغطاء. تسمية الشريحة.
      ملاحظة: المبلغ الصحيح للضغط ضروري لتجنب إتلاف العينة (الكثير من الضغط) وعدم تحديد ذلك جيدا (الضغط القليل جداً: تعويم الحيوانات بدلاً من التمسك بالشريحة). الحيوانات العائمة أساسا يمنع تصوير المناسبة.
2. التصوير
   1. مكان الشريحة تحت المجهر [كنفوكل]. البحث عن الديدان مع 10 × الهدف والتركيز-
      ملاحظة: استخدام الضوء الساطع إلى تركيز حيثما أمكن لتجنب فوتوبليتشينج.
   2. تغير إلى 60 x أو 100 x والهدف والتركيز على الأمعاء.
      ملاحظة: الأمعاء يمكن بسهولة تحديد تحت الضوء الساطع في التجويف يمر عبر منتصف الحيوان، ومن البلعوم إلى فتحه الشرج قرب غيض الذيل. كن حذراً عند تطبيق النفط ل 60 x أو 100 x النفط الهدف. خلط أنواع مختلفة من الزيوت قد تتداخل مع مواصلة التصوير. مكان قطره صغيرة من النفط على الشريحة عند استخدام مجهر تستقيم أو على الهدف عند استخدام نطاق مقلوب، مع الحرص على عدم تلويث أهداف أخرى أو أجزاء المجهر.
   3. الإضاءة إنشاء كولر DIC/نومارسكي للهدف لاستخدامها لمسح ³⁶. فحص الحيوانات تحت ضوء الفلورسنت مع قناة مناسبة للتحقق من وضع العلامات من الأمعاء و/أو للتحقق من النمط الظاهري، من أجل اختيار عينة مناسبة للتصوير. العمل سريعاً لتجنب تبيض.
   4. رمز التبديل ليزر المسح الضوئي لتقييد الصورة المرتقبة للامعاء بإعداد مسح الحدود على الجانب الظهري والبطني.
      ملاحظة: أقواس الأمعاء بهذه الطريقة أمر بالغ الأهمية إذا fluorophore تسميات أيضا هياكل خارج الأمعاء. وخلال هذا المسح التجريبي، العمل مع شروط المسح السريع للمركباتفوتوبليتشينج oid.
   5. إيقاف المسح الضوئي لتحديد معلمات المسح الضوئي للتجربة. تعيين الأقسام 6-20 لفحص الأمعاء على طول المحور z, مثلاً على 0.2 ميكرون فترات، اعتماداً على التحقيق، ومرحلة اعتبارات الفنية و/أو الحيوانية. تعيين الإطار المتوسط كل صورة حسب تعقيد وضع العلامات ويطلب القرار الحد من الضوضاء.
      ملاحظة: إعداد التفاصيل تختلف تبعاً للمجهر والتجربة. قد يحتاج المرء لتقليل كمية الأبواب لتجنب تبيض في حالة إجراء المسح الضوئي متسلسلة من ثلاثة فلوروفوريس مختلفة. ضبط عدد الإطارات إلى عدد من الأقسام (يجب أن يكون أقل من عدد المقاطع لتجنب تشويه الصورة؛ وتزن أيضا في الزيادة في فوتوبليتشينج). 4-6 إطارات تكفي عادة.
   6. العودة إلى المسح الضوئي بالليزر (بطيء) نهائي المسح شروط وضبط: السطوع (استخدام كسب الحد الأدنى للحد من الخلفية)؛ الليزر الطاقة (أعلى مستوى ممكن المطلوبة، منخفضة-فوتوبليتشينج الزيادات؛ وعادة ما تكون إعداد الحد الأدنى كافية)؛ الثقب (تجنب فتح لم يكن المطلوب، للحفاظ على القرار)-
      ملاحظة: مسح الأحوال تعتمد على العينات وتحتاج إلى يتحدد تجريبيا في بداية الدورة المسح الضوئي. تأكد من أن سطوع لا تتعدى تشبع (سوف يحد من القدرة على تعديل الصورة في وقت لاحق عن طريق برامج التصوير). عند إعداد مسح الظروف، تنظر أيضا أن ظروف مماثلة يجب أن تستخدم لتصوير جميع التجارب التي تقارن بين الحيوانات التجريبية مع عناصر التحكم.
   7. التقاط صورة سلسلة. دمج الصور في صورة واحدة إسقاط.
      ملاحظة: قد يكون لحفظ صور العرض و/أو التراكبات على حدة تبعاً للمجهر.
   8. عندما أخذ الصور المتعددة القنوات استخدام المسح الضوئي متسلسلة لتجنب التسييل خلال بين القنوات (الحرجة لدراسات الترجمة المشارك).
      ملاحظة: إعدادات الصورة قد تحتاج إلى تغيير نظراً لزيادة فوتوبليتشينج متصلاً لم يعد المسح الضوئي الوقت.
   9. دائماً الحصول على الصور المقابلة DIC/نومارسكي (مقاطع) لمعالم والحالة العامة مورفولوجية الحيوان الممسوحة ضوئياً.

5. التحديد الكمي لنشوء الاستقطاب غشاء حيوي العيوب في الأمعاء C. ايليجانس

ملاحظة: مثال: التشريد Basolateral 1::GFP ERM قمي وتشكيل التجويف الأفقي حمل خارج الرحم الناجمة عن ترك-767 و وكالة الأنباء الجزائرية-1 [رني].

