Arteriovenous (AV) Loop במודל בעלי חיים קטנים לחקר אנגיוגנזה והנדסת רקמות כלי דם

אנו מתארים גישה מיקרו עבור הדור של בלופ arteriovenous (AV) כמודל לניתוח כלי דם in vivo בסביבה מבודדת היטב מאופיין. מודל זה הוא לא רק שימושי עבור חקירת אנגיוגנזה, אלא גם מתאים באופן אופטימלי עבור הנדסה vascularized axially ורקמות להשתלה.

A functional blood vessel network is a prerequisite for the survival and growth of almost all tissues and organs in the human body. Moreover, in pathological situations such as cancer, vascularization plays a leading role in disease progression. Consequently, there is a strong need for a standardized and well-characterized in vivo model in order to elucidate the mechanisms of neovascularization and develop different vascularization approaches for tissue engineering and regenerative medicine.

We describe a microsurgical approach for a small animal model for induction of a vascular axis consisting of a vein and artery that are anastomosed to an arteriovenous (AV) loop. The AV loop is transferred to an enclosed implantation chamber to create an isolated microenvironment in vivo, which is connected to the living organism only by means of the vascular axis. Using 3D imaging (MRI, micro-CT) and immunohistology, the growing vasculature can be visualized over time. By implanting different cells, growth factors and matrices, their function in blood vessel network formation can be analyzed without any disturbing influences from the surroundings in a well controllable environment.

In addition to angiogenesis and antiangiogenesis studies, the AV loop model is also perfectly suited for engineering vascularized tissues. After a certain prevascularization time, the generated tissues can be transplanted into the defect site and microsurgically connected to the local vessels, thereby ensuring immediate blood supply and integration of the engineered tissue. By varying the matrices, cells, growth factors and chamber architecture, it is possible to generate various tissues, which can then be tailored to the individual patient's needs.

רוב הרקמות ואיברים בגוף האדם תלויות רשת כלי דם תפקודית המספקת חומרים מזינים, מחליף גזים ומסיר חומרי פסולת. תקלה במערכת הזו נגרמת על ידי בעיות בכלי דם מקומיות או מערכתיות יכולה להוביל למספר רב של מחלות קשות. יתר על כן, באזורי מחקר כגון הנדסת רקמות או רפואת רגנרטיבית, רשת כלי דם תפקודית בתוך רקמות שנוצרו באופן מלאכותי או איברים מושתלים היא הכרחית עבור יישומים קליניים מוצלחים.

במשך עשרות שנים חוקרים כבר חוקרת את המנגנונים המדויקים המעורבים כלי הדם גדל כדי להבין טוב יותר למצבים פתולוגיים כדי למצוא התערבויות טיפוליות חדשניות ולספק מניעה טובה יותר של הפרעות בכלי הדם. בשלב הראשון, תהליכים בסיסיים כגון תאי תאי אינטראקציות או את ההשפעה של מולקולות על תאים של מערכת כלי הדם בדרך כלל נחקרים על ידי במבחנת 2D או 3Dניסויים. מודלי 2D מסורתיים הם קלים לביצוע, מבוססים היטב ותרמו רב להבנה טובה יותר של תהליכים אלה. בפעם הראשונה בשנת 1980, פולקמן ואח '. דווח זריעת אנגיוגנזה חוץ גופייה של תאי אנדותל נימים על צלחות ג'לטין מצופה ^1. זה מיד פינתה פרסום של מספר רב של ניסויים אנגיוגנזה 2D נוסף על assay היווצרות צינור תא האנדותל ^2, הגירה assay ³ ואת שיתוף culturing של סוגי תאים שונים ^4, כמו גם אחרים. מבחנים אלו משמשים עד היום וקבלו כסטנדרט בשיטות במבחנה.

עם זאת, התקנה ניסיונית זו אינה עולה תמיד מתאימה לחקר התנהגות תא in vivo מאז סוגי התאים ביותר דורשים סביבת 3D כדי ליצור מבני רקמות פיסיולוגיים רלוונטיים ^5. זה יכול להיות הראה כי הארכיטקטורה של מטריקס 3D יש משקל מכריע morphogenesi נימיםים ⁶ וכי מטריקס הסלולר נוסף תא (ECM) אינטראקציות ותרבות 3D תנאים להסדיר גורמים חשובים מעורבי אנגיוגנזה גידול ^7. מטריצת 3D מספקת תשומות מכאניות מורכבות, יכול לקשור חלבונים מפעילים ולהקים הדרגתיים ריכוז מומס בקנה מידת רקמות. יתר על כן, זה נחשב הכרחי על מנת לחקות המוךפו"גנטי שהולך vivo וצעדי שיפוץ ברקמות מורכבות ^5. במערכות אלה, הוא אנגיוגנזה vasculogenesis ניתן ללמוד. בעוד אנגיוגנזה מתאר נביטת נימים מן קודמות כלי הדם ^8, vasculogenesis מתייחס היווצרות דה נובו של כלי הדם באמצעות תאי אנדותל או אבות שלהם ^9,10. ההבשלה של כלי מתואר תהליך הנקרא 'arteriogenesis' באמצעות גיוס של תאי שריר חלק ^11. Angiogenic טיפוסי במודל חוץ גופית היא הנבטה של תאי האנדותל מן בשכבה הקיימתהים זורע כמו בשכבה על גבי משטחים ג'ל, על פני שטח של microspheres מוטבע בתוך ג'ל או ע"י בניית spheroids תא האנדותל ^12. במודלי vasculogenic יחידים בתאי האנדותל הם לכודים ג'ל 3D. הם אינטראקציה עם תאי אנדותל סמוכים כדי ליצור מבנים וסקולרית ורשתות דה נובו, בדרך כלל בשילוב עם תאים תומכים ^12.

