حلقة شرياني (AV) في نموذج الحيوانات الصغيرة لدراسة الأوعية الدموية وهندسة الأنسجة أوعية دموية

وصفنا نهج المجهرية لتوليد حلقة شرياني (AV) كنموذج للتحليل الأوعية الدموية في الجسم الحي في بيئة معزولة، وتميزت بشكل جيد. هذا النموذج هو ليس فقط مفيدا للتحقيق في الأوعية الدموية، ولكن أيضا مناسبة بشكل مثالي للهندسة أوعية دموية محوريا والأنسجة استنساخها.

A functional blood vessel network is a prerequisite for the survival and growth of almost all tissues and organs in the human body. Moreover, in pathological situations such as cancer, vascularization plays a leading role in disease progression. Consequently, there is a strong need for a standardized and well-characterized in vivo model in order to elucidate the mechanisms of neovascularization and develop different vascularization approaches for tissue engineering and regenerative medicine.

We describe a microsurgical approach for a small animal model for induction of a vascular axis consisting of a vein and artery that are anastomosed to an arteriovenous (AV) loop. The AV loop is transferred to an enclosed implantation chamber to create an isolated microenvironment in vivo, which is connected to the living organism only by means of the vascular axis. Using 3D imaging (MRI, micro-CT) and immunohistology, the growing vasculature can be visualized over time. By implanting different cells, growth factors and matrices, their function in blood vessel network formation can be analyzed without any disturbing influences from the surroundings in a well controllable environment.

In addition to angiogenesis and antiangiogenesis studies, the AV loop model is also perfectly suited for engineering vascularized tissues. After a certain prevascularization time, the generated tissues can be transplanted into the defect site and microsurgically connected to the local vessels, thereby ensuring immediate blood supply and integration of the engineered tissue. By varying the matrices, cells, growth factors and chamber architecture, it is possible to generate various tissues, which can then be tailored to the individual patient's needs.

معظم الأنسجة والأعضاء في جسم الإنسان تعتمد على شبكة الاوعية الدموية الوظيفية التي تزود المواد الغذائية، وتتبادل الغازات ويزيل النفايات. خلل في هذا النظام بسبب مشاكل في الأوعية الدموية المحلية أو النظامية يمكن أن يؤدي إلى العديد من الأمراض الحادة. وعلاوة على ذلك، في المجالات البحثية مثل هندسة الأنسجة والطب التجديدي، شبكة الأوعية الدموية وظيفية داخل أنسجة ولدت بشكل مصطنع أو الأعضاء المزروعة لا غنى عنها لتطبيق السريرية ناجح.

على مدى عقود كان الباحثون بالتحقيق في الآليات الدقيقة تشارك في الأوعية الدموية المتزايدة للحصول على نظرة أعمق في حالات المرضية من أجل إيجاد تدخلات علاجية جديدة وتوفير الوقاية أفضل من اضطرابات الأوعية الدموية. في الخطوة الأولى، العمليات الأساسية مثل التفاعلات خلية خلية أو تأثير الجزيئات في خلايا الأوعية الدموية وعادة ما تكون حققت فيها في المختبر 2D أو 3Dالتجارب. نماذج 2D التقليدية من السهل القيام بها، راسخة، وساهمت إلى حد كبير في فهم أفضل لهذه العمليات. لأول مرة في عام 1980، فوكمان وآخرون. ذكرت في البذر الأوعية الدموية في المختبر من خلايا بطانة الأوعية الدموية الشعرية في الجيلاتين لوحات المغلفة ^1. هذا أعطى على الفور وسيلة لنشر العديد من تجارب أخرى الأوعية الدموية 2D على أنبوب الخلايا البطانية تشكيل فحص ^2، فحص الهجرة ⁽³⁾ وشارك في زراعة أنواع مختلفة من الخلايا ^4، فضلا عن غيرهم. لا تزال تستخدم هذه المقايسات اليوم ومقبولة وفقا لمعايير في أساليب المختبر.

ومع ذلك، هذا الإعداد التجريبية ليست دائما ملائمة لدراسة في الجسم الحي سلوك الخلية لأن معظم أنواع الخلايا تتطلب بيئة 3D لتشكيل هياكل الأنسجة الفسيولوجية ذات الصلة ^5. ويمكن أن يتبين أن بنية مصفوفة 3D هي حاسمة لmorphogenesi الشعريةالصورة ⁶ و أن التفاعلات خلايا إضافية مصفوفة الخلوية (ECM) والثقافة 3D الظروف تنظم العوامل الهامة التي ينطوي عليها ورم الأوعية الدموية ^7. تقدم مصفوفة 3D المدخلات الميكانيكية المعقدة، يمكن ربط البروتينات المستجيب وإقامة الأنسجة على نطاق التدرجات تركيز المذاب. وعلاوة على ذلك، يعتبر أنه من الضروري من أجل التشبه في المخلق الجسم الحي وخطوات إعادة عرض في أنسجة معقدة ^5. في هذه الأنظمة، سواء الأوعية الدموية وتكون الأوعية يمكن دراستها. بينما يصف الأوعية الدموية وتنتشر من الشعيرات الدموية من قبل الإيجاد الأوعية الدموية ^8، يشير تكون الأوعية في دي نوفو تشكيل الأوعية الدموية من خلال الخلايا البطانية أو الأسلاف من ^9،10. يوصف نضوج السفن في عملية تسمى "تخلق الشرايين" عبر تجنيد خلايا العضلات الملساء ^11. وعائي المنشأ النموذجية في نموذج المختبر هو تنتشر الخلايا البطانية من أحادي الطبقة الحاليةالصورة المصنف كما أحادي الطبقة على الأسطح هلام، على سطح المجهرية جزءا لا يتجزأ من داخل هلام أو عن طريق بناء الأجسام الشبه الكروية خلية البطانية ^12. في نماذج vasculogenic وشرك الخلايا البطانية واحدة في هلام 3D. تفاعلها مع الخلايا البطانية المجاورة لتشكيل الهياكل والشبكات دي نوفو الأوعية الدموية، وعادة في تركيبة مع خلايا داعمة ^12.