1. تعمل تحت مجهر تشريح ( الشكل 5 أ، د، ه) وسجل
   1. تعريف فئات للتهديف. على سبيل المثال: (ط) البرية من نوع (WT)، (ثانيا) basolateral تشريد ERM-1::GFP (عيب قطبية)، و (ثالثا) من تشكيل التجويف حمل خارج الرحم (يتطور بعد التشرد باسولاتيرال)-
      ملاحظة: إجراء تحليل بصرية تكبير منخفض يفسح المجال لسجل إعداد الحيوانات مع أو بدون النمط الظاهري معينة. وهنا اخترنا مثال على ثلاث فئات المظهرية مختلفة نوعيا والتي في نفس الوقت الإرشادي من تدهور النمط الظاهري الأقطاب التي يتم تحليلها. ومع ذلك، يمكن أن سجل متنوعة تعمل مختلف نوعيا وكمياً، مثل التجويف morphogenesis العيوب أو غياب/حضور (أو أرقام) للتجارة والنقل vacuoles هيولى إيجابية، التجويف قطر وحجم أو عدد الخراجات إينترالومينال (انظر < فئة قوية = "إكسفيج" > الشكل 3 للحصول على أمثلة).
   2. نقاط اعتماداً على حجم الخلافات المتوقعة، حوالي 100 من الديدان يعيش على لوحات أجار تحت مجهر تشريح في مجموعة مكررة أو ثلاث من التجارب-
      ملاحظة: واحد يجب أن يسجل كل الحيوانات التي تأتي إلى طريقة العرض عند مسح اللوحات بصورة منتظمة، مثلاً من أعلى اليسار إلى أسفل اليمين اللوحة (تأكد من الديدان قد نشر لوحات بالتساوي).
   3. كرر ذلك 3 مجموعات مستقلة من التجارب. إنشاء رسم بياني شريطي وتقييم أهمية النتائج.
2. وسجل تعمل تحت المجهر [كنفوكل] ( الشكل 5 ب)
   1. تحديد فئات للتهديف، مثل عدد لومن حمل خارج الرحم للحيوان الواحد
      ملاحظة: تكبير أعلى التحليل المرئي يفسح المجال للتهديف علامة قابلة للقياس أو النمط الظاهري للحيوان الواحد ويسمح التسجيل من علامات سوبسيلولار التي قد لا تكون ملحوظة بتشريح مجهرية. مثال هذا العد لومن خارج الرحم كل الحيوانات في مجموعة فرعية ديدان بنفس التجربة سابقا بتشريح مجهرية (5.1.1، الفئة 3) تقييم تهذب تقييم النمط الظاهري قطبية المتفاقمة التي يتم دراستها هنا. بيد متنوعة تعمل أو معلمات أخرى يمكن أن يكون سجل، مثلاً عدد من الحويصلات أو وجود/غياب عدد من مكونات سوبسيلولار التي شارك ترجمة، كثافة الأسفار (كمياً الأخير قبل إيماجيج؛ انظر المصاحبة للورقة على قناة مطرح) ²-
   2. تبعاً لحجم الخلافات المتوقعة، تحديد العلامة المظهرية (هنا، لومن خارج الرحم) في حوالي 20 من الحيوانات في مجموعة مكررة أو ثلاث من التجارب تحت المجهر [كنفوكل]-
   3. تكرار ل 3 مجموعات مستقلة من التجارب. إنشاء شريط الرسوم البيانية وتقييم أهمية النتائج.

هذا البروتوكول توضح كيفية تحليل جزيئيا وتصور morphogenesis نشوء حيوي والتجويف غشاء الاستقطاب في الأمعاء C. ايليجانس ، على مستوى سوبسيلولار وخلية مفردة. الطبقات أحادية الخلية العشرين C. ايليجانس الأمعاء تتكون من انقسام الخلايا الموجهة والهجرة خلال منتصف embryogenesis. في هذا الغشاء الوقت، مستقطبة المجالات أصبحت راسخة، ولكن حيثياته نشوء الاستقطاب غشاء حيوي يستمر النضج غير توسيع ظهارة في أربع مراحل اليرقات حتى سن البلوغ، مما يسمح بالتركيز التحليل على الاستقطاب غشاء نشوء حيوي (الشكل 1A).

تصور C. ايليجانس المكونات الخلوية وسوبسيلولار، ويشيع استخدام استراتيجيتين: الفلورة (مفصلة في هذا البروتوكول، القسم 1؛ الشكل 2 , الشكل 4 -F) والتعبير عن البروتينات الانصهار الفلورية (بالتفصيل في الورقة المرفقة على قناة مطرح استقطاب الغشاء نشوء حيوي²؛ الشكل 1B، الرقم 2، الرقم 4، الشكل 5). مزدوج ووسم متعددة، الجمع بين تسميات مختلفة من أساليب كل أو كليهما، يمكن حل التباينات الغشاء مثل قمي المجالات غشاء باسولاتيرال، والعلاقة بين مختلف مكونات سوبسيلولار إلى بعضها البعض (الشكل 2، الشكل 4-E). يظهر رابط سيتوسكيليتون غشاء ERM 1::GFP هنا كمؤشر لنشوء حيوي غشاء قمي الذي يتزامن مع morphogenesis التجويف في ظهارة هذه الطبقات واحدة. باستخدام هذه العلامة، صفيف من غشاء قمي المعوية/التجويف نشوء حيوي العيوب وبها عيوب الجينات المسببة يمكن تحديد الدراسات خسارة للدالة، على سبيل المثال بغير منحازة على نطاق الجينوم شاشات استخدام [رني] ([رني] النهج المعتمد يرد وصف جيل من هذا القبيل تعمل في القسم 2 من هذا البروتوكول). رقم 3 و رقم 4 تظهر أمثلة الصور التكبير منخفضة إلى متوسطة من غشاء قمي/التجويف تعمل نشوء حيوي المكتسبة بتشريح مجهر الأسفار مزودة طاقة عالية وهدف؛ ومن أعلى التكبير مسح الصور التي حصل عليها ليزر [كنفوكل] مجهر (يرد وصف هذه النهج المجهرية في البابين 3 و 4). كمثال للتحديد الكمي للغشاء الاستقطاب نشوء حيوي العيوب، الآثار [رني] مع السماح-767 (الترميز ستيرويد نازعة/3-كيتواسيل-اختزال) و وكالة الأنباء الجزائرية-1 (ترميز فرعية سيغما من كلاثرين AP-1 محول) في إدارة مخاطر المؤسسات–1::GFP التعريب وموضع التجويف مبينة في الشكل 5.