עם זאת, אפילו 3D מורכבים במודלים חוץ גופית לא יכול לחקות במסגרות vivo נתון לחלוטין ריבוי תאים תאים ותא-ECM קשרי הגומלין ^13. חומרים בעלי פעילות גבוהה במבחנה לא מראים באופן אוטומטי את אותם אפקטים in vivo ולהיפך ^14. לקבלת ניתוח מקיף של כלי הדם מעבד יש צורך דחוף לפתח במודלים vivo כי טוב לדמות את המצב בגוף. מגוון גדול של מבחני אנגיוגנזה vivo ב מתוארים בספרות, כוללassay קרום חומוס chorioallantoic (רמ"א), מודל דג הזברה, assay אנגיוגנזה הקרני, מודל השק הגבה אוויר, תא skinfold הגבה, ¹⁴ דגמי הגידול תת עורית. עם זאת, מבחנים אלה קשורים בדרך כלל עם מגבלות, כגון שינויי מורפולוגיים מהירים, בעיות נימים חדשות המבדילות מקבוצות קיימות כבר ב assay CAM, או מספר המקומות המוגבלים assay אנגיוגנזה הקרני ^15. יתר על כן, מערכות שאינן יונקים משמשות (למשל., מודל דג הזברה ^16), מה שמוביל לבעיות ב השתלה שלא מבן-מיניתי ^17. במודל הגידול תת עורית, אנגיוגנזה שמקורם רק מן הגידול עצמו לא ניתן לנתח מאז הרקמות הסמוכות תורמות רבות לתהליך כלי הדם. יתר על כן, את הרקמה שמסביב יכול להיות תפקיד מכריע בעיצוב במיקרו-סביבה של הגידול ^18.

לא רק ללימוד אנגיוגנזה או vasculogenesis האם יש ne חזקed עבור ב סטנדרטית היטב מאופיין מודל vivo אלא גם ללימוד אסטרטגיות כלי דם שונים בהנדסת רקמות ורפואה רגנרטיבית. היום, הדור של איברים מורכבים מלאכותיים או רקמות אפשרי הוא במבחנת in vivo. 3D bioprinting מספק טכניקת ייצור על פי דרישה להפקת רקמות מחייה שימושית 3D מורכב ^19. יתר על כן, מתקני הגידול יכול לשמש להפקת רקמות ²⁰ או אפילו הגוף עצמו יכול לשמש bioreactor ^21. עם זאת, המכשול העיקרי ליישום מוצלח של רקמות שנוצרו באופן מלאכותי הוא חוסר כלי דם בתוך המבנים המהונדסים. חיבור מיידי של כלי דם המארח לאחר ההשתלה הוא תנאי הכרחי להישרדות, במיוחד במקרה של רקמות מלאכותיות בקנה מידה גדולה או איברים.

שונה במבחנה או באסטרטגיות prevascularization vivo היה develOpEd להקים microvasculature תפקודית בונה לפני ההשתלה ^22. השתלת פיגום עם נימים מהונדסים מתבצעות חוץ גופית על עור הגב של עכברים הביאה השקה מהירה של כלי הדם בעכברים תוך יום ^23. לעומת זאת, אליפטית שיתוף תרבות המורכבת של אדם בתאי גזע mesenchymal ותאי אנדותל וריד אדם הטבור התאספו לתוך רשת prevascular תלת ממד פיתוח נוסף לאחר השתלת in vivo. עם זאת, השקה עם כלי דם המארח הוגבלה ^24. מעל לכל, פגמים vascularized גרוע, כגון אזורים נמקי או מוקרן, כלי דם חיצוניים כביכול זה - ingrowth כלי מהאזור לתוך הפיגום - לעתים קרובות נכשל. כלי דם פנימיים, לעומת זאת, מבוסס על ציר כלי דם כמקור נימים החדשים הנבטה לתוך הפיגום ^25. שימוש בגישת כלי הדם הציריניתן להשתיל, הרקמה המהונדסת עם ציר כלי הדם שלו ומחוברת כלי מקומי באתר הנמען. מיד לאחר ההשתלה, הרקמה נתמך כראוי על ידי חמצן וחומרים מזינים, אשר יוצר את התנאים המתאימים לשילוב אופטימלי.

בשל זמינות מוגבלת של מודלים לחקירת in vivo אנגיוגנזה ומתוך הכרת החשיבות הגוברת של יצירת רקמת vascularized axially, פיתחנו את הגישה microsurgical של ארול ו Spira נוספת כדי ליצור לולאה arteriovenous (AV) במודל חיה ^26. השימוש בתא השתלה סגור לחלוטין עושה שיטה זו מתאימה מאוד גם ללמוד כלי דם היווצרות תחת "נשלט", גם מאופיין בתנאי vivo (איור 1). מודל זה הוא לא שימושי רק עבור החקירה של אנגיוגנזה אלא גם מתאים באופן אופטימלי עבור כלי הדם הציריים של פיגומי engin רקמותלמטרות eering.

ועדת טיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת פרידריך אלכסנדר ארלנגן-נירנברג (FAU) וממשלת פרנקוניה התיכון, גרמניה, אישר את כל הניסויים. עבור הניסויים, חולדות לואיס זכרו עם משקל גוף של 300 - 350 גרם שמשו.

