Il arterovenosa (AV) loop in un modello di Piccoli Animali per studiare Angiogenesi e ingegneria dei tessuti vascolarizzati

Descriviamo un approccio microchirurgico per la generazione di un loop arterovenosa (AV) come un modello di analisi vascolarizzazione in vivo in un ambiente isolato e ben caratterizzato. Questo modello non è solo utile per l'indagine di angiogenesi, ma è anche perfettamente adatto per l'ingegneria vascolarizzato assialmente e tessuti trapiantabili.

A functional blood vessel network is a prerequisite for the survival and growth of almost all tissues and organs in the human body. Moreover, in pathological situations such as cancer, vascularization plays a leading role in disease progression. Consequently, there is a strong need for a standardized and well-characterized in vivo model in order to elucidate the mechanisms of neovascularization and develop different vascularization approaches for tissue engineering and regenerative medicine.

We describe a microsurgical approach for a small animal model for induction of a vascular axis consisting of a vein and artery that are anastomosed to an arteriovenous (AV) loop. The AV loop is transferred to an enclosed implantation chamber to create an isolated microenvironment in vivo, which is connected to the living organism only by means of the vascular axis. Using 3D imaging (MRI, micro-CT) and immunohistology, the growing vasculature can be visualized over time. By implanting different cells, growth factors and matrices, their function in blood vessel network formation can be analyzed without any disturbing influences from the surroundings in a well controllable environment.

In addition to angiogenesis and antiangiogenesis studies, the AV loop model is also perfectly suited for engineering vascularized tissues. After a certain prevascularization time, the generated tissues can be transplanted into the defect site and microsurgically connected to the local vessels, thereby ensuring immediate blood supply and integration of the engineered tissue. By varying the matrices, cells, growth factors and chamber architecture, it is possible to generate various tissues, which can then be tailored to the individual patient's needs.

La maggior parte dei tessuti e organi del corpo umano sono dipendenti da una rete di vasi sanguigni funzionale che fornisce nutrienti, scambia gas e rimuove i residui. Malfunzionamento del sistema causati da problemi vascolari locali o sistemici può portare a una moltitudine di malattie gravi. Inoltre, in aree di ricerca quali l'ingegneria tissutale o medicina rigenerativa, una rete di vasi sanguigni funzionali all'interno dei tessuti generati artificialmente o organi trapiantati è indispensabile per l'applicazione clinica di successo.

Per decenni i ricercatori hanno studiato gli esatti meccanismi coinvolti nella crescita vascolare al fine di conoscere più a fondo le situazioni patologiche al fine di trovare nuovi interventi terapeutici e fornire una migliore prevenzione dei disturbi vascolari. Nella prima fase, processi di base quali le interazioni cellula-cellula o l'effetto di molecole sulle cellule del sistema vascolare sono solitamente studiati in vitro 2D o 3Desperimenti. modelli 2D tradizionali sono di facile esecuzione, sono ben noti e hanno contribuito notevolmente ad una migliore comprensione di questi processi. Per la prima volta nel 1980, Folkman et al. segnalato nell'angiogenesi vitro semina delle cellule endoteliali capillari sulla gelatina piastre rivestite ^1. Questo ha dato immediatamente modo per pubblicazione di una moltitudine di ulteriori esperimenti angiogenesi 2D su tubo cellule endoteliali formazione test ^2, dosaggio migrazione ³ e la co-coltura di tipi cellulari ^4, così come gli altri. Questi test sono ancora in uso oggi e accettato come standard metodi in vitro.

