The Loop arteriovenosa (AV) em um modelo animal pequeno para estudar angiogénese e Engenharia de tecido vascularizado

Descrevemos uma abordagem microcirúrgico para a geração de um circuito arteriovenoso (AV) como um modelo para analisar a vascularização in vivo num ambiente isolado e bem caracterizado. Este modelo não só é útil para a investigação de angiogênese, mas também é perfeitamente adaptado para a engenharia axial vascularizado e tecidos transplantáveis.

A functional blood vessel network is a prerequisite for the survival and growth of almost all tissues and organs in the human body. Moreover, in pathological situations such as cancer, vascularization plays a leading role in disease progression. Consequently, there is a strong need for a standardized and well-characterized in vivo model in order to elucidate the mechanisms of neovascularization and develop different vascularization approaches for tissue engineering and regenerative medicine.

We describe a microsurgical approach for a small animal model for induction of a vascular axis consisting of a vein and artery that are anastomosed to an arteriovenous (AV) loop. The AV loop is transferred to an enclosed implantation chamber to create an isolated microenvironment in vivo, which is connected to the living organism only by means of the vascular axis. Using 3D imaging (MRI, micro-CT) and immunohistology, the growing vasculature can be visualized over time. By implanting different cells, growth factors and matrices, their function in blood vessel network formation can be analyzed without any disturbing influences from the surroundings in a well controllable environment.

In addition to angiogenesis and antiangiogenesis studies, the AV loop model is also perfectly suited for engineering vascularized tissues. After a certain prevascularization time, the generated tissues can be transplanted into the defect site and microsurgically connected to the local vessels, thereby ensuring immediate blood supply and integration of the engineered tissue. By varying the matrices, cells, growth factors and chamber architecture, it is possible to generate various tissues, which can then be tailored to the individual patient's needs.

A maior parte dos tecidos e órgãos no corpo humano são dependentes de uma rede de vasos sanguíneos funcionais que fornece nutrientes, trocas gasosas e remove os resíduos. Mau funcionamento deste sistema causado por problemas vasculares locais ou sistémicas pode conduzir a uma variedade de doenças graves. Além disso, nas áreas de pesquisa, como a engenharia de tecidos ou medicina regenerativa, uma rede de vasos sanguíneos funcional dentro tecidos geradas artificialmente ou órgãos transplantados é indispensável para a aplicação clínica de sucesso.

Durante décadas, os investigadores têm investigado os mecanismos exatos envolvidos na vasculatura crescente para ganhar uma compreensão mais profunda situações patológicas a fim de encontrar novas intervenções terapêuticas e proporcionar uma melhor prevenção das doenças vasculares. No primeiro passo, os processos básicos, tais como as interacções célula-célula ou o efeito das moléculas sobre as células do sistema vascular são geralmente investigados in vitro por 2D ou 3Dexperimentos. modelos 2D tradicionais são fáceis de executar, estão bem estabelecidos e têm contribuído grandemente para uma melhor compreensão destes processos. Pela primeira vez em 1980, Folkman et ai. relataram na semeadura angiogénese in vitro de células endoteliais capilares em placas revestidas com gelatina ^1. Isto imediatamente deu lugar a publicação de uma multiplicidade de outras experiências de angiogénese 2D em tubo de ensaio de formação de célula endotelial ^{2, 3} ensaio de migração e a co-cultura de diferentes tipos de células ^4, bem como outros. Estes ensaios são usadas ainda hoje e aceito como padrão métodos in vitro.

No entanto, este arranjo experimental nem sempre é apropriado para o estudo do comportamento das células in vivo uma vez que a maioria dos tipos de células necessitam de um ambiente 3D para formar estruturas de tecido fisiológicas relevantes ^5. Pode ser mostrado que a arquitectura da matriz 3D é decisivo para morphogenesi capilars ⁶ e que as interações celulares extra-matriz celular (ECM) e de cultura 3D condições regulam fatores importantes envolvidos na angiogénese tumoral ^7. A matriz 3D oferece entradas mecânicas complexas, pode ligar proteínas efetoras e estabelecer escala tecidos gradientes de concentração de solutos. Além disso, considera-se necessário, a fim de imitar morfogenética vivo e as etapas de remodelação em tecidos complexos ^5. Nestes sistemas, tanto a angiogénese e vasculogénese pode ser estudada. Enquanto angiogênese descreve o surgimento de vasos capilares a partir de vasos preexistentes sangue ^8, vasculogênese refere-se à formação de novo de vasos sanguíneos através de células endoteliais ou seus progenitores ^9,10. A maturação dos vasos é descrito num processo chamado de "arteriogénese" via do recrutamento das células musculares lisas ^11. A angiogênico típico modelo in vitro é o surgimento de células endoteliais da monocamada existentes semeadas como uma monocamada em superfícies de gel, na superfície das microesferas incorporados dentro de um gel ou através da construção de esferóides de células endoteliais ^12. Em modelos vasculogénicos células endoteliais individuais são aprisionadas num gel 3D. Eles interagem com as células endoteliais adjacentes para formar estruturas e redes vasculares de novo, tipicamente em combinação com células de suporte ^12.