1. דגם Loop arteriovenous בחולדה

1. הליך ההשתלה (איור 2)
   1. עבור הרדמה להשתמש בקופסת פלסטיק מיוחד המחובר באמצעות צינור אל מאדה isoflurane וסגר על ידי מכסה. הפעל גז אספקה ​​וזרימת מטר בין 0.8 - 1.5 ליטר / דקה.
   2. מניחים את החולדה בתיבת פלסטיק אינדוקציה ולאטום העליון. הפעל מאדה isoflurane עד 5%.
   3. אנא קראו בעיון את החולדה במהלך אינדוקציה של הרדמה. אחרי 3 - 4 דקות, החולדה תהיה מורדמת.
   4. אשר הרדמה תקינה: פסד של רפלקס ליישר, אובדן רפלקס palpebral, רפלקס נסיגה, רפלקס מצמוץ חיובי.
   5. ותיפטר מהתיבה ולבדוק שלהמשקל לחישוב של תרופות. החל העין משחה למניעת יובש לאחר הרדמה.
   6. נהל משככי כאבים ואנטיביוטיקה (למשל., 7.5 מ"ג / ק"ג Enrofloxacin תת עורית (SC), 12.5 מ"ג / ק"ג tramadol 100 מ"ג / ק"ג דיפירון הן לווריד (iv)). נהל crystalloids המותאמות במשקל במהלך המבצע (למשל., 30 מ"ל / ק"ג SC).
   7. מניחים את החולדה על גבו על צלחת ההתחממות על 37 מעלות צלזיוס בהרדמה עם 1 - שאיפה isoflurane 2% מנוהל באמצעות מסכה.
   8. צג הרדמה כראוי ולהגדיל isoflurane אם רמת הרדמה היא נמוכה מדי (תנועה של העכברוש, בתגובה לכאב, טון לסת, אין אובדן הרפלקסים (ראה 1.1.4.), קצב לב הגדלה). היזהר שלא ממנה יתר isoflurane (אובדן הרפלקסים קרני, קצב לב גבוה, ירידת רוויון חמצן). השתמש oximetry דופק מיוחד לבעלי חיים קטנים לבדיקת ריווי החמצן (95 - 100%) וקצב לב (250 - 450 / min) של החולדה. במהלך operatiעל הטמפרטורה צג של עכברוש (36 - 40 ° C) ולהתאים הטמפרטורה של צלחת ההתחממות במידת הצורך.
   9. לגלח את הצדדים הפנימיים של הגפיים האחוריים עם סכין גילוח חשמלי ולחטא את האזור עם חומרים אנטיספטיים. מורחים את הגפיים האחוריות ולתקן אותן עם דבק.
   10. הנח את העכברוש תחת מיקרוסקופ כירורגים ולכסות את העכברוש עם כורכת סטרילי. ודא כי הליך הניתוח כולו מתבצע בתנאים סטריליים.
   11. פתח את העור באמצע הירך השמאלית עם חתך אורכים מהברך העליונה למפשעה באמצעות אזמל (מס '10).
   12. חותכים את הרקמה התת עורית ו fascia בשכבות של כ 3 ס"מ אורך באמצעות מספריים microforceps לנתח עד צרור וסקולרית הירך חשופה מהעורק האגן במפשעה אל הסתעפות של עורק הירך בברך.
   13. הפרד את הכלי ולהסיר את adventitia באמצעות מספרי adventitia ואת microforceps.
   14. להקריש את צד ב 'חוות באמצעות קרישה חשמלית. מכסה את שדה הפעולה עם רטייה לחה.
   15. פתח את העור בצד ימין כפי שתואר עבור בצד שמאל, 1.1.11 - 1.1.14.
   16. לקציר שתל הוורידים, ולקשור וריד הירך התקין ידי קרישה חשמלית על הפרוקסימלי ומסתיים הדיסטלי במרחק של 1 - 1.5 סנטימטר.
   17. הסר את שתל הוורידים עם microforceps ולשטוף את שתל הוורידים עם פתרון הפרין (50 IU / ml בתמיסת נתרן כלורי 0.9%) באמצעות צינורית השקיה ולהעביר אותו אל ירך השמאל. מכסה את שדה הפעולה בצד ימין עם רטייה לחה.
   18. ולקשור וריד הירך בצד שמאל proximally בבית באזור מפשעתי עם מלחציים microvessel. להקריש וריד הירך distally ידי קרישה חשמלי, בברך העליונה לפני הסתעפות, במרחק של כ -2 ס"מ.
   19. עבור השקה חבר את הקצה הפרוקסימלי של שתל הוורידים עם סוף הפרוקסימלי של העורק על ידי השקת end-to-end עם 11-0 suturדואר. השתמש כ -8 תפרים קטע. בגין עם נחת שני התפרים הראשונים ב -12 בבוקר ו -6 העמדות בערב. לאחר מכן, לשים 2 עד 3 תפרים יותר בין נקודות אלה בצד הקדמי ולאחר מכן לשים 2 עד 3 תפרים יותר לתוך הצד האחורי.
   20. ולקשור את העורק הפמורלי באותו אופן שתואר עבור וריד הירך (1.1.18.). ודא כלי לולאה אינם מעוות. Anastomose בקצה הדיסטלי של שתל הוורידים עם סוף הפרוקסימלי של העורק כמתואר עבור וריד הירך (שלבי 1.1.19.).
   21. נהל 25 IU הפרין לוריד. הפוך שוב בטוח כלי לולאה אינם מעוות, הסר את מהדק ולבדוק דליפה patency של הלולאה כ -5 דקות.
   22. Papaverine לכדרר (למשל, 4 מ"ג / מ"ל) על כלי כדי למנוע התכווצויות כלי הדם. אם יש patency, הלולאה מתרחבת ואת הדופק של העורק ניתן לצפות.
   23. מלא מראש בתא ההשתלה למחצית הראשונה (כ -500 μl) של המטריצה (למשל </ Em>, הידרוג או מטריצת עצם עם או בלי תאים). הטמע את הלולאה לתוך תא ההשתלה.
   24. ממלא את חדר ההשתלה עם המחצית השנייה של המטריצה ​​כדי בהיקף כולל של 1,000 μl. חותם את התא עם מכסה התא.
   25. תקן את תא ההשתלה על הירך עם תפר 6-0 שאינם נספגים. תקן את המכסה קאמרית עם תפר 6-0 שאינם נספגים. תפסיק דימום אפשרי עם קרישה חשמלית.
   26. סגור את העור עם 4-0 תפרים נספגים. מכסים את הפצע עם ספריי אלומיניום.
   27. נהל אנטיביוטיקה ומשככי כאבים (למשל, 7.5 מ"ג / ק"ג Enrofloxacin SC, tramadol 12.5 מ"ג / ק"ג פומי (PO) (דרך מי השתייה) במשך 3 - 5 ימים ולאחר מכן בהתאם להתנהגות של עכברוש).
   28. סובב את מאדה את ולאפשר החולדה לנשום גז אספקה ​​עד שהוא מתחיל להתעורר.
   29. מניחים את החולדה בקופסה עם תמיכה תרמית ולבחון אותו בזהירות עד התאושש לחלוטין.
   30. אל תשאירו את העכברוש unהשתתפו עד שב להכרתו מספיק כדי לשמור שכיבה sternal.
   31. אל תשלח את החולדה בחברת חיות אחרות עד התאושש לחלוטין.
2. נוהל explantation
   1. בצעו את explantation לאחר ההשתלה קצרת זמן או זמן ארוך (בהתאם לעיצוב המחקר, לדוגמאות ראה הפניות 27-32). להרדים את העכברוש על פי שלבי 1.1.1.-1.1.9.
   2. פתח את העור של הבטן עם אזמל (מס '10) ולהעביר את המעיים בצד עם רטייה. לחשוף את אבי העורקים בבטן ואת צמר גפן הווריד הנבוב caudalis משתמש.
   3. Cannulate אבי העורקים בבטן (למשל., 24 מד צינורית פלסטיק) וחתך את הווריד הנבוב caudalis במספריים לנתח.
   4. שטוף את אב העורקים בבטן עם פתרון נתרן כלורי 0.9% המכיל הפרין 100 IU / ml עד שהנוזל הדולף ברור. Perfuse האאורטה עם 30 מ"ל פתרון זלוף (למשל., בניגוד סוכן או הודויא).
   5. להרדים את העכברוש על ידי הזרקה של מינון קטלני של embutramide, יודיד mebezonium, פתרון בזריקות hydrochloride tetracaine (0.1 - 0.2 מ"ל / ק"ג) ב הרדמה עמוקה.
   6. ולקשור את אבי העורקים בבטן ואת הווריד הנבוב caudalis עם תפר 4-0 שאינם נספגים.
   7. סגור את אזור הפצע הפתוח עם 1 - 2 מלחציים. אחסן את החולדה למשך 24 שעות ב 4 ° C (ריפוי של הפתרון זלוף).
   8. מניחים את החולדה על הגב שלה. מורחים את הגפיים האחוריות ולתקן אותן עם דבק.
   9. פתח את העור מעל החדר עם חתך אורכי עם אזמל (מס '10).
   10. הסר את רקמת החיבור של החדר ואת pedicle לולאה באמצעות מספריים microforceps לנתח. חותך את pedicle לולאת ממרחק של 1 סנטימטר מהפתח הקאמרי במספריים לנתח ולהסיר את קאמרית.
   11. פתח את המכסה של התא ובזהירות להסיר את המבנה מהאולם עם מלקחיים ולתקן אותה בתמיסה שנאגרה פורמלין 4% למשך 24 שעות ב חדרטֶמפֶּרָטוּרָה. לאחר מכן להשתמש לבנות עבור טומוגרפיה מיקרו שחושב 3D או פרפין מוטבע לניתוח היסטולוגית ^30.