Tuttavia, questa configurazione sperimentale non è sempre appropriato per lo studio del comportamento delle cellule in vivo poiché la maggior parte tipi cellulari richiedono un ambiente 3D per formare pertinenti strutture dei tessuti fisiologici ^5. Si è potuto dimostrare che l'architettura della matrice 3D è decisiva per capillare morphogenesiS ⁶ e che le interazioni cellula-extra matrice extracellulare (ECM) e cultura 3D condizioni regolano importanti fattori coinvolti nella angiogenesi tumorale ^7. La matrice 3D fornisce ingressi meccanici complessi, in grado di legare le proteine ​​effettrici e stabilire gradienti di concentrazione del soluto dei tessuti scala. Inoltre, si ritiene necessario per imitare in morfogenetica vivo e passaggi rimodellamento dei tessuti complessi ^5. In questi sistemi, sia angiogenesi e vasculogenesi possono essere studiate. Mentre angiogenesi descrive la germinazione dei capillari da vasi sanguigni preesistenti ^8, vasculogenesi si riferisce alla formazione de novo dei vasi sanguigni attraverso le cellule endoteliali o dei loro progenitori ^9,10. La maturazione dei vasi è descritto in un processo chiamato 'arteriogenesis' attraverso il reclutamento delle cellule muscolari lisce ^11. Un angiogenico tipico modello in vitro è la germinazione delle cellule endoteliali da monostrato esistentes testa di serie come un monostrato su superfici gel, sulla superficie di microsfere incorporati all'interno di un gel o con la costruzione di sferoidi di cellule endoteliali ^12. Nei modelli vascolare cellule endoteliali singoli sono intrappolate in un gel 3D. Essi interagiscono con le cellule endoteliali adiacenti per formare strutture e reti de novo vascolari, tipicamente in combinazione con cellule di supporto ^12.

Tuttavia, anche complessa in 3D in modelli in vitro non possono mimare nelle impostazioni vivo completamente dato il gran numero di cellula-cellula e cellula-ECM Interazioni ^13. Le sostanze con un'elevata attività in vitro non mostrano automaticamente gli stessi effetti in vivo e viceversa ^14. Per un'analisi completa di vascolarizzazione processi vi è un urgente bisogno di sviluppare modelli in vivo che meglio simulano la situazione nel corpo. Una vasta gamma di test in vivo di angiogenesi sono descritti in letteratura, tra cui lasaggio pulcino chorioallantoic membrana (CAM), il modello di pesce zebra, il saggio di angiogenesi corneale, il modello di sacca d'aria dorsale, la camera di dorsali plica, i modelli di tumore sottocutaneo ^14. Tuttavia, questi test sono spesso associate a limitazioni, come ad esempio i cambiamenti morfologici rapidi, i problemi nel distinguere nuovi capillari da quelli già esistenti nel test CAM, o lo spazio limitato nel saggio di angiogenesi corneale ^15. Inoltre, vengono utilizzati sistemi non mammiferi (ad es., Il modello zebrafish ^16), che porta a problemi xenotrapianto ^17. Nel modello di tumore sottocutaneo, angiogenesi originari soltanto dal tumore stesso non può essere analizzato in quanto il tessuto adiacente contribuisce notevolmente al processo di vascolarizzazione. Inoltre, il tessuto circostante può avere un ruolo decisivo nel plasmare il microambiente tumorale ^18.

Non solo per lo studio dell'angiogenesi o vasculogenesi c'è un forte NEEd un standardizzato e ben caratterizzato modello in vivo, ma anche per lo studio delle diverse strategie di vascolarizzazione in ingegneria dei tessuti e della medicina rigenerativa. Oggi, la generazione di organi artificiali complessi o tessuti è possibile sia in vitro che in vivo. 3D bioprinting fornisce una tecnica di fabbricazione on-demand per la generazione di tessuti viventi funzionale complesso 3D ^19. Inoltre, bioreattori possono essere utilizzati per generare tessuti ²⁰ o persino il proprio corpo può essere utilizzato come bioreattore ^21. Tuttavia, la barriera principale per applicazione di successo di tessuti generati artificialmente è la mancanza di vascolarizzazione all'interno dei costrutti ingegnerizzati. collegamento immediato vascolare dell'ospite dopo il trapianto è un presupposto fondamentale per la sopravvivenza, specialmente nel caso di tessuti artificiali larga scala o organi.