ومع ذلك، حتى معقدة 3D نماذج في المختبر لا يمكن أن تحاكي في إعدادات الجسم الحي تعطى تماما وافر من خلية خلية وخلية ECM التفاعلات ^13. المواد مع ارتفاع النشاط في المختبر لا تظهر تلقائيا على نفس الآثار في الجسم الحي، والعكس بالعكس ^(14). للاطلاع على تحليل شامل من الأوعية الدموية العمليات هناك حاجة ملحة إلى تطوير في النماذج الحية التي تحاكي الوضع على نحو أفضل في الجسم. وصفت مجموعة كبيرة من الجسم الحي في فحوصات الأوعية الدموية في الأدب، بما في ذلكالفرخ فحص مشيمائي غشاء (CAM)، ونموذج الزرد، والأوعية الدموية فحص القرنية، الظهرية نموذج كيس الهواء، وغرفة ظهري طبقات الجلد، ونماذج ورم تحت الجلد ^14. ومع ذلك، غالبا ما ترتبط هذه المقايسات مع القيود، مثل التغيرات المورفولوجية السريعة، ومشاكل في الشعيرات الدموية الجديدة المميزة من تلك الموجودة بالفعل في مقايسة كأم، أو مساحة محدودة في القرنية الأوعية الدموية فحص ^15. وعلاوة على ذلك، يتم استخدام أنظمة غير الثدييات (على سبيل المثال، نموذج الزرد ^16)، الأمر الذي يؤدي إلى مشاكل في زرع الأعضاء ^17. في نموذج ورم تحت الجلد، الأوعية الدموية التي تنشأ فقط من الورم نفسه لا يمكن تحليلها منذ الأنسجة المجاورة يساهم إلى حد كبير في عملية الأوعية الدموية. وعلاوة على ذلك، يمكن الأنسجة المحيطة لها دور حاسم في تشكيل المكروية ورم ^18.

ليس فقط لدراسة الأوعية الدموية أو تكون الأوعية هناك شمال شرق قويإد لموحدة وتتميز بشكل جيد في نموذج الجسم الحي ولكن أيضا لدراسة استراتيجيات الأوعية الدموية المختلفة في هندسة الأنسجة والطب التجديدي. اليوم، الجيل من الأعضاء أو الأنسجة الاصطناعية معقدة ممكن سواء في التجارب المختبرية والحية. يوفر 3D bioprinting تقنية تصنيع حسب الطلب لتوليد معقدة 3D الأنسجة الحية وظيفية ^(19). وعلاوة على ذلك، المفاعلات الحيوية يمكن استخدامها لتوليد الأنسجة ²⁰ أو حتى جسده يمكن استخدامها في مفاعل حيوي ^21. ومع ذلك، فإن العائق الرئيسي لنجاح تطبيق الأنسجة ولدت بشكل مصطنع هو عدم وجود الأوعية الدموية داخل بنيات هندسيا. الاتصال الفوري إلى الأوعية الدموية المضيف بعد زرع هو شرط أساسي للبقاء على قيد الحياة، وخاصة في حالة الأنسجة الاصطناعية على نطاق واسع أو الأجهزة.

مختلفة في المختبر أو في استراتيجيات prevascularization الجسم الحي كانت جمعةطورت لإنشاء الأوعية الدموية الدقيقة وظيفي في بنيات قبل زرع ^22. أدى غرس سقالة مع المختبر في الشعيرات الدموية المهندسة متشكلة على الجلد الظهرية من الفئران لمفاغرة السريعة من الأوعية الدموية الفئران خلال يوم واحد ^23. في المقابل، كروي ثقافة مشتركة تتألف من خلايا الجذعية الوسيطة الإنسان والوريد السري الخلايا البطانية الإنسان تجميعها في شبكة prevascular ثلاثية الأبعاد تطورت أكثر بعد في الجسم الحي زرع. ومع ذلك، مفاغرة مع الأوعية الدموية المضيف اقتصر ^24. قبل كل شيء، في عيوب سيئة أوعية دموية، مثل المناطق الميتة أو المشع، وهذا ما يسمى الأوعية الدموية خارجي - لنشوب السفن من المنطقة المحيطة بها إلى السقالة - غالبا ما يفشل. الأوعية الدموية جوهري، من ناحية أخرى، تقوم على محور الأوعية الدموية كمصدر الشعرية الجديدة تنتشر في سقالة ^25. باستخدام نهج الأوعية الدموية محوري، والأنسجة المهندسة يمكن زرعها مع محور الأوعية الدموية وتوصيل سفن محلية في موقع المتلقي. مباشرة بعد الزرع، ويدعم الأنسجة كافية من الأوكسجين والمواد المغذية، مما يخلق الظروف المناسبة لتحقيق التكامل الأمثل.

نظرا لمحدودية توافر نماذج للتحقيق في الجسم الحي الأوعية الدموية واعترافا بالأهمية المتزايدة لتوليد الأنسجة أوعية دموية محوريا، قمنا بتطوير نهج المجهرية من إيرول وسبيرا أيضا على توليد (AV) حلقة شرياني في نموذج حيواني ^26. استخدام غرفة زرع مغلقة تماما يجعل هذه الطريقة مناسبة تماما للغاية لدراسة تشكيل الأوعية الدموية تحت "رقابة"، وتتميز بشكل جيد في ظروف الجسم الحي (الشكل 1). هذا النموذج ليس مفيدا فقط للتحقيق في الأوعية الدموية ولكن أيضا مناسبة بشكل مثالي لالأوعية الدموية المحوري السقالات لانجين الأنسجةأغراض eering.