No entanto, mesmo em 3D complexos em modelos in vitro não reproduzem em ambientes vivo dado completamente a multidão de célula-célula e célula-ECM interações ^13. Substâncias com alta atividade in vitro não mostram automaticamente os mesmos efeitos in vivo e vice-versa ^14. Para uma análise abrangente da vascularização processa há uma necessidade urgente de desenvolver modelos in vivo que simulam melhor a situação no corpo. Uma grande variedade de ensaios in vivo da angiogénese são descritos na literatura, incluindo oensaio de pintainho membrana corioalantóica (CAM), o modelo de peixe-zebra, o ensaio de angiogénese da córnea, o modelo de saco de ar dorsal, a câmara dorsal dobra cutânea, os modelos de tumores subcutâneos ^14. No entanto, estes ensaios são frequentemente associados com limitações, tais como alterações morfológicas rápidas, problemas em novos capilares a partir de distintivos já existentes no ensaio da CAM, ou o espaço limitado no ensaio de angiogénese da córnea ^15. Além disso, os sistemas de não-mamíferos são utilizados (por exemplo., O modelo de peixe-zebra ^16), o que leva a problemas em xenotransplantes ^17. No modelo de tumor subcutâneo, angiogénese proveniente apenas do tumor em si não pode ser analisado uma vez que o tecido adjacente contribui significativamente para o processo de vascularização. Além disso, o tecido circundante pode ter um papel decisivo na formação do microambiente do tumor ^18.

Não só para estudar angiogénese ou vasculogénese há uma forte need para um padronizado e bem caracterizada no modelo vivo, mas também para estudar diferentes estratégias de vascularização em engenharia de tecidos e medicina regenerativa. Hoje, a geração de órgãos ou tecidos artificiais complexas é possível tanto in vitro como in vivo. Bioprinting 3D proporciona uma técnica de fabricação sob demanda para a geração 3D complexos tecidos vivos funcional ^19. Além disso, biorreactores pode ser usada para a geração de tecidos ^{de 20} ou até mesmo o próprio corpo pode ser usada como biorreactor de ^21. No entanto, a principal barreira para a aplicação com sucesso de tecidos gerados artificialmente é a falta de vascularização dentro das construções de engenharia. conexão imediata com a vasculatura do hospedeiro após o transplante é um importante pré-requisito para a sobrevivência, especialmente no caso de tecidos ou órgãos artificiais de grande escala.

Diferente in vitro ou in estratégias prevascularization vivo foram develvolvido para estabelecer uma microvasculatura funcional em construções antes da implantação ^22. A implantação de uma estrutura de suporte com capilares in vitro engenharia pré-formados sobre a pele dorsal de ratos levou a um rápido anastomose da vasculatura ratinhos dentro de um dia ^23. Em contraste, uma co-cultura de esferóides que consiste em células estaminais mesenquimais humanas e células endoteliais da veia umbilical humana montados numa rede tridimensional prevascular desenvolvido após implantação in vivo. No entanto, a anastomose com a vasculatura de acolhimento ²⁴ foi limitado. Acima de tudo, em defeitos mal vascularizados, tais como áreas de necrose ou irradiados, este assim chamado vascularização extrínsecos - o crescimento de vasos da área circundante para o andaime - muitas vezes falha. Vascularização intrínseca, por outro lado, baseia-se num eixo vascular como fonte de novos capilares brotam para o andaime ^25. Usando a abordagem vascularização axial, A engenharia de tecidos podem ser transplantadas com o seu eixo vasculares e ligado aos navios locais no local destinatário. Imediatamente após o transplante, o tecido está adequadamente apoiado pelos oxigênio e nutrientes, o que cria as condições adequadas para a melhor integração possível.

Devido à disponibilidade limitada de modelos para investigar a angiogênese in vivo e em reconhecimento da importância crescente de geração de tecido vascularizado axial, desenvolvemos a abordagem microcirúrgica de Erol e Spira ainda mais para gerar um loop arteriovenosa (AV) no modelo animal ^26. A utilização de uma câmara de implante completamente fechado torna este método muito bem adaptado para estudar a formação de vasos sanguíneos sob "controlado", bem caracterizadas as condições in vivo (Figura 1). Este modelo não só é útil para a investigação de angiogênese, mas também é perfeitamente adaptado para a vascularização axial de andaimes para Engin tecidofins nharia.