הנדסת רקמות
למטרות הנדסת עצם רקמות, מספר תחליפי עצם שונים הושתלו ב ^27,28,33,34 מודל לולאת AV חולדת חיה הקטנה. כלי הדם יכול להיות הפגינו בצורה מושלמת על ידי טומוגרפיה מיקרו שחושב 3D (מיקרו CT) (איור 3 א). כלי הדם של רקמת עצם ספוגי שור מעובד (PBCB) מטריקס היה גבוה משמעותית בקבוצת הלולאה בהשוואה לקבוצה ללא כלי דם. רשת כלי דם במגמת צמיחה מתמדת maturating שפותחה בתוך חדר ההשתלה במשך 8 שבועות. בין 4 ו -8 שבועות, צמיחה מתמשכת של רקמות כלי דם לכיוון המרכז של המבנים נצפתה, אך לא נעשה עלייה זוהתה בקבוצה הלא-vascularized ^33. Prevascularization של מטריקס PBCB במשך 6 שבועות במודל לולאת AV הוביל להישרדות מעולה של אוסטאובלסטים מוזרקים לעומת אוסטאובלסטים המלאים. בניגוד לקבוצות הביקורת, ביטוי של גני עצם ספציפי זוהה בקבוצת לולאת AV עם אוסטאובלסטים מושתלים ^28. כמטריצה ​​נוספת, זכוכית ביו sintered יחד עם ג'ל הפיברין נשתלה לולאות AV של החולדות. לאחר 3 שבועות, רשת צפופה של כלי שהוקמה זה עתה פיתחה הפגינו על ידי מיקרו CT היסטולוגיה ^27.