وافقت لجنة رعاية الحيوان من جامعة فريدريش ألكسندر إيرلانغن نورنبرغ (وحدة التحليل المالي) وحكومة فرانكونيا الأوسط، ألمانيا، كل هذه التجارب. للتجارب، ذكور فئران لويس مع وزن الجسم من 300 - استخدمت 350 غرام.

1. حلقة نموذج شرياني في الجرذ

1. إجراء زرع (الشكل 2)
   1. للتخدير استخدام مربع بلاستيكي خاص متصلة عبر أنبوب إلى المرذاذ الأيزوفلورين وأغلقت غطاء. بدوره على إمدادات الغاز وتدفق متر بين 0،8-1،5 لتر / دقيقة.
   2. وضع الفئران في مربع من البلاستيك الحث وختم أعلى. تشغيل المرذاذ الأيزوفلورين إلى 5٪.
   3. مراقبة بعناية الجرذ أثناء التخدير. بعد 3-4 دقائق، سيتم تخدير الفئران.
   4. تأكيد التخدير المناسبة: فقدان المنعكس التقويمي، وفقدان منعكس الجفن، منعكسة الانسحاب، منعكسة القرنية إيجابي.
   5. إزالة الفئران من منطقة الجزاء، وتحقق لهاالوزن لحساب المخدرات. تطبيق مرهم العين لمنع جفاف بينما تحت التخدير.
   6. إدارة الدواء الألم والمضادات الحيوية (مثل، 7.5 ملغ / كغ إينروفلوكساسين تحت الجلد (SC)، 12.5 ملجم / كجم ترامادول و 100 ملغم / كغم ميتاميزول على حد سواء عن طريق الوريد (رابعا)). إدارة بلورانيات-تكييفها الوزن أثناء التشغيل (على سبيل المثال، 30 مل / كغ الشوري).
   7. وضع فأر على ظهرها على لوحة ظاهرة الاحتباس عند 37 درجة مئوية تحت التخدير مع 1-2٪ استنشاق الأيزوفلورين تدار عن طريق قناع.
   8. مراقبة التخدير بشكل صحيح وزيادة الأيزوفلورين إذا كان مستوى التخدير منخفض جدا (حركة الفئران، استجابة للألم، لهجة الفك، أي خسارة من ردود الفعل (انظر 1.1.4.)، معدل ضربات القلب تزداد). يجب الحرص على عدم جرعة زائدة الأيزوفلورين (فقدان ردود الفعل القرنية، وارتفاع معدل ضربات القلب، وانخفاض في تشبع الأكسجين). استخدام عداد نبض خاص للحيوانات الصغيرة للتحقق من تشبع الأكسجين (95-100٪) ومعدل ضربات القلب (250-450 / دقيقة) من الفئران. خلال operatiعلى درجة حرارة رصد من الفئران (36 - 40 درجة مئوية) وضبط درجة حرارة لوحة ظاهرة الاحتباس إذا لزم الأمر.
   9. حلق الجوانب الداخلية من الأطراف الخلفية مع الحلاقة الكهربائية وتطهير المنطقة مع المطهرات. نشر أطرافه الخلفية واصلاحها مع شريط لاصق.
   10. وضع الفئران تحت المجهر الجراحي وتغطية الفئران مع اللف العقيمة. ضمان أن يتم تنفيذ الإجراء عملية كله تحت ظروف معقمة.
   11. فتح الجلد في منتصف الفخذ الأيسر مع شق طولي من الركبة العليا إلى أعلى الفخذ باستخدام مشرط (رقم 10).
   12. قطع الأنسجة تحت الجلد واللفافة في طبقات من حوالي 3 سم في الطول باستخدام مقص تشريح وmicroforceps حتى يتعرض الحزمة الوعائية الفخذ من الشريان الحوض في الفخذ إلى التشعب من الشريان الفخذي في الركبة.
   13. فصل السفن وإزالة البرانية باستخدام مقص البرانية وmicroforceps.
   14. تخثر الجانب بالمرابع باستخدام تخثر كهربائي. تغطية مجال التعاون مع ضغط رطبة.
   15. فتح الجلد على الجانب الأيمن كما هو موضح في الجانب الأيسر، 1.1.11 - 1.1.14.
   16. حصاد الكسب غير المشروع وريدي، ligate الوريد الفخذي الأيمن من تخثر كهربائي على الداني والقاصي الغايات على مسافة من 1 - 1.5 سم.
   17. إزالة الكسب غير المشروع وريدي مع microforceps وتدفق الكسب غير المشروع وريدي مع الحل الهيبارين (50 وحدة دولية / مل في 0.9٪ محلول كلوريد الصوديوم) باستخدام قنية الري وتحويلها إلى الفخذ الأيسر. تغطية ميدانية عملية في الجانب الأيمن مع ضغط رطبة.
   18. Ligate الوريد الفخذي على الجانب الأيسر قريب في المنطقة الأربية مع المشبك microvessel. تخثر الوريد الفخذي بشكل أقصى من التخثر الكهربائي، في الركبة العليا قبل المتفرعة، على مسافة حوالي 2 سم.
   19. لمفاغرة ربط نهاية القريبة من الكسب غير المشروع وريدي مع نهاية القريبة من الوريد بحلول نهاية إلى نهاية مفاغرة مع sutur 11-0ه. استخدام حوالي 8 غرز توقف. بادئ ذي بدء وضع الغرز الأولين في المواقف 12:00 و06:00. ثم، وضعت في 2-3 الغرز المزيد من بين هذه النقاط على الجانب الأمامي ومن ثم وضعت 2-3 الغرز أكثر في الجانب الخلفي.
   20. Ligate الشريان الفخذي في نفس الطريق وصفها لالوريد الفخذي (1.1.18). تأكد من عدم والملتوية السفن حلقة. يفاغر النهاية البعيدة من الكسب غير المشروع وريدي مع نهاية القريبة من الشريان كما هو موضح في الوريد الفخذي (الخطوات 1.1.19).
   21. إدارة 25 وحدة دولية الهيبارين عن طريق الوريد. تأكد مرة أخرى لا يتم تحريفها السفن حلقة، إزالة المشابك والتحقق من وجود تسرب والمباح من الحلقة لمدة 5 دقائق.
   22. بابافيرين سال لعابه (على سبيل المثال، 4 ملغ / مل) على السفن لمنع تقلصات في الأوعية الدموية. إذا كان هناك المباح، حلقة توسع ونبض الشريان يمكن ملاحظة.
   23. ملء مسبق غرفة زرع مع النصف الأول (حوالي 500 ميكرولتر) من المصفوفة (على سبيل المثال </ م>، هيدروجيل أو مصفوفة العظام مع أو بدون خلايا). تضمين حلقة في غرفة الزرع.
   24. تملأ الغرفة زرع مع النصف الثاني من المصفوفة إلى إجمالي حجم 1000 ميكرولتر. ختم الغرفة مع غطاء غرفة.
   25. إصلاح غرفة زرع على الفخذ مع غير قابل للامتصاص 6-0 خياطة. إصلاح غطاء غرفة مع غير قابل للامتصاص 6-0 خياطة. وقف نزيف ممكن مع تخثر كهربائي.
   26. إغلاق الجلد مع امتصاص 4-0 الغرز. تغطية الجرح مع رذاذ الألمنيوم.
   27. إدارة المضادات الحيوية والمسكنات (على سبيل المثال، 7.5 ملغ / كغ إينروفلوكساسين الشوري، ترامادول 12.5 ملغ / كغ في نظام التشغيل (ص) (من خلال مياه الشرب) لمدة 3 - 5 ايام وبعد ذلك يتوقف على سلوك الفئران).
   28. تحويل المرذاذ خارج والسماح للجرذ للتنفس إمدادات الغاز حتى يبدأ لإيقاظ.
   29. وضع الفئران في مربع مع دعم الحراري ومراقبة بعناية حتى تعافى تماما.
   30. لا تترك الامم المتحدة الفئرانحضر حتى استعاد وعيه كافية للحفاظ على الاستلقاء القصية.
   31. لا عودة الفئران للشركة من الحيوانات الأخرى حتى تعافى تماما.
2. الإجراءات Explantation
   1. أداء explantation بعد وقت قصير أو زرع منذ فترة طويلة (وفقا لتصميم الدراسة، للحصول على أمثلة من فضلك انظر المراجع 27-32). تخدير الفئران وفقا لخطوات 1.1.1.-1.1.9.
   2. فتح جلد البطن مع مشرط (رقم 10)، وتحرك الأمعاء جانبا مع ضغط. فضح الشريان الأورطي البطني والوريد الأجوف الذنبية باستخدام قطعة قطن.
   3. يقني؛ يدخل القنية الشريان الأورطي البطني (على سبيل المثال، قياس 24 قنية البلاستيك) وقطع الوريد الأجوف الذنبية مع مقص تشريح.
   4. تدفق الشريان الأورطي البطني مع 0.9٪ محلول كلوريد الصوديوم تحتوي على 100 وحدة دولية / مل الهيبارين حتى السائل تسرب واضح. يروي الشريان الأورطي مع 30 مل من محلول الارواء (على سبيل المثال، على النقيض من وكيل أو الهند فيك).
   5. الموت ببطء الفئران عن طريق الحقن من جرعة قاتلة من embutramide، يوديد mebezonium، حل تتراكائين هيدروكلوريد عن طريق الحقن (0،1-0،2 مل / كغ) في التخدير العميق.
   6. Ligate الشريان الأورطي البطني والوريد الأجوف الذنبية مع غير قابل للامتصاص خياطة 4-0.
   7. إغلاق منطقة الجرح المفتوح مع 1-2 المشابك. تخزين الفئران لمدة 24 ساعة في 4 درجات مئوية (علاج من حل التروية).
   8. وضع فأر على ظهرها. نشر أطرافه الخلفية واصلاحها مع شريط لاصق.
   9. فتح الجلد فوق غرفة مع شق طولي مع مشرط (رقم 10).
   10. إزالة النسيج الضام من الغرفة وعنيق حلقة باستخدام مقص تشريح وmicroforceps. قطع عنيق حلقة على مسافة 1 سم من افتتاح غرفة مع مقص تشريح وإزالة الغرفة.
   11. فتح غطاء غرفة وإزالة بعناية بناء من غرفة مع ملقط وإصلاحه في 4٪ محلول الفورمالين مخزنة لمدة 24 ساعة في غرفةدرجة الحرارة. بعد ذلك استخدم بناء على التصوير المقطعي المحسوبة الصغيرة 3D أو البارافين جزءا لا يتجزأ للتحليل النسيجي ^30.