O Comité de Cuidados com Animais da Universidade Friedrich-Alexander de Erlangen-Nürnberg (FAU) e o Governo do Oriente Franconia, Alemanha, aprovou todas as experiências. Para as experiências, os ratos Lewis machos com um peso corporal de 300 - foram utilizados 350 g.

1. The Loop Modelo arteriovenosa no Rat

1. Implantação Procedimento (Figura 2)
   1. Para anestesia usar uma caixa de plástico especial que está ligada através do tubo para o vaporizador de isoflurano e fechada por uma tampa. Ligue fornecimento de gás e medidor de caudal entre 0,8-1,5 L / min.
   2. Coloque o rato na caixa de plástico a indução e selar o topo. Ligue vaporizador de isoflurano a 5%.
   3. Observar atentamente o rato durante a indução da anestesia. Após 3-4 minutos, o rato serão anestesiados.
   4. Confirmar a anestesia adequada: a perda do reflexo de endireitamento, perda do reflexo palpebral, reflexo de retirada, reflexo da córnea positivo.
   5. Remover o rato da caixa e verificar a suapeso para o cálculo de drogas. Aplicar pomada para evitar a secura e sob anestesia.
   6. Administrar medicação para a dor e antibióticos (por ex., 7,5 mg / kg de enrofloxacina por via subcutânea (SC), 12,5 mg / kg de tramadol e 100 mg / kg por via intravenosa tanto metamizol (iv)). Administrar cristalóides adaptado de peso durante a operação (por exemplo., 30 ml / kg SC).
   7. Colocar o rato de costas sobre uma placa de aquecimento a 37 ° C, sob anestesia com 1-2% de isoflurano inalação administrados por via máscara.
   8. Monitorar a anestesia adequada e aumentar isoflurano se o nível de anestesia é muito baixo (movimento do rato, resposta à dor, o tom da mandíbula, sem perda de reflexos (ver 1.1.4.), A frequência cardíaca aumentando). Tenha cuidado para não overdose isoflurano (perda de reflexos da córnea, frequência cardíaca elevada, diminuição da saturação de oxigênio). Use um oxímetro de pulso especial para pequenos animais para a verificação da saturação de oxigênio (95 - 100%) e freqüência cardíaca (250-450 / min) do rato. Durante os operatina temperatura do monitor do rato (36 - 40 ° C) e ajustar a temperatura da placa de aquecimento, se necessário.
   9. Raspar os lados internos dos membros posteriores com um barbeador elétrico e desinfectar a área com anti-sépticos. Espalhe os membros posteriores e corrigi-los com fita adesiva.
   10. Coloque o rato sob um microscópio cirúrgico e cobrir o rato com drapeados estéril. Certifique-se de que o procedimento de operação do conjunto é realizada em condições estéreis.
   11. Abrir a pele no meio da coxa esquerda com uma incisão longitudinal do joelho superior para a virilha usando um bisturi (No. 10).
   12. Cortar o tecido subcutâneo e fáscia em camadas de cerca de 3 cm de comprimento usando tesouras de dissecação e micropinças até que o feixe vascular femoral é exposta a partir da artéria pélvica na virilha para a bifurcação da artéria femoral do joelho.
   13. Separar os navios e remover a adventícia com uma tesoura adventícia e micropinças.
   14. Coagular o lado branchos com coagulação elétrica. Cobrir o campo de operação com uma compressa úmida.
   15. Abrir a pele do lado direito, tal como descrito para o lado esquerdo, 1.1.11 - 1.1.14.
   16. Para a colheita do enxerto venoso, ligadura da veia femoral direita por coagulação elétrica na proximal e distal a uma distância de 1 - 1,5 cm.
   17. Remova o enxerto venoso com micropinças e lave o enxerto venoso com uma solução de heparina (50 UI / ml em solução de cloreto de sódio a 0,9%) utilizando uma cânula de irrigação e transferi-lo para a coxa esquerda. Cobrir o campo de operação no lado direito com uma compressa úmida.
   18. Ligadura da veia femoral do lado esquerdo proximalmente na região inguinal com um grampo microvascular. Coagular a veia femoral distalmente por coagulação eléctrico, no joelho superior antes de ramificação, a uma distância de cerca de 2 cm.
   19. Para anastomose ligar a extremidade proximal do enxerto venoso com a extremidade proximal da veia de anastomose extremidade-a-extremidade com uma 11-0 suture. Use cerca de 8 suturas interrompidas. Comece com colocando as duas primeiras suturas nas posições 12 e as 6 horas. Em seguida, coloque em 2 a mais 3 suturas entre esses pontos no lado da frente e depois colocar 2 a mais 3 suturas na parte de trás.
   20. Ligar a artéria femoral, da mesma forma descrita para a veia femoral (1.1.18.). Certifique-se os vasos de loop não estão torcidos. Anastomose da extremidade distal do enxerto venoso com a extremidade proximal da artéria, tal como descrito para a veia femoral (passos 1.1.19.).
   21. Administrar 25 UI de heparina por via intravenosa. Faça novamente se que os navios de loop não estão torcidos, Remova os grampos e verificar se há vazamentos e desobstrução do circuito por cerca de 5 min.
   22. Papaverina fluxo (por exemplo, 4 mg / ml) sobre os vasos para evitar espasmos vasculares. Se houver a permeabilidade, o loop expande e pode ser observado o pulso da artéria.
   23. Prefill a câmara de implantação com a primeira metade (cerca de 500 ul) da matriz (por exemplo, </ Em>, um hidrogel ou uma matriz óssea com ou sem células). Incorporar o circuito para a câmara de implantação.
   24. Encher a câmara de implantação com a segunda metade da matriz, para um volume total de 1000 ul. Selar a câmara com a tampa da câmara.
   25. Fixar a câmara de implantação na coxa com um 6-0 sutura não absorvível. Fixar a tampa da câmara com um 6-0 sutura não absorvível. Pare de possíveis sangramentos com a coagulação elétrica.
   26. Feche a pele com absorvíveis 4-0. Cobrir a ferida com spray de alumínio.
   27. Administrar antibióticos e analgésicos (por exemplo, 7,5 mg / kg de enrofloxacina SC, tramadol 12,5 mg / kg per os (PO) (através da água de beber) durante 3 - 5 dias e depois, dependendo do comportamento do rato).
   28. Ligue o vaporizador e deixe o rato para respirar fornecimento de gás até que ele começa a despertar.
   29. Coloque o rato em uma caixa com suporte térmico e observá-lo com cuidado até que esteja totalmente recuperado.
   30. Não deixe a un ratoassistiu até que ele recuperou a consciência suficiente para manter decúbito esternal.
   31. Não devolva o rato para a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado.
2. explantação Procedimento
   1. O explante após um curto período de tempo ou implantação de longa data (de acordo com o desenho do estudo, por exemplos, consulte Referências 27-32). Anestesiar o rato de acordo com os passos 1.1.1.-1.1.9.
   2. Abrir a pele do abdómen com um bisturi (N ° 10) e mover os intestinos de lado com uma compressa. Expor a aorta abdominal e da veia cava caudal usando cotonetes.
   3. Canular a aorta abdominal (por exemplo., Calibre 24 cânula de plástico) e cortar a veia cava caudal com tesouras de dissecação.
   4. Lave a aorta abdominal com uma solução de cloreto de sódio a 0,9% contendo 100 UI / ml de heparina até que o fluido do vazamento é clara. Perfundir aorta com 30 ml de solução de perfusão (por exemplo., O agente ou a Índia contraste emk).
   5. Eutanásia do rato por injecção de uma dose letal de embutramida, iodeto mebezonium, solução de cloridrato de tetracaína injectáveis ​​(0,1-0,2 ml / kg) durante a anestesia profunda.
   6. Ligadura da aorta abdominal e veia cava caudal com um 4-0 sutura não absorvível.
   7. Feche a área ferida aberta com 1 - 2 grampos. Armazenar o rato durante 24 h a 4 ° C (solução de cura da perfusão).
   8. Coloque o rato em sua parte traseira. Espalhe os membros posteriores e corrigi-los com fita adesiva.
   9. Abrir a pele por cima da câmara através de uma incisão longitudinal com um bisturi (No. 10).
   10. Remover o tecido conjuntivo proveniente da câmara e o pedículo loop usando tesouras de dissecação e microfórceps. Cortar o pedículo laço a uma distância de 1 cm a partir da abertura da câmara de dissecção com uma tesoura e remover a câmara.
   11. Abra a tampa da câmara e retire cuidadosamente a construção da câmara com uma pinça e corrigi-lo em solução de formol tamponado a 4% durante 24 h na salatemperatura. Depois use o construto para 3D tomografia computadorizada de micro ou para análise histológica ³⁰ embebido em parafina.