الرقم 1 : البنية الخلوية وسوبسيلولار و morphogenesis البرية من النوع C. ايليجانس الأمعاء. (A) التخطيطي C. ايليجانس المعوية التنمية وتكوين الهاتف الخلوي، واندو-والأغشية البلازمية. يتم إنشاء الأمعاء C. ايليجانس كلونالي من بلاستوميري ه ولد في مرحلة 8 خلايا. بعد أربع جولات من انقسام الخلايا، الخلايا، 16 (المرحلة E16) شكل متناظرة شعاعيا ظهارة مضاعفة الطبقات¹⁵. في هذه المرحلة نمطين السيتوبلازم من كل خلية، مع نويات الانتقال إلى مكونات قمي، وهيولي المستقبل تتحرك صوب عكس ذلك (المستقبل القاعدية)، المجالات الغشاء. في خطوة واحدة الالكترود نقل الخلايا اليسار واليمين البطني (بالتوازي) في طبقة الخلايا الظهرية لتشكيل أنبوب متناظرة ثنائيا من 9 حلقات INT. يواجه كل خلية ويبني التجويف مع لها غشاء قمي/لومينال (أخضر؛ الموقر هيكلياً بغشاء معين ميكرودومينس، زغيبات) والاتصالات المجاورة للخلايا أو تجويف الجسم مع بالأغشية باسولاتيرال (الأزرق)، ما عدا الأولى خاتم الباحث الذي يتكون من أربع خلايا. فصل تقاطعات قمي (أحمر) المجالات غشاء قمي وباسولاتيرال. بعد الالكترود، نشوء حيثياته غشاء حيوي مستمر جنبا إلى جنب مع نمو الأمعاء خلال أواخر امبريوجينيسيس وأربع مراحل اليرقات في مرحلة البلوغ، حيث يحدث النمو زيادة الحد الأدنى فقط (مرحلة الصيانة غشاء الاستقطاب ). خلية مفردة مكبرة تشير إلى النظام اندوميمبراني مع ER وغولجي أعلاه نواة (ن) وحويصلات اندوسومال. (ب) DIC/نومارسكي وميكروجرافس [كنفوكل] تداخل الأمعاء C. ايليجانس النامية يحمل علامة cytoskeleton غشاء قمي 1::GFP إدارة مخاطر المؤسسات. ويرد الأمعاء في المرحلة الفاصلة بخط أبيض (ERM-1::GFP يتم التعبير عن الفعل ضعيف في غشاء قمي من الالكترود بداية ولكن لا يمكن أن يكون موضع تقدير في هذه الصورة). الحيوانات هنا وأدناه هي هو موضح مع الأمامية (رئيس) اليسار, الخلفي (الذيل) الحق، حتى الظهرية، البطني أسفل. شريط الحجم: 5 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الرقم 2 : أمثلة للعلامات مزدوجة وثلاثية للبلدان النامية البرية من نوع C. ايليجانس الأمعاء باستخدام الأجسام المضادة، والبروتينات الانصهار. (أ، ب) الأجنة. (أ) مرحلة فاصلة. 6::GFP PAR (الأخضر؛ مكون من الأقطاب PAR قمي المعقدة)، الأضداد المضادة بعد 3 بار (الأحمر/تريتك (ميثيل والرودامين isothiocyanate)؛ وعنصر آخر من الأقطاب PAR قمي المعقدة)، و MH33 (أزرق/Cy5 (Cyanine5)؛ مكافحة-IFB-2/متوسط خيوط). 6::GFP الاسمية وجسم الاسمية 3 تسمية قمي غشاء الأمعاء C. ايليجانس (بين قوسين). IFB-2، علامة قمي آخر في مراحل لاحقة، بانميمبرانيوسلي مترجمة في هذه المرحلة المبكرة. 6::GFP قدم المساواة ومكافحة بار-3 أيضا تسمية البلعوم (لليسار)؛ التجويف المعوي هو المؤشرة التداخل مع 2-IFB (الفيروز) ويرد الأنبوبة المعوية بالأزرق المضادة-IFB-2 (يمين). (ب) مرحلة إضعاف. عجمان-1::GFP (أخضر؛ وعنصر مفرق)، والأجسام المضادة ICB4 (الأحمر/أليكسا، ICB4 بالكشف عن مستضد معوية ميمبرانيوس غير معروف). عجمان-1::GFP تسميات الوصلات قمي الأمعاء C. ايليجانس ، تظهر كنمط سلم المحيطة لومينال (أيضا تسمية تقاطعات قالت؛ غير مرئية منذ الصورة يتركز في الأمعاء؛ انظر الفرع 4، تصوير [كنفوكل]). ICB4 البقع جميع أغشية الأمعاء C. ايليجانس . الأسهم تشير إلى أغشية basolateral الملون بمكافحة ICB4. (ج، د) L2 اليرقات. (ج) ترك-413::GFP (الأخضر)، فالويدين (تكساس الأحمر-الأحمر، فالوتوكسين الربط إلى واو-أكتين) و MH33 (أزرق/Cyanine5، مكافحة-IFB-2). اسمحوا-413/خربشة عنصرا من الأقطاب القاعدية المعقدة ويموضع