هندسة الانسجة
لأغراض هندسة الأنسجة العظمية، تم زرع عدد من بدائل العظام المختلفة في الصغيرة الفئران نموذج حيواني AV حلقة ^{27،28،33،34.} يمكن تماما أن أظهرت الأوعية الدموية التي كتبها 3D التصوير المقطعي المحسوبة الصغرى (الدقيقة CT) (الشكل 3A). وكانت الأوعية الدموية مصفوفة البقري معالجة العظام إسفنجي (PBCB) أعلى بكثير في مجموعة حلقة مقارنة بالمجموعة دون الأوعية الدموية. شبكة الأوعية الدموية المتزايدة باستمرار وmaturating وضعت داخل غرفة زرع أكثر من 8 أسابيع. ما بين 4 و 8 أسابيع، لوحظ نمو مستمر من الأنسجة أوعية دموية نحو مركز يبني، في حين تم الكشف عن أي زيادة في مجموعة غير أوعية دموية ^33. أدى Prevascularization المصفوفة PBCB لمدة 6 أسابيع في نموذج AV حلقة لبقاء متفوقة من بانيات حقن مقارنة بانيات السيطرة. وعلى النقيض من مجموعة السيطرة، تم الكشف عن التعبير عن الجينات العظام محددة في مجموعة حلقة AV مع بانيات زرع ^28. ولمزيد من المصفوفة، كان زرعها الزجاج النشطة بيولوجيا متكلس جنبا إلى جنب مع هلام الليفين في الحلقات AV من الفئران. بعد 3 أسابيع، وقد وضعت شبكة كثيفة من الأوعية التي شكلت حديثا يتبين من CT الدقيقة والأنسجة ^(27).