תא ההשתלה שונה כדי להאיץ כלי דם פיגום. באמצעות תא טיטניום מחורר, כלי דם פנימיים נתמכו על ידי כלי חיצוני מן הרקמה הסובבת. רק בשעה 2 שבועות לאחר ההשתלה של hydroxyapatite β-tricalciumphosphate (β-TCP / HA) / מטריקס הפיברין, 83% של כלי חוברו הלולאה AV עם עלייה רציפה לאורך זמן והגיע 97 חיבור% לאחר 8 שבועות ^34. עם ההשתלה של 5 x 10 ⁶ העצם תאי גזע mesenchymal נגזר מח (MSC) ועצמות המוךפו"גנטי שהולך חלבון 2 (BMP-2), גידול משמעותי היווצרות העצם בהשוואה לקבוצות BMP-2 או MSC לבדו יכול להיגרם. לאחר 6 ו -12 שבועות, מטריקס הפיברין הושפל לגמרי ובמקומו רקמת חיבור כלי דם מאוד בכל הקבוצות (איור 3 ב 6 השתלה בשבוע). חלה ירידה משמעותית במספר כלי בקבוצת BMP-2 / MSC בין 6 ל -12 שבועות ולאחר 12 שבועות של הקבוצות האחרות. זה היה כנראה בגלל התבגרות של רשת כלי הדם, ובין אם ההסדר הקומפקטי של מבנה עצמות מובילים במערך רשת כלי דם מוגבל ^32.

מלבד עצם, ברקמות אחרות כגון שריר או כבד יכולות גם להיות מהונדסות במודל לולאת AV.

עבור רקמת שריר הנדסה axially vascularized, ניסויים עם myoblasts העיקרי מטריקס הפיברין לולאה AV בוצעו. לאחר prevasculזמן arization של 2 שבועות 2, 4, ו -8 שבועות, 1 x 10 ⁶ myoblasts הושתלו לתוך תא לולאת AV. myoblasts המושתלים ניתן redetected גם לאחר 8 שבועות באמצעות אסתר carboxyfluorescein diacetate succinimidyl תיוג (CFDA). התאים המשיכו פנוטיפ myogenic שלהם בתוך מטריצת הפיברין והביטוי של הסמנים ספציפי שריר MEF-2 ו desmin היו חיוביים לאחר 4 שבועות. עם זאת, ביטוי גנים סמן myogenic היתה שלילית לאחר 8 שבועות, שהיה ככל הנראה בשל היעדר גירויים myogenic וקליטה מהירה של מטריקס הפיברין ^35. כדי להגדיל גירוי myogenic, שינוי חדש של לולאת העכברוש AV פותח באמצעות הווריד ברום הבטן במקום וריד saphenous כדי להשיג מיצוב הפרוקסימלי יותר של חדר הבידוד. לפיכך, שילוב נוסף של העצב המוטורי אטם התאפשר גיאומטרי. באמצעות שינוי לולאת AV זה, אשר נקרא כמו לולאת EPI, נוכל להראות ד myogenicifferentiation של myoblasts שיתוף מושתל ו- MSC ^36.

עבור הנדסת רקמות כבדה 4 x 10 ⁶ pkh-26 תאים בכבד העובר שכותרתו הושתלו בתוך מטריצה הפיברין במודל לולאת העכברוש AV עבור 2 שבועות. בקבוצת הביקורת, מטריצות בלי לולאה AV ומטריצות תא ללא הושתלו. נימים פונקציונליות נבעו כלי לולאת AV ו-רקמות ניאו vascularized ביותר נצפו בתוך החדר לאחר 14 ימים של השתלה, כפי שמוצגת על ידי מכתים CD31 וסימון דיו הודו. לא נמצא הבדל בין התא ללא וקבוצת לולאת hepatocyte AV. לולאת AV vascularized מטריקס הפיברין בצפיפות תאים עובריים קיימא יכולים להתגלות לאחר explantation ידי מכתים חיובי pkh-26 ו תא ספציפי בכבד cytokeratin 18 (CK-18) immunohistology בעיקר הקרבה של ציר כלי הדם הגדול. רמות ה- mRNA של CK-18 היו גבוהות בקבוצת תא לולאת AV. בניגוד לכך, לא CK-18 expression ניתן היה לזהות מבנים ללא לולאה או תאים ^37.