للأغشية basolateral من الأمعاء C. ايليجانس (بين قوسين). فالويدين وجسم IFB-2 قم بتسمية سيتوسكيليتون سوبميمبرانيوس قمي الأمعاء C. ايليجانس (الأرجواني). بشدة أيضا البقع فالويدين عضلات جدار الجسم، الساحقة تلطيخ المعوية. ويبين اقحم التكبير أعلى منطقة محاصر. (ﻫ) يرقة L3. سلكف-1::GFP (أخضر؛ ولا يتجزأ تحاولنقل المكون/السكر كاروي)، إدارة مخاطر المؤسسات-1::mCherry (أحمر) والأجسام المضادة MH27 (أزرق/Cyanine5، مكافحة-عجمان-1). سلكف-1::GFP تسميات الغشاء باسولاتيرال، بينما ERM 1::mCherry تسميات قمي غشاء الأمعاء C. ايليجانس (بين قوسين)؛ 1-عجمان تسميات في تقاطعات قمي. (و-F'' ') يرقة L2. (و وو') الصور لون واحد. سلكف-1::GFP (الأخضر) تسميات الغشاء باسولاتيرال (الأغشية الجانبية المؤشرة الأسهم البيضاء رقيقة). MH27 تسميات (أزرق/Cyanine5) تقاطعات قمي (أسهم صفراء قصيرة). (و''، و'' ') تراكب الصور مع أو بدون أكتين. إظهار insets التكبير أعلى من المناطق محاصر. ملاحظة التمييز الواضح من زاوية أبيكولاتيرال الخلايا المعوية بهذه العلامات مختلفة غشاء/مفرق التي تبدو ظاهرياً مشابهة في الصور الملونة واحدة (F، و'). الأسهم البيضاء سميكة في و'' 'أشر إلى cytoskeleton أكتين قمي/لومينال المسمى من قبل فالويدين (وإلا تطغى عليها أكتين العضلات). جميع الصور إسقاطات [كنفوكل] (z-رزمة من 0.2 ميكرومتر)، اكتسبت عن طريق مسح متسلسل لتجنب التسييل خلال بين القنوات. تغيير حجم أشرطة (لألف إلى هاء، واو إف '' ' وجميع insets): 5 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3 : أمثلة من C. ايليجانس المعوية morphogenesis الغشاء والتجويف الاستقطاب العيوب في تضخم منخفضة إلى متوسطة (تشريح ميكروجرافس fluorescence). يتم الحصول على جميع الصور بتشريح مجهر فلوري مجهزة بملحق مصنوعة خصيصا fluorescence ستيريو عالية الطاقة (جدول المواد). يتم إظهار تكبير مختلفة. تم الحصول على تعمل كل من [رني] مع جينات مختلفة في سلالة المسمى بإدارة مخاطر المؤسسات-1::GFP (مترجمة في القناة المعوية ومطرح قمي/لومينال الأغشية في مراحل اليرقات الجنينية وفي وقت مبكر، الموضح هنا). تعمل التجويف والأقطاب الأمعاء،: (أ، ب) البرية نوع الجنين (A) ويرقان (ب)؛ تشريد باسولاتيرال (ج، د) لإدارة مخاطر المؤسسات-1::GFP؛ يتم توسيع الخلايا المعوية وتظهر منتفخة في هذا الجنين (ج، أسهم تشير إلى الخلايا المعوية واحد)، ولكن المساحة البرية من نوع وترتيب هذه اليرقات (د، يشير السهم للأغشية الجانبية بين الباحث الثاني والثالث)؛ (ه) توسيع نطاق وملتف التجويف في الأجنة الثلاثة؛ (و) إدارة مخاطر المؤسسات-1::GFP توسيع في منطقة مفرق الأفقي (التجويف متعرج) وفي السيتوبلازم المعوية التي تحتوي على بروتينات فلورية خضراء-السلبية vacuoles (الأسهم)؛ (ز) الخراجات لومينال المنتصف إينترالومينال التصاقات (نقطة الأسهم الخراجات اثنين). (ح) سيتوبلاسميك وباسولاتيرال ERM 1::GFP التشرد مع حمل خارج الرحم لومن (الأسهم)؛ (أنا) ERM 1::GFP التشرد للتجارة والنقل-الإيجابية بونكتا (الأسهم) في السيتوبلازم. القنوات مطرح وتعمل قناة مطرح لا يرد هنا (ويرد القناة للامعاء اليسرى، إلى اليمين في جميع الصور). تغيير حجم أشرطة: 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الرقم 4 : أمثلة من C. ايليجانس المعوية الاستقطاب غشاء التجويف morphogenesis العيوب وفي أعلى التكبير (صور [كنفوكل]). (أ، ج، ه، ز، أنا، ك) الأجنة. (ب، د، و، ح، ي، ل) اليرقات. تم الحصول على تعمل كل من [رني] مع جينات مختلفة في سلالة المسمى بإدارة مخاطر المؤسسات-1::GFP (الأخضر في جميع