تم تعديل غرفة زرع من أجل الإسراع سقالة الأوعية الدموية. باستخدام غرفة التيتانيوم مثقبة، وأيد الأوعية الدموية جوهري من قبل السفن خارجي من الأنسجة المحيطة بها. في 2 أسابيع فقط بعد غرس هيدروكسيباتيت β-tricalciumphosphate (β-TCP / HA) / مصفوفة الليفين، تم ربط 83٪ من السفن إلى حلقة AV مع الزيادة المستمرة مع مرور الوقت وصلت اتصال 97٪ بعد 8 أسابيع ^34. مع زرع نخاع المستمدة الخلايا الجذعية الوسيطة 5 × 10 ⁶ العظام (MSC) والمخلق للعظم بروتين 2 (BMP-2)، زيادة كبيرة في تكوين العظام مقارنة مع BMP-2 أو MSC الجماعات وحدها يمكن أن يسببها. في 6 و 12 أسبوعا، وكانت المصفوفة الفيبرين المتدهورة تماما وحلت محلها نسيج أوعية دموية للغاية الضام في جميع الفئات (الشكل 3B 6 أسابيع الزرع). كان هناك انخفاض كبير في عدد السفن في المجموعة BMP-2 / MSC بين 6 و 12 أسابيع وبعد 12 أسبوعا في المجموعات الأخرى. وربما كان هذا بسبب نضوج شبكة الأوعية الدموية أو ترتيبات التعاقد من الهياكل العظمية مما يؤدي إلى تشكيل شبكة الأوعية الدموية محدود ^32.

إلى جانب العظام والأنسجة الأخرى مثل العضلات أو الكبد يمكن أيضا أن هندسيا في نموذج AV حلقة.

للهندسة أوعية دموية محوريا الأنسجة العضلية، وأجريت التجارب مع myoblasts الأولية في الفيبرين مصفوفة AV حلقة بها. بعد prevasculالوقت arization من 2 أسابيع لمدة 2 و 4 و 8 أسابيع، وقد تم زرع 1 × 10 ⁶ myoblasts في غرفة AV حلقة. يمكن كشفه myoblasts المزروعة حتى بعد 8 أسابيع باستخدام carboxyfluorescein ثنائي الأسيتات succinimidyl استر (CFDA) وضع العلامات. حافظ الخلايا ملامحهم عضلي داخل المصفوفة الفيبرين والتعبير عن علامات العضلات الخاصة MEF-2 وdesmin كان ايجابيا بعد 4 أسابيع. ومع ذلك، كان التعبير علامة الجينات عضلي سلبي بعد 8 أسابيع، والتي كانت ربما يرجع ذلك إلى غياب المحفزات عضلي والاستيعاب السريع لمصفوفة الفيبرين ^35. لزيادة تحفيز عضلي، وقد تم تطوير هذا التعديل الجديد للحلقة الفئران AV باستخدام الوريد شرسوفي بدلا من الوريد الصافن من أجل تحقيق المزيد من المواقع القريبة من غرفة العزل. ومن هنا، وقد يسر هندسيا التأسيس إضافية من العصب مصراع المحرك. باستخدام هذا AV حلقة تعديل، والتي يشار اليها على انها حلقة برنامج التحصين الموسع، ونحن يمكن أن تظهر د عضليifferentiation من myoblasts-زرع التعاون وMSC ^36.

لهندسة الأنسجة الكبدية تم زرع 4 × 10 ⁶ PKH-26 المسمى خلايا الكبد الجنين داخل مصفوفة الليفين في نموذج حلقة الفئران AV لمدة 2 أسابيع. في السيطرة على المجموعة، تم زرع مصفوفات دون حلقة AV والمصفوفات خالية من الخلايا. نشأت الشعيرات الدموية وظيفية من السفن AV حلقة ولوحظ أوعية دموية للغاية الجدد الأنسجة داخل غرفة بعد 14 يوما من الزرع، كما يتضح من CD31 تلطيخ والهند الحبر وضع العلامات. لم يكن هناك فرق بين الجماعة حلقة خالية من الخلايا وAV الكبدية. أوعية دموية حلقة AV مصفوفة الفيبرين كثيفة ويمكن الكشف عن خلايا الجنين قابلة للحياة بعد explantation التي كتبها إيجابي PKH-26 تلطيخ والكبد cytokeratin 18 immunohistology (CK-18) خلية محددة أساسا في المناطق القريبة من محور الأوعية الدموية الرئيسية. وارتفاع مستويات مرنا من CK-18 في مجموعة مركبات خلية حلقة. في المقابل، لا CK-18 expressioيمكن أن يتم الكشف عن ن في بنيات دون حلقة أو خلايا ^37.

الدراسات الأوعية الدموية
وتتكون حلقة AV من ثلاثة أجزاء: الوريد، والكسب غير المشروع الشرايين والجزء فاصلة الكسب غير المشروع وريدي (مجموعة التنفيذ والتحقق) (الشكل 1). أظهر تقييم ثلاثي الأبعاد من الأوعية الدموية التي شكلت حديثا السفن نشأت كلا من الوريدي والشرياني جزء كذلك من interponate الوريدي. لوحظ عدد كبير من السفن التي شكلت حديثا من مجموعة التنفيذ والتحقق ^33. مع المجراة مرا، المجهر الإلكتروني من القوالب تآكل الأنسجة والمناعة، وقد لوحظ ظهور الأوعية الدموية في مصفوفة الفيبرين بين يوم 10 و 14. وقبل كل شيء، أعطى الوريدي وقطاعات مجموعة التنفيذ والتحقق أدى إلى العديد من الشعيرات الدموية والأوعية الدموية الكبيرة. انخفاض تدريجي في عيار اللمعية كدليل على arterialization مجموعة التنفيذ والتحقق ويرجع ذلك إلى زيادة في ضغط اللف ووا إجهاد القصق الكشف من يوم 7 على ^38. في إجراء مزيد من الدراسات، يمكن التأكيد على أن الأوعية الدموية تنتشر يأخذ أساسا مكان في الكسب غير المشروع غير الشرياني ^39.