Diverso in vitro o in vivo strategie prevascularization erano develpato per stabilire una microcircolo funzionale costrutti prima dell'impianto ^22. L'impianto di un ponteggio con in vitro capillari ingegnerizzati preformati sulla pelle dorsale di topi ha portato ad una rapida anastomosi vascolare topi entro un giorno ^23. Al contrario, una co-coltura sferoide costituito da cellule staminali mesenchimali umane della vena ombelicale e cellule endoteliali umane assemblate in una rete prevascolare tridimensionale sviluppato ulteriormente dopo l'impianto in vivo. Tuttavia, anastomosi con il sistema vascolare host è stato limitato ^24. Soprattutto, in difetti poco vascolarizzati, come le aree necrotiche o irradiate, questa cosiddetta estrinseca vascolarizzazione - la crescita interna dei vasi della zona circostante in patibolo - spesso non riesce. Vascolarizzazione intrinseca, invece, si basa su un asse vascolare come fonte di nuovi capillari germinazione nella scaffold ^25. Utilizzando l'approccio vascolarizzazione assiale, L'ingegneria tessutale può essere trapiantato con il suo asse vascolare e collegato alle navi locali nel sito ricevente. Immediatamente dopo il trapianto, il tessuto è adeguatamente supportato da ossigeno e sostanze nutritive, che crea le condizioni per l'integrazione ottimale.

A causa della limitata disponibilità di modelli per lo studio dell'angiogenesi in vivo e in riconoscimento della crescente importanza di generare tessuti assialmente vascolarizzato, abbiamo sviluppato l'approccio microchirurgico di Erol e Spira ulteriormente per generare un loop (AV) artero nel modello animale ^26. L'uso di una camera di impiantazione completamente chiusa rende questo metodo molto adatto per studiare la formazione di vasi sanguigni in "controllata", ben caratterizzata in condizioni in vivo (Figura 1). Questo modello non è utile solo per le indagini di angiogenesi, ma è anche perfettamente adatto per la vascolarizzazione assiale di ponteggi per Engin tessutofini eering.

Il Comitato Animal Care del Friedrich-Alexander di Erlangen-Norimberga (FAU) e il governo della Media Franconia, in Germania, ha approvato tutti gli esperimenti. Per gli esperimenti, i ratti Lewis maschi con un peso corporeo di 300 - sono stati usati 350 g.