الصور). وتركز التصوير على الأمعاء. كما تظهر الصور للأجنة القنوات مطرح (الجانب الأيسر من الصورة)، بما في ذلك تعمل قناة (غير المذكورة). (أ وب) البرية نوع الجنين (A) ويرقان (ب). (ج) التشريد Basolateral من قمي 1::GFP ERM (المرحلة الفاصلة؛ الالكترود الراحل). (د) تحويل قطبية: التشريد basolateral 1::GFP ERM قمي وتراكم قمي باسولاتيرال ICB4، كشفت عن طريق وسم مزدوجة. واو-أكتين (المسمى من قبل فالويدين-تريتك) يوجز الحيوانات تلطيخ حزم العضلات الطولية (الحيوان هو الثلاثي المسمى). (ﻫ) التشريد Basolateral لإدارة مخاطر المؤسسات-1::GFP في أواخر 3-fold الجنين. جسم مضاد IFB 2 قمي (أزرق/Cyanine5) يشير إلى التجويف سليمة والمناطق المحيطة لومينال خيوط متوسطة. (و) حمل خارج الرحم لومن المسمى بمكافحة-IFB-2 (أزرق/Cyanine5). (ز) إدارة مخاطر المؤسسات-1::GFP السلبية vacuoles في السيتوبلازم المعوية. (ح) إدارة مخاطر المؤسسات-1::GFP فاكوليس الإيجابية في السيتوبلازم المعوية. (الأول ي) نظراً لغياب التجويف في الأجنة واليرقات، على التوالي. (ك) القناة الهضمية على نطاق واسع. الكيسي (L) والأمعاء الملتوية. (أ، د، ح، الأول، ي، ك، ل) إسقاطات [كنفوكل]. (ب، ج، ه، و) أقسام [كنفوكل]. كان زيادة السطوع في ز لتسليط الضوء على هيولى بروتينات فلورية خضراء-السلبية vacuoles. تغيير حجم أشرطة: 10 ميكرون (نفس جميع الأجنة واليرقات، على التوالي). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الرقم 5 : تحويل قطبية المعوية والارتداد: مثال للتحديد الكمي لاستقطاب الغشاء والتجويف العيوب نشوء حيوي. (أ، ب، ج) اسمحوا-767و وكالة الأنباء الجزائرية-1[رني] كلا يسبب التشرد باسولاتيرال ERM 1::GFP (BL) وتشكيل التجويف حمل خارج الرحم (ش)، ولكن في مراحل إنمائية مختلفة. (أ) التحديد الكمي بتشريح مجهر: عد اليرقات (علىاليمين) والأجنة (يسار) مع الأقطاب تعمل 2 أيام بعد البذر الديدان على ألواح [رني]. ملاحظة: جميع الحيوانات وهمية و let-767(RNAi) وقد دبرت في هذا الوقت (وبالتالي هناك لا يوجد أجنة، الذي كان، مع ذلك، جميع البرية من نوع الأقطاب؛ كسر خط الأعمدة). وكالة الأنباء الجزائرية-1 [رني] يدفع قطبية العيوب الموجودة بالفعل في الأجنة، بينما ترك-767[رني] يدفع لهم في اليرقات. ويرجع ارتفاع النسبة المئوية لحمل خارج الرحم لومن (مقابل basolateral التشرد) في وكالة الأنباء الجزائرية-1[رني] الأجنة مقابل اليرقات القبض على الأجنة مع لومن حمل خارج الرحم. (ب) التحديد الكمي بالفحص المجهري [كنفوكل]: عد من حمل خارج الرحم لومن كل الحيوانات في بداية التنمية التجويف حمل خارج الرحم في اليرقات. واسمحوا-767 [رني] يدفع لومن أكثر حمل خارج الرحم في اليرقات من وكالة الأنباء الجزائرية-1[رني] (aps-1[رني] اليرقات هي "محكومون" التي قد لا أرستيد الأجنة). (ج) صور [كنفوكل] لليرقات البرية من نوع واليرقات مع إدارة مخاطر المؤسسات-1::GFP basolateral التشرد (BL) وحمل خارج الرحم لومن (ش)؛ شريط مقياس: 5µm-الارتداد قطبية (د، ه) في الحيوانات [رني] السماح-767(العد من الحيوانات مع أو بدون عيب قطبية [از/ش] بتشريح مجهر). 20 let-767(RNAi) الحيوانات مع التجويف حمل خارج الرحم معتدلة تعمل نقلوا من صفيحة [رني] لصفيحة OP50 في اليوم 4 وتقييمه بعد 40 ساعة. (د) أكثر من 50% يرقات عادت إلى البرية من نوع الأقطاب (ERM-1 في غشاء قمي). (ﻫ) 20% من الحيوانات تنمو يتجاوز مرحلة اليرقات L1 (let-767(RNAi) النتائج في اعتقال L1). يتم عرض كافة البيانات كمتوسط +/-وزارة شؤون المرأة، n = 3. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