يمكن تصور التحليل الدقيق للعمليات الأوعية الدموية وتحفيز وتثبيط تكوين الأوعية الدموية في غرفة AV حلقة الزرع. عوامل النمو الوعائي البطاني عامل النمو ألف (VEGFA) وعامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF) التي يسببها كثافة الأوعية الدموية أعلى المطلقة والنسبية وارتشاف أسرع من المصفوفة الفيبرين مقارنة مع مجموعة السيطرة النمو خالية من عامل ^31. وعلاوة على ذلك، تم تصور إعادة عرض الظواهر ونضوج شبكة الأوعية الدموية داخل غرفة العزل على مدى فترة زرع 8 أسابيع. في AV تم تحديد العمليات غرف حلقة الربط بين الشعيرات والأوعية الدموية اندماجي فضلا عن النمو اللمفاوي الممكن immunohistologically كمعلمات من شمال شرق نضوج ovascular ^39. من خلال تطبيق الدكتوراه (prolyl نطاق هيدروكسيلاز) DMOG المانع (dimethyloxallyl الجلايسين) بشكل منتظم في الفئران، ويمكن أن يتبين أن تركيز عامل ألفا نقص الأكسجين محرض (مؤسسة الحرمين، α) يرتبط مع الأوعية الدموية المتزايدة في حلقة AV و هو التحفيز للنمو ⁴⁰ سفينة.

الشكل 1: مخطط لحلقة AV في الجرذ نموذج تتكون حلقة AV من ثلاثة أجزاء: الوريد (V)، الشرياني (A) الكسب غير المشروع والجزء فاصلة الكسب غير المشروع وريدي (مجموعة التنفيذ والتحقق). يمكن أن تكون جزءا لا يتجزأ من حلقة AV في غرفة مغلقة زرع (C) لتحريض الأوعية الدموية جوهري. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

جنرال الكتريك = "1">
الشكل 2: AV حلقة عملية في الجرذ (A):.. توطين حزمة الفخذ على الجانب الداخلي من الأطراف الخلفية من الفئران (B / C): إعداد الحزمة الوعائية الفخذ في اليسار واليمين في الفخذ من الفأر. يتم فصل السفن (D)، وتحصد الوريد الكسب غير المشروع فاصلة من الجانب الأيمن (E) وanastomosed مع الوريد الفخذي (F) وشريان الفخذ من الناحية اليسرى في حلقة AV (G، يشير السهم إلى مفاغرة). يتم نقل السفن حلقة في غرفة زرع بريفيليد مع مصفوفة (H) وبعد تعبئة كاملة (I) يتم إغلاق غطاء (J). A = الشريان الفخذي، V = الوريد الفخذي، N = العصب الفخذي، مجموعة التنفيذ والتحقق = فاصلة الكسب غير المشروع وريدي. شريط مقياس مكون من 5 ملم (DJ).tp_upload / 54676 / 54676fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3): تصور الأوعية الدموية في الجرذ AV حلقة نموذج (A): مايكرو-CT بعد نضح مع وكيل النقيض (الأصفر perfused السفن) (ب): الهيماتوكسيلين-يوزين تلطيخ من العظام بديلا β-TCP / HA مع لجنة السلامة البحرية مزروع في AV نموذج حلقة الفئران لمدة 6 أسابيع. و perfused الأوعية AV حلقة مع الهند الحبر (اللون الأسود). شريط مقياس 1 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

لأكثر من عقد من الزمان، وقد استخدمنا بنجاح شرياني (AV) حلقة لأغراض هندسة الأنسجة ودراسة الأوعية الدموية في الجسم الحي في نموذج حيوان صغير. نحن يمكن إثبات أن هذا النموذج المجهرية جدا مناسب تماما لهندسة الأنسجة المختلفة، وأنها يمكن أن تستخدم أيضا لتكوين الأوعية الدموية أو antiangiogenesis الدراسات.

أهمية تقنية مع الاحترام لالحالية / الطرق البديلة
الأنسجة أو الأعضاء المهندسة تتطلب شبكة الأوعية الدموية وظيفية لتزويد المغذيات والأكسجين التي يحتاجونها للبقاء على قيد الحياة والاندماج الناجح بعد زرع في الموقع خلل ^41. وقد تم تطوير عدد من الاستراتيجيات prevascularization مختلفة على مدى العقود الماضية، والتي يمكن أن تكون متباينة وفقا لفي المختبر مقابل في الجسم الحي والنهج الجوهرية مقابل خارجي.

يمكن السقالات يكون فابريكاتيد مع الهياكل والمصنف مع خلايا الأوعية الدموية مثل الخلايا البطانية أو الخلايا الاولية في المختبر ⁴² على شكل أنبوبي. من ناحية أخرى، في الجسم الحي prevascularization، تزرع السقالات في منطقة أوعية دموية للغاية مثل تحت الجلد أو الأنسجة العضلية ^21. بعد ذلك، هذه التركيبات أوعية دموية خارجيا يمكن زرعها في الموقع عيب. ومع ذلك، فإن العيب من هذه الأساليب هو عدم وجود اتصال المجهرية مع السفن المستلم بعد الزرع. لا سيما في حالة من يبني على نطاق واسع، والاتصال فورا إلى الأوعية الدموية المضيف هو ضروري لتزويد الفوري من الأنسجة المهندسة ^43. الحل واضح والواعدة لهذه المشكلة يكمن في جيل من الأنسجة أوعية دموية في جوهرها أو جهاز لمحور الأوعية الدموية، مثل نموذج AV حلقة.