Tissue Engineering
Para fins de engenharia de tecido ósseo, um número de diferentes substitutos ósseos foram implantadas no animal pequeno rato modelo de ansa AV ^27,28,33,34. Vascularização poderia perfeitamente ser demonstrada por tomografia computadorizada 3D-micro (micro-CT) (Figura 3A). A vascularização de uma matriz processada bovina osso esponjoso (PBCB) foi significativamente mais elevada no grupo ciclo em comparação com o grupo sem vascularização. Uma rede de vasos sanguíneos em constante crescimento e amadurecimento desenvolvido dentro da câmara de implantação ao longo de 8 semanas. Entre 4 e 8 semanas, foi observado o crescimento contínuo do tecido vascularizado em direcção ao centro das construções, ao passo que não foi detectado aumento no grupo não-vascularizado ^33. Prevascularization da matriz PBCB durante 6 semanas no modelo de ansa AV levou à sobrevivência superior dos osteoblastos injectados em comparação com os osteoblastos de controlo. Em contraste com os grupos de controlo, a expressão de genes específica do osso foi detectado no grupo ciclo AV com osteoblastos implantados ^28. Como uma outra matriz, de vidro bioactivo sinterizado em conjunto com o gel de fibrina foi implantado nas alças AV dos ratos. Após 3 semanas, uma rede densa de vasos recém-formados desenvolveu demonstrado por micro-CT e histologia ^27.