هذا البروتوكول ويصف كيفية الجمع بين معيار الخسارة من الدالة الوراثية/[رني] والتصوير النهج (وضع العلامات ومجهرية) للاستفادة من ظهارة الأمعاء C. ايليجانس كنموذج لتشريح الجزيئية والبصرية من الحية نشوء حيوي الاستقطاب في غشاء والتجويف.

وضع العلامات

ويركز هذا البروتوكول على تلطيخ جسم. في الوضع الطبيعي وصف بالأجسام المضادة نهج بديلة محددة للغاية لوضع العلامات بالانصهار الفلورسنت البروتينات (الموضح في الورقة المرفقة على نشوء قناة مطرح غشاء حيوي)². على الرغم من أن تلطيخ جسم لا تسمح بتصوير حية، يجوز لها أن تقدم تأكيدا لإضفاء الطابع المحلي على البروتين للفائدة (أي أسلوب التوسيم دون أن تفشل). وعلاوة على ذلك، يمكن تقييم أسئلة بخصوص morphogenesis و/أو التعريب سوبسيلولار من البروتين غالباً في الحيوانات الثابتة. إيمونوستاينينج مفيد لوضع العلامات متعددة ومزدوجة وأنها يمكن أن تكون جنبا إلى جنب مع وسم بالبروتينات الفلورية فيوجن إذا كان يمكن الحفاظ على هذه من خلال الإجراءات المطلوبة في التثبيت وبيرميبيليزيشن. ويسمح البروتوكول المبين هنا عادة هذا (الشكل 2). في عين المكان وسم الحيوانات الثابتة بالأجسام المضادة أو البقع الكيميائية قد يوفر أيضا مزايا سوبيريسولوتيون المجهري تقنيات مثل العاصفة (التعمير البصرية العشوائية مجهرية). الفلورة بالكشف عن مستضد الذاتية، ويمكن تكييفها، على سبيل المثال، للتمييز بين تعديلات محددة من البروتين بوستترانسلاشونال. يمكن أن تنتج نتائج سريعة إذا كانت الأجسام المضادة متوفرة مرة واحدة في الموقع تقنيات المصبوغة-ليس كمباشرة في C. ايليجانس العينات كما هو الحال في الخلية والثقافة-قد أنشئت.

غير أن توليد جسم جديد (غير المذكورة هنا) تستغرق وقتاً طويلاً. لسوء الحظ، التحديد المتاحة تجارياً C. ايليجانس الأجسام المضادة الأساسي يظل الصغيرة بدلاً من ذلك، وليست كلها قادرة على الكشف عن مستضد في الموقع (انظر الجدول 1 لأظهرت الأمثلة للأجسام المضادة إلى كشف المستضدات المعوية في عين المكان، و الجدول 3 لموارد إضافية). سوف لا كروسريكت معظم الأجسام المضادة المتولدة ضد المستضدات الفقاريات مع هومولوجس C. ايليجانس بهم. اختيار الأجسام المضادة الثانوية يجب أن تأخذ في الاعتبار هذه الأنواع من الأجسام المضادة الأولى (مناقشتها في الفلورة العامة بروتوكولات^27،28). تحديدات كبيرة متاحة تجارياً مع استمرار تحسين الأصباغ الفلورية (مثل أليكسا-فلور الأصباغ). للأمثل تلطيخ، يمكن اختيار الأصباغ لقدرتها على مجاراة المجهر المستخدمة للتصوير، مثل الليزر المجهر [كنفوكل]، أو إذا كان القرار سوبر مجهرية يخطط أيضا لقدرتها على "وميض"³⁷. الأجسام المضادة الرئيسي المسمى مباشرة أو الكيميائية البقع (مثل المسمى فلوريسسينتلي فالويدين) وتتوفر أيضا، وهي مفيدة بشكل خاص لتلطيخ مزدوجة.

هو الصعوبة التي يواجهها في الموقع الضد تلطيخ في C. ايليجانس كتوم شل البيض للجنين وبشرة الكبار/اليرقات كلاهما يتطلب تعطيل المواد الكيميائية و/أو الميكانيكية للسماح بالوصول للجسم للأنسجة. على الرغم من أن جسم سائلة معقدة بروتوكولات المصبوغة وضعت للتغلب على هذه المشكلة^27،28، تشمل معظم كولاجيناز بيرميبيليزيشن، الذي يؤدي إلى تلف الأنسجة المستهدفة. على النقيض من ذلك، تجميد الكراك الأسلوب الموصوفة هنا طريقة بسيطة لفتح البشرة الدودة أو الخرزات. فإنه يتم تنفيذها مباشرة على شريحة الزجاج حيث يتم جمع العينات (وحيث يتم تنفيذ بقية تلطيخ أيضا)، وتعمل بشكل جيد خاصة البيض واليرقات التي العصا أفضل للشرائح الزجاجية (أي المراحل النظر في الغالب في توبولوجينيسيس الدراسات). أنه أيضا لا تتداخل مع الحفاظ على البروتينات الانصهار المسمى فلوروفوري. هذا الأسلوب يتطلب بعض المهارة اليدوية، كالضغط الصحيح على ساترة (قبل التحريك) وتجنب الضغط القص هما أمران حاسمان للحفاظ على العينة (كما هو التعامل مع لطيف وبيبيتينج أثناء الإجراء المصبوغة بأكمله).