מחקרים אנגיוגנזה
לולאת AV מורכבת משלושה חלקים: הווריד, שתל עורקי שתל ורידי interpositional (קב"א) המגזר (איור 1). הערכה תלת ממדים של מערכת כלי הדם הראתה כי שהוקמו זה עתה כלי מקורו הן מן הוורידים והחלקה עורקת כמו גם מן interponate הוורידים. מספר רב של כלי שהוקם זה עתה נצפה מן קב"א ^33. עם in vivo MRA, מיקרוסקופ אלקטרונים הסורק של יציקות קורוזית היסטולוגיה חיסונית, על תחילתה של אנגיוגנזה במטריצת הפיברין נצפתה בין היום 10 ו 14. מעל לכל, הוורידים ומגזרי קב"א הולידו נימים רבות וכלי גדול. הפחתה הדרגתית קליבר לומינל כאות arterialization של הקב"א בשל עלייה בלחץ endovascular ו ווה מאמץ הגזירהשעות זוהה מהיום 7 על ^38. במחקרים נוספים, זה יכול להיות אשר כי כלי דם ההנבטה מתרחשת בעיקר השתל הלא העורקים ^39.

הניתוח המדויק של תהליכי אנגיוגנזה הגירוי ועיכוב של היווצרות כלי דם יכול להיות דמיין בתא AV לולאת ההשתלה. גורמי צמיחה של כלי הדם גורם צמיחת אנדותל (VEGFA) ו גורמים גדילה פיברובלסטים בסיסית (bFGF) מושרה צפיפות כלי דם מוחלטת ויחסים גבוהים ספיגה מהיר יותר של מטריקס הפיברין בהשוואה לקבוצת הביקורת גורם ללא צמיחה ^31. יתר על כן, תופעות והתבגרות שיפוץ של רשת כלי הדם בתוך תא הבידוד היו דמיינו פני תקופת השתלה של 8 שבועות. AV במצבי תהליכים תאים לולאה של קישוריות intercapillary ו אנגיוגנזה intussusceptive וכן צמיחת הלימפה אפשרית זוהו immunohistologically כפרמטרים של ne התבגרות ovascular ^39. על ידי יישום PHD (תחום hydroxylase prolyl) מעכב DMOG (dimethyloxallyl גליצין) מערכתית בחולדות, אפשר יהיה להוכיח כי ריכוז של אלפא גורם-מושרה היפוקסיה (HIF-α) עולה בקנה אחד עם כלי הדם גדל בלולאה AV ומהווה גירוי כלי תולדה ^40.

איור 1:. Scheme של Loop AV במודל חולדת לולאת AV מורכבת משלושה חלקים: הווריד (V), את העורקים (א) שוחד שתל ורידי interpositional (קב"א) הקטע. לולאת AV יכולה להיות מוטבעת לתוך תא השתלה סגור (C) לזירוז של כלי דם פנימיים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

ge = "1">
איור 2: AV Loop מבצע בחולדה (א):.. לוקליזציה של צרור הירך בצד הפנימי של הגפיים האחוריות של עכברוש (B / C): הכנת צרור וסקולרית הירך ימין ועל שמאל במפשעה של העכברוש. הכולים מופרדים (D), שתל וריד interpositional שנקטף מהצד הימני (E) anastomosed עם וריד הירך (F), ועצם ירך של הצד השמאלי לתוך לולאת AV (G, החץ מצביע על anastomoses). כלי הלולאה מועברים לתא ההשתלה prefilled עם מטריקס (H) ואחרי מילוי מלא (I) המכסה סגור (J). A = עורק הירך, וריד V = הירך, N = עצב הירך, קב"א = שתל ורידי interpositional. מ"מ סרגל קנה מידה 5 (DJ)."Target =" tp_upload / 54,676 / 54676fig2large.jpg _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3: ויזואליזציה של כלי הדם במודל Loop עכברוש AV (א):. מיקרו-CT לאחר זלוף עם חומר ניגוד (צהוב perfused כלי) (B):. Hematoxylin-Eosin מכתים של תחליף β-TCP / HA העצם עם MSC מושתל עכברוש מודל הלולאה AV במשך 6 שבועות. כלי לולאת AV הם perfused בדיו (צבע שחור). סרגל קנה מידה 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

במשך למעלה מעשור, יש לנו בהצלחה השתמשו arteriovenous (AV) לולאה למטרות הנדסת רקמות אנגיוגנזה הלומדים vivo במודל חיה קטנה. יכולנו להוכיח כי מודל מייקרו זה גם מאוד מתאים הנדסת רקמות שונות וכי הוא יכול לשמש גם ללימודי אנגיוגנזה או antiangiogenesis.

משמעות של הטכניקה ביחס קיימים / שיטות חלופיות
רקמות או איברים מהונדסים דורשים רשת כלי דם תפקודית כדי לספק את חומרי מזון וחמצן שהם צריכים להישרדות ההשתלבות המוצלחת לאחר ההשתלה לתוך האתר פגם ^41. מספר אסטרטגיות prevascularization שונים פותח בעשורים האחרונים, אשר יכול להיות מובחן על פי במבחנה לעומת in vivo וגישות מהותיות לעומת חיצוני.

פיגומים יכולים להיות Fabricaטד עם כגלילים בצורת זרע עם תאי כלי הדם כגון תאי אנדותל או ובתאים במבחנה ^42. מצד שני, עבור in vivo prevascularization, פיגומים מושתלים אזור vascularized מאוד כגון הרקמה התת עורית או שרירים ^21. לאחר מכן, בונה vascularized extrinsically אלה ניתן להשתיל לתוך האתר פגם. עם זאת, החיסרון של גישות אלו היא חוסר חיבור מיקרו עם כלי של הנמען לאחר ההשתלה. במיוחד במקרה של מבנים בקנה מידה גדול, קשר מיידי אל כלי הדם המארח הוא חיוני לאספקה מיידית של רקמות מהונדסות ^43. הפתרון הברור ביותר ומבטיח לבעיה זו טמון בדור של רקמות כלי דם באופן מהותי או איבר ידי ציר כלי דם, כגון מודל לולאת AV.