بالإضافة إلى استخدام طريقة AV حلقة كما هو موضح أعلاه، ويمكن الأوعية الدموية المحوري اللهحتى يكون ذلك حافزا باستخدام حزم AV بدلا ⁴⁴ أو واحد فقط سفينة مثل الشريان شرسوفي ^45. ومع ذلك، في العديد من المنشورات أثبت نموذج حلقة AV لتكون متفوقة فيما يتعلق درجة من الأوعية الدموية وكمية دي نوفو تشكيل الأنسجة. تاناكا وآخرون مقارنة كلا النهجين المنهجية، ولاحظ تكوين الأنسجة أعلى بكثير ودرجة أكبر من الشعيرات النامية في حلقة مقارنة مع مجموعة حزمة ^46. دونغ وآخرون. كما أجرى الدراسة باستخدام حلقة AV أو نهج AV حزمة للهندسة الأنسجة والعظام في نموذج أرنب، والتي أظهرت أيضا أعلى بكثير كثافة الأوعية الدموية في حلقة مقارنة مع مجموعة حزمة ^47. كنا قادرين على تأكيد هذه النتائج، وكذلك تظهر في دراسة سابقة أن نموذج حلقة AV لديه لزيادة قدرة الأوعية الدموية ^48.

إلى حد علمنا، لا يوجد نموذج مماثل لتحليلالأوعية الدموية في الجسم الحي في بيئة معزولة، وتميزت بشكل جيد. لذلك، يمثل نموذج AV حلقة أداة قوية لتقييم مدى اختلاف تساهم أنواع الخلايا أو عوامل النمو لتشكيل أو الأوعية الدموية عمليات الشبكة سفينة في الأنسجة المختلفة دون اضطرابات من الهياكل المحيطة بها، مثل غزو الخلايا أو عوامل النمو.

القيود المفروضة على تقنية
ومع ذلك، تحديا كبيرا احدة من النموذج المقترح هو تعقيد عالية من الجراحة. لأحد، ومعالجة العيوب باستخدام نموذج AV حلقة تتطلب إجراء من خطوتين - prevascularization من السقالة وزرعها في الموقع عيب. هذا يعني أن المريض يعاني من الخضوع عمليتين جراحيتين. وبالإضافة إلى ذلك، مهارات المجهرية هي شرط ضروري لنجاح السفن submillimeter تفاغرية ^49. لذلك، تعتبر حزمة AV في بعض الأحيان أكثر فائدة لتطبيق سريري منذ طكما يقدم ر اعدة، وإن كانت أقل، وقدرتها على الأوعية الدموية وتوليد الأنسجة مقارنة مع AV حلقة ^46. ومع ذلك، فإن هذه العملية يمكن تعلم خطوة بخطوة حتى من قبل غير جراحي، وذلك باستخدام الصغيرة أنابيب السيليكون عيار للتدريب في البداية وبعد ذلك السفن من الحيوانات النافقة (على سبيل المثال، أرجل الدجاج) قبل القيام العملية AV حلقة في الحيوانات الحية. في المقابل، يمكن أن معظم تمارس الجراحين الصغرى تنفيذ هذه العملية مع سوى وقت قصير من التدريب.

خطوات حاسمة في إطار بروتوكول
بشكل عام، نظرا لعيار صغير من السفن هناك خطر من تشكيل خثرة وإغلاق الأوعية حلقة. ومع ذلك، في نموذج الفئران 80٪ -100٪ من الحلقات في المتوسط وبراءات الاختراع باستخدام فقط لوقت قصير الهيبارين منع تخثر الدم بعد عملية جراحية ^{28،30،31،34،38،39.}

وعلاوة على ذلك، نظرا لتعقيد عالية من الجراحة سوف يستغرق بضع ساعات (اعتمادا على رانه خبرة الجراح). ومن الضروري للتحقق التخدير المناسب للحيوانات أثناء العملية برمتها وتوفير كاف ضخ للحفاظ على ضغط الدم الكافي. وخلال فترة ما بعد الجراحة فإنه من الأهمية العالية للتحقق من صحة الحيوانية عدة مرات، لإدارة المسكنات / المضادات الحيوية وللتحقق من الجرح العملية. لأنه في معظم الحالات يتم إجراء زرع لغرفة معزولة، فمن الممكن أن العدوى في داخل الغرفة يحدث دون أن يلاحظ. ولذلك، من المهم جدا للحفاظ على عقم أثناء يجب أن يتم بعناية العملية برمتها والإدارة من المضادات الحيوية على مدى فترة من 3-5 أيام.

تعديلات على البروتوكول
الغرفة يمكن تعديلها بشكل فردي لحجم وشكل من الخلل. وعلاوة على ذلك، أيضا أغشية يمكن استخدامها لمرفق بها حلقة AV كما يؤديها Manasseri وآخرون. ^50. بالإضافة إلى ذلك، سقالة، الملحقخلايا lemented وعوامل النمو ويمكن اختيار وفقا لأنواع الأنسجة المختلفة. في الآونة الأخيرة، Miomas آخرون النهج العلاجية الجينات مجتمعة بنجاح مع نموذج حلقة AV ويمكن أن تؤدي إلى تعزيز نمو الأوعية التي كتبها تنبيغ مع VEGF165 ^51. في الآونة الأخيرة، فإننا تعديل الفئران AV نموذج حلقة لأغراض هندسة الأنسجة العضلية. بدلا من الأوعية الفخذ، تم استخدام الوريد الصافن شرسوفي والشريان، والتي مكنت زرع عصب المسد في السقالة أوعية دموية محوريا لتعصيب حركية ( "برنامج التحصين الموسع نموذج حلقة") ^(36). وبالاضافة الى زرع عصب حركية، وتجدد العصب من النسيج العظمي هندسة يقال يبني مع الأعصاب الحسية أن يكون مفيدا لتعزيز تكون العظم وأفضل إصلاح عيوب العظام ^52. حلقة AV الحث الحد الأدنى المانحة المرض ويمكن أن تنشأ في مواقع مختلفة من الجسم ^52. سيكون من الممكن استخدام سفن سطحية في مواقع أخرى منالجسم لتوليد حلقة AV أو حتى لاستخدام الحيوانات الأخرى مثل الأرانب أو نموذج الفأر.