A câmara de implantação foi modificado a fim de acelerar andaime vascularização. Usando uma câmara de titânio perfurada, vascularização intrínseca foi apoiado pelos navios extrínsecos do tecido circundante. Com apenas duas semanas após o implante de uma hidroxiapatita β-fosfato tricálcico (β-TCP / HA) / matriz de fibrina, 83% dos navios foram conectados à linha de AV com aumento contínuo ao longo do tempo e chegou a 97% conexão após 8 semanas ^34. Com a implantação da medula derivada de células estaminais mesenquimais 5 x 10 ⁶ de osso (MSC) e proteína morfogenética óssea 2 (BMP-2), um aumento significativo na formação de osso em comparação com as BMP-2 ou MSC sozinho grupos podem ser induzidas. Aos 6 e 12 semanas, a matriz de fibrina foi completamente degradada e substituída por tecido conjuntivo altamente vascularizados em todos os grupos (Figura 3B implante de 6 semanas). Houve uma diminuição significativa no número de vasos no grupo de BMP-2 / MSC entre 6 e 12 semanas e depois de 12 semanas nos outros grupos. Esta foi provavelmente devido à maturação da rede vascular ou o arranjo compacto das estruturas ósseas que levam a um vascular limitado a formação da rede ^32.

Além óssea, outros tecidos tais como o músculo ou do fígado também podem ser manipuladas no modelo de ansa AV.

Para a engenharia axialmente vascularizado tecido muscular, as experiências com mioblastos primários em uma matriz de fibrina circuito AV foram realizados. Depois de um prevascularization tempo de 2 semanas durante 2, 4, e 8 semanas, 1 x 10 ⁶ mioblastos foram transplantadas para a câmara anelar AV. mioblastos transplantados poderia ser detectado novamente, mesmo depois de 8 semanas usando rotulagem éster diacetato succinimidil carboxifluoresceína (CFDA). As células mantiveram o seu fenótipo miogénica dentro da matriz de fibrina e a expressão dos marcadores específicos do músculo MEF-2 e desmina foi positiva após 4 semanas. No entanto, a expressão miogénica gene marcador foi negativo após 8 semanas, o que foi provavelmente devido à ausência de estímulos miog�icas e rápida absorção da matriz de fibrina ^35. Para aumentar a estimulação miogénico, uma nova modificação do circuito AV rato foi desenvolvida usando a veia epigástrica, em vez da veia safena, a fim de alcançar um posicionamento mais proximal da câmara de isolamento. Assim, a incorporação adicional do nervo motor obturador foi geometricamente facilitada. Ao utilizar este circuito modificação AV, o qual é referido como o laço PAV, poderia mostrar d miogénicaifferentiation de mioblastos co-implantado e MSC ^36.

Para engenharia de tecidos hepático 4 x 10 ⁶ PKH-26 células fetais de fígado marcadas foram transplantadas dentro de uma matriz de fibrina no modelo de ansa AV de rato durante 2 semanas. No grupo controle, foram implantados matrizes sem um loop AV e matrizes livres de células. capilares funcionais surgiu a partir dos vasos de ansa AV e altamente vascularizado neo-tecidos foi observada dentro da câmara após 14 dias de implantação, como mostrado por coloração com CD31 e rotulagem tinta da China. Não houve diferença entre o grupo ciclo AV hepatócitos isento de células e. O circuito AV vascularizado a matriz de fibrina densamente e células fetais viáveis ​​poderia ser detectado após a explantação por PKH-26 uma coloração positiva e citoqueratina 18 (CK-18) imuno-específico das células do fígado, principalmente na proximidade do eixo principal vascular. níveis de mRNA de CK-18 foram elevados no grupo de células circuito AV. Em contraste, nenhuma CK-18 expressioN poderia ser detectado em construções sem um circuito ou células ^37.