מלבד בשיטת AV הלולאה כמתוארת לעיל, כלי דם ציריים יכולים אלכך להיגרם באמצעות חבילות AV במקום ⁴⁴ או רק אחד כלי כגון עורק ברום הבטן ^45. עם זאת, בכמה פרסומי מודל לולאת AV התברר מעולה בכל הנוגע למידת כלי דם וכמות דה נובו היווצרות רקמה. טנקה et al. לעומת שני גישות המתודולוגיות וצפה משמעותי היווצרות רקמה גבוהה מידה רבה יותר של נימים בפיתוח בלולאה בהשוואה לקבוצת הצרור ^46. דונג et al. גם ערך מחקר באמצעות לולאת AV או צרור AV גישות הנדסת רקמות עצם במודל ארנבת, אשר גם הראה צפיפות כלי דם גבוהה משמעותית הלולאה בהשוואה לקבוצת הצרור ^47. הצלחנו לאשר את הממצאים וכן גם להראות במחקר קודם שמודל לולאת AV בעל קיבולת גבוהה עבור אנגיוגנזה ^48.

למיטב ידיעתנו, אין מודל דומה לניתוחכלי דם in vivo בסביבה מבודדת היטב מאופיינת. לכן, מודל לולאת AV מהווה כלי רב עצמה עבור בהערכה כמה שונה סוגי תאים או גורמי גדילה לתרום לתהליכי היווצרות או כלי דם רשת כלי ברקמות שונות ללא הפרעות ממבנים שמסביב, כגון פולשים לתאים או גורמי גדילה.

מגבלות של הטכניקה
עם זאת, אתגר משמעותי אחד של המודל המוצע היא רמת המורכבות הגבוהה של הניתוח. קודם כל, את הטיפול של פגמים תוך שימוש במודל לולאה AV דורש הליך דו-שלבי - prevascularization של הפיגום והשתלות לתוך האתר פגם. משמעות הדבר היא כי לחולה יש לעבור שני ניתוחים. בנוסף, מיומנויות microsurgical הן תנאים הכרחיים כלי submillimeter anastomosing מוצלח ^49. לכן, חבילת AV לפעמים נחשבת יותר שימושית עבור יישומים קליניים מאז שאניt מציע גם מבטיח, אם כי פחות, פוטנציאל אנגיוגנזה הדור רקמות לעומת לולאת AV ^46. עם זאת, פעולה זו יכולה להילמד צעד-אחר-צעד אפילו על ידי-מנתחי עישון, באמצעות צינורות סיליקון קליבר קטנים להכשרה בהתחלה ואחר כך הכלי של חיות מתות (למשל, כרעי תרנגולת) לפני ביצוע פעולת לולאת AV בתוך חי. לעומת זאת, בשדה המנתחים מיקרו מתורגל ביותר יכול לבצע את הפעולה הזו עם זמן של הכשרה קצרה בלבד.

צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול
באופן כללי, בשל הקליבר הקטן של הכלי יש את הסיכון להיווצרות קרישי דם וסגירת כלי הלולאה. עם זאת, ב-% 80% מודל עכברוש -100 של לולאות בממוצע היו פטנט באמצעות רק לזמן קצר הפרין קרישה לאחר הניתוח ^{28,30,31,34,38,39.}

יתר על כן, בשל רמת המורכבות הגבוהה של הניתוח זה ייקח כמה שעות (תלוי tהוא המומחיות של המנתח). זה חיוני כדי לבדוק הרדמה תקינה של חיות במהלך המבצע כולו כדי לספק עירוי מספק שמירה על לחץ דם מספק. בתקופה שלאחר הניתוח הוא בעל חשיבות גבוהה לבדוק את בריאותם של כמה פעמים החיות, לנהל משככי כאבים / אנטיביוטיקה כדי לבדוק את פצע המבצע. מאחר שברוב המקרים השתלה תא מבודד מתבצע, יתכן כי הזיהום הפנימי של החדר מתרחש מבלי משים. לכן, חשוב מאוד כדי לשמור על סטריליות במהלך המבצע כולו מתן אנטיביוטיקה צריך להיעשות בזהירות על פני תקופה של 3 - 5 ימים.

שינויים לפרוטוקול
התא יכול להיות מותאם באופן אינדיבידואלי על הגודל והצורה של הפגם. יתר על כן, גם ממברנות יכולים לשמש התוחם את לולאת AV כפי שבוצע על ידי Manasseri et al. ^50. בנוסף, הפיגום, suppתאי lemented ואת גורמי גדילה ניתן לבחור על פי סוגי הרקמות השונים. לאחרונה, Miomas et al. גישות טיפוליות גנים משולבים בהצלחה עם מודל לולאת AV ועלולה לגרום שיפור של צמיחת כלי ידי תמרה עם VEGF165 ^51. לאחרונה, התאמנו את מודל הלולאה AV עכברוש למטרות הנדסת רקמות שריר. במקום כלי הירך, הווריד ברום הבטן ואת העורק saphenous שימשו, מה שאיפשר ההשתלה של העצב אטם ב הפיגום axially vascularized עבור עצבוב מוטורי ( "מודל הלולאה EPI") ^36. מלבד השתלת עצב מוטורי, את neurotization של רקמת עצם מהונדס בונה עם עצבי תחושה מדווח להיות מועיל עבור osteogenesis משופרת ותיקון טוב יותר של פגמי עצם ^52. לולאת AV גורמת תחלואת אתר התורם מינימאלית יכולה להיוצר במקומות שונים של הגוף ^52. זה יהיה אפשרי להשתמש כלי שטחי באתרים אחרים שלהגוף לייצור של הלולאה AV או אפילו להשתמש בבעלי חיים אחרים כמו ארנב או במודל של עכברים.