قد تحتاج إلى شروط التثبيت تجريبيا العزم وتعديلها للهيكل/antigen الذي أن تكون الملون (يناقش في²⁷). تقنيات التثبيت (مثلاً على أساس فورمالدهايد) أكثر اعتدالا أفضل الحفاظ على أنتيجينيسيتي، على الرغم من أن هذا يجب أن يكون متوازنا مع الحاجة إلى الحفاظ على مورفولوجيا الأنسجة، حاسمة بالنسبة لتحليل morphogenesis. تثبيت أكثر اعتدالا الظروف أيضا مساعدة للحفاظ على البروتينات الفلورية الانصهار في تجارب وضع العلامات مزدوجة. وبالمثل، يتطلب كمية حجب عامل (مثل الحليب أو ألبومين المصل البقري/جيش صرب البوسنة) والمنظفات في الحل أغسل التكيف التجريبي لتحقيق التوازن بين الخلفية مع تلوين المحددة. تفاصيل بشأن الجوانب العامة لتقنيات الفلورة، مثل مناقشة مختلف تقنيات المصبوغة، وتصميم الضوابط المناسبة، ونصائح لتحسين هذه الإجراءات على دودة الأمعاء (مثل التقليل من الأمعاء ويمكن الاطلاع على أوتوفلوريسسينسي) بصورة عامة وبروتوكولات محددة الفلورة C. ايليجانس ، المشار إليها في جميع أنحاء.

التدخل مع وظيفة الجينات والتقييم تعمل توبولوجينيسيس

ويبرز هذا البروتوكول نهج محددة [رني] التي تعتبر مفيدة عند تقييم الجينات مع مهام مبكرة وضرورية وفي كل مكان، الذين فقدان جزئي (بدلاً من كاملة) أكبر قدر من المعلومات، كما الحال بالنسبة لمعظم توبولوجينيسيس الجينات (نحن الجينوم على نطاق الشاشة في إدارة مخاطر المؤسسات-1::GFP-الأمعاء المسمى اقترح أن التدخل مع هذه الأسباب الجينات > 90 في المائة من جميع توبولوجينيسيس إعلامية تعمل في هذا الإعداد خاص¹²). العديد من المزايا C. ايليجانس يوفر للتلاعب الوراثي (مثلاً وقتها الجيل قصيرة) ونهج مختلفة للتشويش وظيفة الجينات من الأمام (بدءاً من الوظيفة/النمط الظاهري)، وعكس (بدءاً وتناقش النهج الوراثية الجينات) في العام C. ايليجانس الأدب^31،38. توافر المتاحة تجارياً على نطاق الجينوم [رني] تغذية المكتبات أيضا يسمح باستخدام هذه التقنية الجينية العكسية كأداة فحص الوراثي إلى الأمام (انظر الجدول للمواد للموارد). وتشمل مزايا محددة من [رني] لتحليل توبولوجينيسيس قدرته: لتوليد مجموعة من تعمل معادلة لسلسلة الاليلي المسخ (هذا عادة يعمل جيدا للجينات تعتمد على جرعة morphogenesis)؛ لإزالة الأم الكشف (عادة ما تشارك في وقت مبكر morphogenesis/توبولوجينيسيس)؛ المرحلة تحديداً التدخل (مفيدة لتقييم الآثار على نشوء الاستقطاب غشاء حيوي أثناء نمو اليرقات بوستميتوتيك).

وتناقش تفاصيل بشأن الجوانب العامة لإجراءات [رني] في الحكام (^26،s = "xref" > 31). هو مفتاح لتحليل توبولوجينيسيس الفتاكة تعمل القدرة على تعدل شروط [رني] لزيادة نطاق تعمل. عادة ما يمكن أن تتولد توبولوجينيسيس إعلامية تعمل في خلفية البرية من نوع دون الحاجة للامعاء على حدة [رني] سلالات³⁹. ومع ذلك، هذه السلالات المتاحة إذا هذا فشل ويمكن أيضا استخدامها لتمييز الخلايا ذاتية الحكم من آثار غير متمتع بالحكم الذاتي. وأبلغ نهوج مختلفة لتحوير القوام [رني]، مثل المعايرة لتركيزات إيبتج لتحريض دسرنا، نهج التي قد تنتج النتائج استنساخه على الأكثر³⁰. بيد المعايرة الكمية الدقيقة قد لا يكون ضروريا عندما تهدف إلى توليد مجموعة من مختلفة تعمل. عموما، نجاح هذا التحليل لا يعتمد كثيرا على تعظيم التأثير [رني] كما في تحديد شروط [رني] التي تولد طيف مفيدة لتعمل (التي قد تكون غالباً نتيجة للأمثل (مثل أكثر اعتدالا) [رني] الشروط).

التقييم البصري لتعمل توبولوجينيسيس الناجمة عن [رني] من المهم تحديد الإطار الأمثل لتقييم المظهرية. فمن الأفضل لبدء تقييم لوحات المبكر (مثلاً يومين بعد انتقاء الحيوانات على اللوحات [رني] [رني] في ظروف قياسية) ومتابعة لهم طويلة بما يكفي للآثار الممكنة في وقت متأخر. على سبيل المثال، ينبغي أن يشمل دورة وقت التنموية من عيب قطبية المتفاقم، 3-7 أيام في المعتقل عادة اليرقات. شروط التحليل نشوء الاستقطاب غشاء حيوي في بوستميتوتيك غير تقسيم خلايا الأمعاء اليرقات ويمكن زيادة تحسين عند استخدام طفرات أو الحيوانات [رني] مع تباطؤ نمو (كما، على سبيل المثال، let-767(RNAi) أو المسخ الحيوانات ¹²، الرقم 5). بالطبع الوقت أي فقد لإحباط إذا تظهر الحيوانات F2 (يمكن إزالة L4s في التجارب التي تم فيها إلقاء القبض على معظم ولكن ليس كل الحيوانات اليرقات). وتتطلب كل تجربة التقييم المصاحبة لعناصر التحكم المناسبة الإيجابية والسلبية (مثل استنساخ [رني] البكتيرية التي تحفز النمط الظاهري توبولوجينيسيس معرفة وتفريغ ناقلات أو المجمعة [رني] استنساخ، على التوالي). شرط آخر لتقييم حجم الحضنة كافية (على الأقل 50). إذا لم تتحقق، يمكن أن يحاكم الشروط الأخرى [رني] (مثل الشرطي). وأخيراً، تحدث بعض تعمل توبولوجينيسيس مثيرة للاهتمام لا سيما في penetrance منخفضة، وبالتالي عدد كاف من الحيوانات يجب أن تقيم.