Estudos angiogênese
O circuito AV consiste em três segmentos: a veia, o enxerto arterial e o segmento de interposição de enxerto venoso (IVG) (Figura 1). avaliação tridimensional do sistema vascular demonstrou que originou vasos recém-formados tanto a partir da porção venosa e arterial, bem como a partir do interponate venosa. Um grande número de vasos recém-formados foram observados a partir da IVG ^33. Com in vivo MRA, microscopia eletrônica de varredura de moldes de corrosão e histologia imune, foi observado o início da angiogênese em uma matriz de fibrina entre os dias 10 e 14. Acima de tudo, a venosa e segmentos IVG deu origem a muitos capilares e vasos maiores. A redução gradual do calibre luminal como um sinal de Arterialização da IVG, devido ao aumento da pressão endovascular e wa tensão de cisalhamentos detectado a partir do dia 7 de ^38. Em estudos adicionais, pode ser confirmado que vascular germinação ocorre principalmente no enxerto arterial ^não-39.

A análise exata dos processos de angiogênese ea estimulação e inibição da formação de vasos sanguíneos pode ser visualizado na câmara de circuito implantação AV. O factores de crescimento vascular endotelial do factor de crescimento A (VEGFA) e factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF) induziu uma maior densidade vascular absoluta e relativa e reabsorção mais rápida da matriz de fibrina em comparação com o grupo de controlo de crescimento isento de factor de ^31. Além disso, a remodelação fenómenos e maturação da rede vascular dentro da câmara de isolamento foram visualizadas ao longo de um período de implantação de 8 semanas. Em AV foram identificados câmaras de loop processos de interconexão intercapilar e angiogênese intussusceptive, bem como o crescimento de possíveis linfática immunohistologically como parâmetros de nematuração ovascular ^39. Ao aplicar o PHD (domínio prolil-hidroxilase) DMOG inibidor (dimethyloxallyl glicina) sistemicamente em ratos, pode ser mostrado que a concentração do factor alfa indutível por hipoxia (HIF-α) correlaciona-se com o crescimento da vascularização no circuito AV e representa um estímulo para o crescimento vaso ^40.

Figura 1:. Esquema de um lacete AV no modelo de rato O circuito AV consiste em três segmentos: o veia (V), o arterial (A) e o segmento de enxerto de interposição de enxerto venoso (IVG). O loop AV pode ser incorporado em uma câmara fechada implantação (C) para a indução da vascularização intrínseco. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: AV laço de operação no rato (A):.. A localização do feixe femural no lado interior dos membros posteriores do rato (B / C): Preparação do feixe vascular femoral na esquerda e direita da virilha de o rato. Os vasos são separados (D), o enxerto de veia de interposição é colhido a partir do lado direito (E) e anastomosados com a veia femoral (F) e na artéria femoral do lado esquerdo para um ciclo de AV (L, a seta indica as anastomoses). Os vasos de alça são transferidos para a câmara de pré-cheio com a implantação de uma matriz (H) e, após o enchimento completo (I), a tampa é fechada (J). A = artéria femoral, V = veia femoral, N = nervo femoral, IVG = enxerto venoso de interposição. bar escala de 5 mm (DJ).tp_upload / 54676 / 54676fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: A visualização da vascularização no Loop modelo de rato AV (A):. Micro-CT, após a perfusão com um agente de contraste (amarelo vasos perfundidos) (B):. Hematoxilina-eosina de um substituto de osso β-TCP / HA com MSC implantado no modelo de ansa AV rato durante 6 semanas. Os vasos de loop AV são perfundidos com nanquim (cor preta). Barra de escala 1 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Por mais de uma década, temos utilizado com sucesso o ciclo (AV) arteriovenosas para fins de engenharia de tecidos e estudando a angiogênese in vivo no modelo animal de pequeno porte. Foi possível demonstrar que este modelo microcirúrgico é muito bem adequado para a engenharia de tecidos diferentes e que também pode ser utilizado para a angiogénese ou antiangiogenesis estudos.

Importância da Técnica em Matéria de Existentes / Métodos Alternativos
Tecidos ou órgãos de engenharia exigem uma rede de vasos sanguíneos funcional para fornecer os nutrientes e oxigênio que necessitam para a sua sobrevivência e integração bem sucedida após o transplante no local do defeito ^41. Um número de diferentes estratégias prevascularization foram desenvolvidos ao longo das últimas décadas, que podem ser diferenciadas de acordo com a in vitro vs. in vivo e extrínsecos vs. abordagens intrínsecas.

Andaimes pode ser fabricaTed com estruturas e semeadas com células vasculares tais como células endoteliais ou as células progenitoras in vitro ⁴² de forma tubular. Por outro lado, para prevascularization in vivo, andaimes são implantados numa zona altamente vascularizados, tais como tecido muscular ou subcutânea ^21. Posteriormente, estas construções extrinsecamente vascularizados podem ser transplantadas no local do defeito. No entanto, a desvantagem destas abordagens é a falta de ligação microcirúrgico com os vasos do receptor após o transplante. Particularmente no caso de construções de grande escala, conexão imediata com a vasculatura do hospedeiro é essencial para o fornecimento imediato de engenharia de tecidos ^43. A solução óbvia e mais promissor para este problema encontra-se na geração de um tecido ou órgão vascularizado intrinsecamente por um eixo vascular, tais como o modelo de ansa AV.