יישומים עתידיים או כיווני לאחר מאסטרינג טכניקה זו
לאחרונה, קבוצת העבודה שלנו מושתלת תא ובתאים אנדותל embryonal murine היטב מאופיין (EPC) קו (T17b) המבטא את guanylate חלבון מחייב-1 (GBP-1) - מעכב סמן ו תאי של פונקציות תא האנדותל כגון התפשטות, הגירה פלישה - במודל לולאת העכברוש AV. קיבולת antiangiogenic של GBP-1-EPC בדיל יכולה להיות הפגינה ידי הפחתה משמעותית של צפיפות כלי דם בונת לולאת AV. באשר ליישום קליני, הליש"ט-1 GTPase antiangiogenic המעודד הדלקת יכולה לפתוח אפיקים חדשים של טיפולי antiangiogenic, למשל. עבור סרטן או מחלות אחרות ^53. בהתבסס על מחקר זה, ניתן לשער כי מודל לולאת AV יכול לשמש להקמת פתולוגירשת כלי דם לניתוח נוסף אפנון אפשרי. לדוגמא, מודל זה מספק הזדמנות אופטימלית כדי להשיג הבנה טובה יותר של אנגיוגנזה גידול, הגורמים המשפיעים שלה ואת התפקיד המדויק של תאים השונים המעורבים ביצירת רשת כלי גידול כגון EPCs, תאים סרטניים ותאי גזע ^54. Vivo במודלי סרטן לעתים קרובות מתבצעים בעכברים מהונדסים גנטי כדי לדמות את התהליכים ומאפייני צמיחה של סוגי הסרטן אנושי השונים הוכיח להיות מצוין לפיתוח תרופה בניסויים בבעלי חיים ^55. יתר על כן, ישנם דגמים xenograft להשתלה גידולים לתוך בחיות מעבדה כגון עכברים החיסון ^56. גישה קלינית הקשורים יותר כרוכה השתלה מן של גידול המטופל, המכונה "במודלים של עכברים אישית" או "מודלי xenografts גידול נגזר החולה" ^57. עם זאת, המודלים האלה אינם מעשיים ללימוד inflלהשפעה של גורם גדילה או מקור תא אחד בודד ללא תופעות מן הרקמה הסובבת.

מודל לולאת AV מאפשר להשתמש בשיטות הנדסת רקמות ללמוד ביולוגית גידול. זה מוגדר כ "הנדסת גידול" על ידי אל רג'ר et. וכרוך "בניית מודלי תרבות מורכבות כי לשחזר היבטים של microenvironment הגידול vivo ללמוד את הדינמיקה של התפתחות גידולים, התקדמות, וטיפול במאזניים מרובים" ^58. סביבת גידול ניתן לבנות בתוך חדר ההשתלה המבודד, המאפשר ניתוח מדויק של אינטראקציות תאי תאים, אנגיוגנזה, אפנון, שיפור ועיכוב. כמו כן, המודל לולאה AV עשוי להועיל לפיתוח או על מנת לאשר טיפולים בדבר הפסקת neoangiogenesis או עיכוב של צמיחת הגידול.

בגישה זו להמרצת כלי דם, אפשר הנדסהרקמות r בגודל רלוונטי קליני. במחקרים נוספים, הצלחנו ליצור רקמת עצם vascularized axially להשתלה עם נפח משמעותי של כ -15 cm³ בתוך זמן קצר יחסית של 12 שבועות ^59,60. כדי לתרגם את הממצאים הללו בפרקטיקה קלינית, הוכחת מחקר עיקרון תוך שימוש במודל פגם השוקה תבוצע בעתיד הקרוב לפני ליישום בבני אדם. כצעד ראשון, נוכל להדגים בהצלחה בהנדסת רקמת העצם באתרו פגם נפח גדול בתרחיש קליני עם יציבות לטווח ארוך ^61. יישום מודל לולאת AV תאר עושה את זה אפשרי לספק טיפול המותאם לדרישות של המטופל. בהתבסס על התוצאות שלנו הרעיון של הגוף האנושי עצמו משמש bioreactor חיים עדיין טומן בחובו הבטחה גדולה לעתיד.

The authors have nothing to disclose.

ברצוננו להודות למוסדות הבאים לתמיכה במחקר לולאה AV שלנו: Staedtler Stiftung, ד"ר פריץ Erler Fonds, Else קרונה Fesenius Stiftung, בקסטר בריאות GmbH, DFG, IZKF / ELAN / EFI / המשרד מגדר גיוון, את Forschungsstiftung Medizin , פרידריך אלכסנדר מאוניברסיטת ארלנגן-נירנברג (FAU), קרן AO, Stiftung מנפרד רוט, Xue הונג, קרן הנס גיאורג Geis, דויטשר Akademischer Austauschdienst (DAAD), גרמניה, ואת המשרד להשכלה גבוהה ולמחקר מדעי, עיראק. ברצוננו להודות סטפן פליישר, מרינה ומילךה, קתרין קוהן אילזה ארנולד-Herberth לקבלת התמיכה הטכנית המעולה שלהם.