الفحص المجهري

تضخم منخفضة إلى متوسطة تشريح مجهر فلوري وتضخم عالية [كنفوكل] مجهرية، الإجراءين التصوير القياسية الموضحة هنا، تكفي عادة لوصف الجوانب الأساسية للنمط الظاهري أنبوب أو التجويف في C.elegans الأمعاء ويمكن أن تستخدم أيضا الشاشة بصريا مجموعات أكبر من الحيوانات في الشاشات إلى الأمام. تشريح مجهرية fluorescence تصاريح: في فيفو تصوير الحيوانات في اللوحات (ومع ذلك، يمكن أيضا استرداد الحيوانات الحية، عابر المعطل تداولها بالمسكنات، من يتصاعد بعد [كنفوكل] أو تصوير DIC)؛ فحص مجموعات كبيرة من الحيوانات؛ تتبع الأحداث التنموية (مثل التشرد واستبدال علامة الاستقطاب خلال توسع الغشاء)؛ تتبع أنماط التعبير محددة (بعض الأنماط وأوجه عدم التماثل أفضل تتميز بتكبير أقل)؛ تحديد وانتقاء مناسبة لإجراء مزيد من التحليل (مثلاً [كنفوكل] مجهرية) أو للحفاظ على المتسلسلات اكستراتشروموسومال نيون الديدان. التصور في تضخم عالية بالفحص المجهري [كنفوكل] تصاريح لتميز النمط الظاهري على مستوى سوبسيلولار وخلية مفردة. ويصف هذا البروتوكول تصوير مع ليزر المسح مجهر [كنفوكل] أن يقدم كونفوكاليتي أفضل على البدائل مثل غزل قرص مجهر [كنفوكل]. مجهر [كنفوكل] قرص غزل غير أن مجهر اختيار الدراسات الديناميكية والوقت الفاصل بين منذ فإنه يدفع أقل الضيائية (انظر المراجع (^34،35) لمزيد من المناقشة لتضخم منخفضة وعالية الفحص المجهري في C. ايليجانس). الرواية، فضلا عن التقنيات المجهرية التقليدية توفر مزايا إضافية ويسمح التصوير بدقة أعلى في نطاق النانو (مثل الإلكترون والقرار فائقة مجهر؛ نوقشت في^{37، 40}).

عند تصوير الأمعاء C. ايليجانس تحت مجهر [كنفوكل]، التركيب والتثبيت أمر بالغ الأهمية. من بين المواد الكيميائية المختلفة للتثبيت، أزيد الصوديوم-على الرغم من أن السمية-يعمل معظم موثوق بها إذا كان المسح يتم فورا. ليفاميسولي، على الرغم من عدم السمية، تنتج هايبركونتراكشن يتداخل أحياناً مع تقييم تعمل morphogenesis. قد تتداخل مع بروتينات الفلورسنت المرتبطة بغشاء بعض المسكنات ويمكن أن تنتج النتائج الملموسة التي قد تبدو وكأنها عيوب قطبية. C. ايليجانس عينة سميكة وهكذا تحليل ثلاثي الأبعاد (تقطيع) ضروري للاستفادة من قوة محددة من ظهارة الأمعاء أنبوبي يسمح التصور ممتازة من تقاطعات قمي والغشاء الجانبي (ليس بسهولة موجوداً في شقة ابيثيليا). يجب تعديل إعدادات [كنفوكل] لكل شريحة والهدف للحصول على صور ذات نوعية جيدة، بما في ذلك معلمات مثل بين أقواس، في المتوسط، طاقة الليزر، كسب، والثقب والسطوع. مشكلة خاصة واحدة لتصوير الأمعاء هو محتوى هذا الجهاز من حبيبات أوتوفلوريسسينت الأخضر/الأصفر (يحلول المتصلة العضيات (لروس)) التي قد تتداخل مع تفسير النتائج، لا سيما عند تقييم تشريد بروتينات فلورية خضراء المسمى غشاء إندو والبلازما المرتبطة بها المكونات. والمعروف جيدا في المجال هذه المشكلة يمكن معالجتها بنهج مختلفة (تبعاً للمجهر)، بما في ذلك DAPI الاستبعاد والبصمات الطيفية، وإعدادات الماسح الضوئي التجريبية^13،41.

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

نشكر ماريو دي بونو (لجنة نهر الميكونج مختبر للبيولوجيا الجزيئية، كامبريدج، المملكة المتحدة)، كينيث ج. كيمفويس (جامعة كورنيل، إيثاكا، الولايات المتحدة الأمريكية)، ميشال لابويسي (معهد دي بيولوجي باريس سين، جامعة بيير وماري كوري، باريس، فرنسا)، ميشو غريغوار (جامعة ديرين 1، رين، فرنسا)، وكجك، يمولها مكتب "برامج الهياكل الأساسية للبحوث" (OD010440 P40)، المعاهد الوطنية للصحة لسلالات والأجسام المضادة. أيد منح GM078653 المعاهد الوطنية للصحة، 224570 هو MGH و 223809 سا واظب هذا العمل