Além de utilizar o método de circuito AV como descrito acima, a vascularização axial pode alpor isso ser induzida usando feixes AV em vez ^{de 44} ou apenas uma embarcação, tais como a artéria epigástrica ^45. No entanto, em várias publicações, o modelo de ansa AV provou ser superior em relação ao grau de vascularização e a quantidade de formação de novo tecido. Tanaka et al. Compararam as duas abordagens metodológicas e formação de tecido significativamente mais elevada observada e um maior grau de capilares em desenvolvimento no circuito em comparação com o grupo de bundles ^46. Dong et ai. também realizado um estudo usando o circuito AV ou feixe AV abordagens para engenharia de tecidos ósseos num modelo de coelho, que também mostraram significativamente maior densidade vascular no circuito em comparação com o grupo de feixe ^47. Fomos capazes de confirmar estes resultados, bem como mostrar em um estudo anterior que o modelo de circuito AV tem uma maior capacidade de angiogênese ^48.

Para o melhor do nosso conhecimento, não existe um modelo comparável para analisarvascularização in vivo num ambiente isolado e bem caracterizado. Por conseguinte, o modelo de ansa AV representa uma ferramenta poderosa para avaliar como os diferentes tipos de células ou factores de crescimento ou contribuir para a formação de vascularização processos rede de vasos em diferentes tecidos sem perturbações das estruturas circundantes, tais como factores de crescimento ou células invasoras.

Limitações da técnica
No entanto, um desafio significativo do modelo proposto é a alta complexidade da cirurgia. Por um lado, o tratamento de defeitos, utilizando o modelo de ansa AV requer um procedimento de duas etapas - prevascularization do andaime e o transplante no local do defeito. Isto significa que o paciente tem que se submeter a duas cirurgias. Além disso, técnicas de microcirurgia são um pré-requisito necessário para os navios submilímetro anastomosantes bem sucedidos ^49. Portanto, o pacote AV às vezes é considerado mais útil para a aplicação clínica desde que eut também oferece promissora, embora menos, o potencial para a angiogênese e geração de tecido em comparação com o ciclo AV ^46. No entanto, esta operação pode ser aprendido passo-a-passo até mesmo por não-cirurgiões, utilizando tubos de calibre de silício pequenos para a formação no início e depois os vasos de animais mortos (por exemplo, pés de galinha) antes de fazer a operação de circuito AV em um animal vivo. Em contraste, a maioria praticados micro-cirurgiões podem executar esta operação com apenas um curto tempo de treinamento.

Passos críticos dentro do Protocolo
Em geral, devido ao pequeno calibre dos vasos, há o risco de formação de trombos e de encerramento dos vasos de ansa. No entanto, no modelo de rato 80% -100% das ansas, em média foram patente usando apenas de curto tempo de heparina anticoagulante pós-cirurgia ^{28,30,31,34,38,39.}

Além disso, devido à alta complexidade da cirurgia vai demorar um par de horas (dependendo do tele experiência do cirurgião). É essencial verificar a anestesia adequada dos animais durante toda a operação e fornecer adequadamente infusão para manter uma pressão sanguínea adequada. Durante o período pós-operatório é de grande importância para verificar a saúde do animal várias vezes, para administrar analgésicos / antibióticos e verificar a ferida operação. Uma vez que na maioria dos casos, a implantação de uma câmara isolada é realizada, é possível que a infecção no interior da câmara ocorre sem notar. Portanto, é muito importante para manter a esterilidade durante toda a operação e a administração de antibióticos devem ser cuidadosamente feito ao longo de um período de 3 - 5 dias.

Modificações do Protocolo
A câmara pode ser ajustado individualmente para o tamanho e forma do defeito. Além disso, também membranas pode ser usado para envolver o circuito AV como realizada por Manasseri et ai. ^50. Além disso, o andaime, supplemented células e os factores de crescimento podem ser escolhidos de acordo com os diferentes tipos de tecidos. Recentemente, miomas et ai. Génicos combinados abordagens terapêuticas com sucesso com o modelo de ansa AV e poderia induzir aumento do crescimento dos vasos por transdução com VEGF165 ^51. Recentemente, foi ajustado o modelo de loop AV rato para fins de engenharia de tecido muscular. Em vez dos vasos femorais, foram utilizados a veia epigástrica e artéria safena, o que permitiu a implantação do nervo obturador no andaime axial vascularizado pela inervação motora ( "modelo de circuito EPI") ^36. Além implantação de um nervo motora, o neurotization do tecido ósseo engenharia construções com nervos sensoriais é relatado para ser benéfico para a osteogênese reforçada e melhor reparação de defeitos ósseos ^52. O loop AV induz morbidade do sítio doador mínimo e podem ser criados em vários locais do corpo ^52. Seria possível a utilização de vasos superficiais em outros locais deo corpo para a geração do circuito AV ou ainda a utilização de outros animais tais como o coelho ou o modelo de ratinho.