التطبيقات المستقبلية أو الاتجاهات بعد اتقان هذه التقنية
في الآونة الأخيرة، مزروع فريق العمل لدينا خط جيدا اتسم الفئران الجنينية خلية سلفية البطانية (EPC) (T17b) معربا عن guanylate بروتين ملزمة 1 (GBP-1) - علامة وبين الخلايا المانع من وظائف الخلية البطانية مثل انتشار والهجرة و الغزو - في نموذج حلقة الفئران AV. يمكن إظهار القدرة antiangiogenic من يفرق GBP-1-EPC من انخفاض كبير في كثافة الأوعية الدموية في بنيات AV حلقة. وفيما يتعلق التطبيق السريري، يمكن للproinflammatory antiangiogenic GTPase GBP-1 فتح آفاقا جديدة من العلاجات antiangiogenic، على سبيل المثال، عن السرطان أو أمراض أخرى ^53. وبناء على هذه الدراسة، فمن المتصور أن النموذج AV حلقة يمكن استخدامها لإنشاء المرضيةشبكة الأوعية الدموية لمزيد من التحليل واحتمال تعديل. على سبيل المثال، وهذا النموذج يوفر فرصة مثالية للحصول على فهم أفضل للتكوين الأوعية الدموية السرطانية، والعوامل المؤثرة فيها ودور الدقيق للخلايا المختلفة المشاركة في تشكيل شبكة الأوعية السرطانية مثل EPCS، الخلايا السرطانية والخلايا الجذعية ^54. وفي النماذج الحية السرطان وغالبا ما تنفذ في الفئران المعدلة وراثيا لمحاكاة العمليات وخصائص نمو أنواع مختلفة من السرطان البشري، ولقد ثبت أن تكون ممتازة لتطوير الأدوية والتجارب قبل السريرية ^55. وعلاوة على ذلك، هناك نماذج طعم أجنبي لزرع الأورام في حيوانات التجارب مثل الفئران المناعة ^56. ويشمل اتباع نهج أكثر ذات الصلة سريريا زرع الخلايا السرطانية لكل مريض، والمعروفة باسم "نماذج الماوس شخصية" أو "النماذج المستمدة من المريض xenografts ورم" ^57. ومع ذلك، فإن هذه النماذج ليست عملية لدراسة influence من مصدر الخلية أو نمو عامل واحد دون آثار من الأنسجة المحيطة بها.

نموذج AV حلقة يجعل من الممكن استخدام أساليب هندسة الأنسجة لدراسة بيولوجية الورم. ويعرف هذا باسم "الهندسة ورم" من قرية الغجر وآخرون. ويشمل "بناء نماذج الثقافة المعقدة التي تلخص جوانب في الجسم الحي الورم المكروية لدراسة ديناميات التنمية الورم، والتقدم، والعلاج على مستويات متعددة" ^58. ويمكن بناء بيئة ورم داخل غرفة معزولة زرع، والذي يسمح لتحليل دقيق من التفاعلات خلية خلية، الأوعية الدموية، تعديل، وتعزيز وكبت. وعلاوة على ذلك، قد يكون نموذج حلقة AV مفيد لتطوير أو التحقق من صحة العلاجات بشأن وقف neoangiogenesis أو تثبيط نمو الورم.

باستخدام هذا النهج لإحداث الأوعية الدموية، فمن الممكن أن engineeالأنسجة (ص) في حجم ذات الصلة سريريا. في إجراء مزيد من الدراسات، كنا قادرين على توليد أنسجة العظام أوعية دموية محوريا للزرع مع حجم كبير من حوالي 15 سم مكعب في فترة زمنية قصيرة نسبيا من 12 أسبوعا ^59،60. من أجل ترجمة هذه النتائج إلى الممارسة السريرية، سيتم تنفيذ دليل على دراسة مبدأ استخدام نموذج عيب الساق في المستقبل القريب قبل لتطبيقها في البشر. وكخطوة أولى، يمكن أن تثبت بنجاح في هندسة الأنسجة العظمية الموقعي في عيب حجم كبير في سيناريو السريري مع الاستقرار على المدى الطويل ^61. تطبيق نموذج حلقة AV وصف يجعل من الممكن لتوفير العلاج مصممة خصيصا لاحتياجات المريض الفردية. وبناء على نتائجنا فكرة جسم الإنسان نفسه بمثابة مفاعل حيوي الحية لا يزال يحمل وعدا كبيرا للمستقبل.

The authors have nothing to disclose.

ونود أن نشكر المؤسسات التالية لدعم أبحاثنا AV حلقة: STAEDTLER ستيفتونغ، الدكتور فريتز ايرلر فون، عدا ذلك كرونة Fesenius ستيفتونغ، باكستر للرعاية الصحية محدودة، DFG، IZKF / ELAN / EFI / مكتب الجنس والتنوع، وForschungsstiftung طبية ، جامعة فريدريش ألكسندر إيرلانغن نورنبرغ (وحدة التحليل المالي)، ومؤسسة AO، مانفريد روث ستيفتونغ، شيويه كونغ، مؤسسة هانز جورج غايس، دويتشر Akademischer Austauschdienst (DAAD)، وألمانيا، ووزارة التعليم العالي والبحث العلمي، العراق. ونود أن نشكر ستيفان فليتشر، مارينا Milde، كاترين كون وإلسي أرنولد-Herberth حصول على الدعم الفني الممتاز.