Aplicações futuras ou chegar depois de dominar esta técnica
Recentemente, o nosso grupo de trabalho implantada uma linha bem caracterizado murino embrionário de células progenitoras endoteliais (CPE) (T17b) expressando a proteína de ligação-1 (GBP-1) guanilato - um inibidor de marcador e intracelular das funções das células endoteliais, tais como a proliferação, a migração ea invasão - no modelo de circuito AV rato. A capacidade anti-angiogénico de diferenciadas GBP-1-CPE pode ser demonstrado por uma redução significativa na densidade dos vasos sanguíneos nas construções de laço AV. No que respeita à aplicação clínica, o pró-inflamatória antiangiogênico GTPase GBP-1 poderia abrir novas avenidas de terapias antiangiogênicas, por exemplo., Por câncer ou outras doenças ^53. Com base neste estudo, é concebível que o modelo de ansa Av pode ser utilizada para estabelecer um patológicarede de vascularização para análise e possível modulação. Por exemplo, este modelo proporciona uma oportunidade ideal para obter uma melhor compreensão da angiogénese de tumores, os factores que influenciam e o papel exacto dos diferentes células envolvidas na formação da rede de vasos do tumor, tais como CPE, as células tumorais e as células estaminais ^54. In vivo em modelos de cancro são frequentemente realizadas em ratinhos geneticamente modificados para simular os processos e as características de crescimento de diferentes tipos de cancro humano e provaram ser excelentes para o desenvolvimento de fármacos e ensaios pré-clínicos ^55. Além disso, existem modelos de xenoenxerto para o transplante de tumores em animais experimentais tais como ratinhos imunocomprometidos ^56. Uma abordagem mais clinicamente relacionadas envolve o transplante do tumor do paciente, conhecido como "modelos de ratinho personalizados" ou "xenoenxertos de tumores de pacientes modelos" ^57. No entanto, estes modelos não são práticos para estudar a influência de um factor de crescimento ou de origem celular único sem efeitos a partir do tecido circundante.

O modelo de ansa AV torna possível a utilização de métodos de engenharia de tecidos para estudar a biologia do tumor. Esta é definida como a "engenharia tumor" por Ghajar et ai. e envolve "a construção de modelos de cultura complexos que recapitulam aspectos do microambiente do tumor in vivo para estudar a dinâmica de desenvolvimento de tumores, progressão, e a terapia em várias escalas" ^58. Um ambiente de tumor pode ser construído no interior da câmara de implante isolado, que permite uma análise precisa das interacções célula-célula, a angiogénese, a modulação, o aumento e a inibição. Além disso, o modelo de ansa AV pode ser benéfico para o desenvolvimento de terapias ou validando relativo à interrupção da neoangiogénese ou a inibição do crescimento do tumor.

Usando esta abordagem para a indução de vascularização, é possível Engineer tecidos em um tamanho clinicamente relevante. Em outros estudos, fomos capazes de gerar tecido ósseo axial vascularizado para o transplante com um volume significativo de cerca de 15 cm³ em um tempo relativamente curto de 12 semanas ^59,60. A fim de traduzir esses achados para a prática clínica, um estudo de prova de princípio usando o modelo de defeito tíbia será realizado no futuro próximo prévia para aplicação em humanos. Como um primeiro passo, foi possível demonstrar com sucesso na engenharia de tecido ósseo situ num grande volume de defeito num cenário clínico com estabilidade a longo prazo ^61. Aplicando o modelo de ansa AV descrito faz com que seja possível proporcionar uma terapia adaptada aos requisitos individuais do paciente. Com base em nossos resultados a ideia do corpo humano em si servindo como um biorreator vivendo ainda é uma grande promessa para o futuro.

The authors have nothing to disclose.

Nós gostaríamos de agradecer as seguintes instituições para apoiar a nossa investigação circuito AV: Staedtler Stiftung, Dr. Fritz Erler Fonds, Else Kröner Fesenius Stiftung, Baxter Healthcare GmbH, DFG, IZKF / ELAN / EFI / Instituto de Gênero e Diversidade, a Forschungsstiftung Medizin , Friedrich-Alexander Universidade de Erlangen-Nürnberg (FAU), Fundação aO, Manfred Roth Stiftung, Xue Hong, Hans Georg Geis Foundation, Deutscher Akademischer Austauschdienst (DAAD), na Alemanha, e do Ministério do Ensino Superior e da Investigação Científica, Iraque. Nós gostaríamos de agradecer a Stefan Fleischer, Marina Milde, Katrin Köhn e Ilse Arnold-Herberth por sua excelente suporte técnico.