1. The Loop Modello artero nel ratto

1. Impianto Procedura (Figura 2)
   1. Per anestesia utilizzare una scatola di plastica speciale che è collegata tramite tubo al vaporizzatore isoflurano e chiusa da un coperchio. Accendere fornitura di gas e flussometro tra 0,8-1,5 L / min.
   2. Posizionare il topo nella scatola di plastica induzione e sigillare la parte superiore. Attivare vaporizzatore isoflurano al 5%.
   3. Osservare attentamente il ratto durante l'induzione dell'anestesia. Dopo 3 - 4 min, il ratto saranno anestetizzati.
   4. Verificare il corretto anestesia: la perdita del riflesso di raddrizzamento, perdita del riflesso palpebrale, riflesso di ritiro, riflesso corneale positivo.
   5. Rimuovere il ratto dalla scatola e controllare la suapeso per il calcolo dei farmaci. Applicare una pomata oculare per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
   6. Somministrare farmaci antidolorifici e antibiotici (ad es., 7,5 mg / kg per via sottocutanea enrofloxacina (SC), 12,5 mg / kg di tramadolo e 100 mg / kg metamizolo sia per via endovenosa (iv)). Somministrare cristalloidi peso-adattato durante il funzionamento (ad es., 30 ml / kg sc).
   7. Posizionare il topo sul dorso su una piastra riscaldante a 37 ° C sotto anestesia con 1 - 2% inalazione isoflurano somministrata tramite maschera.
   8. Monitorare l'anestesia correttamente e aumentare isoflurano se il livello di anestesia è troppo bassa (il movimento del ratto, risposta al dolore, il tono della mascella, nessuna perdita di riflessi (vedi 1.1.4.), La frequenza cardiaca aumentando). Fare attenzione a non overdose isoflurano (perdita dei riflessi corneali, alta frequenza cardiaca, diminuzione della saturazione di ossigeno). Utilizzare una speciale pulsossimetria per piccoli animali per controllare la saturazione di ossigeno (95 - 100%) e la frequenza cardiaca (250 - 450 / min) del ratto. Durante gli operatiil monitoraggio della temperatura del ratto (36 - 40 ° C) e regolare la temperatura della piastra riscaldante, se necessario.
   9. Shave lati interni degli arti posteriori con un rasoio elettrico e disinfettare la zona con antisettici. Distribuire gli arti posteriori e fissarli con nastro adesivo.
   10. Posare il topo sotto un microscopio chirurgico e coprire il ratto con drappeggio sterile. Assicurarsi che l'intera procedura di intervento viene eseguito in condizioni di sterilità.
   11. Aprire la pelle nel mezzo della coscia sinistra con una incisione longitudinale dal ginocchio superiore all'inguine con un bisturi (No. 10).
   12. Tagliare il tessuto sottocutaneo e fascia in strati di circa 3 cm di lunghezza con le forbici dissezione e microforceps finché il fascio vascolare femorale viene esposto dalla arteria pelvica nell'inguine alla biforcazione dell'arteria femorale del ginocchio.
   13. Separare i vasi e rimuovere l'avventizia con le forbici avventizia e microforceps.
   14. Coagulare il lato bRANCHES utilizzando la coagulazione elettrica. Coprire il campo operatorio con un impacco umido.
   15. Aprire la pelle sul lato destro come descritto per il lato sinistro, 1.1.11 - 1.1.14.
   16. Per la raccolta del graft venoso, legare destra vena femorale per coagulazione elettrica sulla estremità prossimale e distale ad una distanza di 1 - 1,5 cm.
   17. Rimuovere l'innesto venoso con microforceps e lavare l'innesto venoso con una soluzione di eparina (50 UI / ml in soluzione di cloruro di sodio allo 0,9%) con una cannula di irrigazione e trasferirlo alla coscia sinistra. Coprire il campo operatorio sul lato destro con una compressa umida.
   18. Legare la vena femorale sul lato sinistro prossimalmente alla regione inguinale con un morsetto microvasi. Coagulare vena femorale distalmente mediante coagulazione elettrica, al ginocchio superiore prima ramificazione, ad una distanza di circa 2 cm.
   19. Per anastomosi collegare l'estremità prossimale dell'innesto venoso con l'estremità prossimale della vena da end-to-end anastomosi con un 11-0 Suture. Utilizzare circa 8 punti staccati. Inizia con ponendo i primi due punti di sutura nelle posizioni ore 12 e ore 6. Poi, mettere in 2 per altre 3 suture tra questi punti sul lato anteriore e poi mettere 2 per altre 3 suture nel lato posteriore.
   20. Legare l'arteria femorale nello stesso modo descritto per la vena femorale (1.1.18.). Assicurarsi che i vasi di loop non siano attorcigliate. Anastomose l'estremità distale del graft venoso con l'estremità prossimale dell'arteria come descritto per la vena femorale (passi 1.1.19.).
   21. Somministrare 25 UI di eparina per via endovenosa. Fare di nuovo che i vasi di loop non siano attorcigliate, rimuovere i morsetti e verificare la presenza di perdite e pervietà del ciclo per circa 5 minuti.
   22. Papaverina Dribble (ad esempio, 4 mg / ml) sulle navi per evitare spasmi vascolari. Se c'è pervietà, il ciclo si espande e si può osservare il polso dell'arteria.
   23. Precompilare la camera di fissaggio con la prima metà (circa 500 ml) della matrice (ad esempio </ Em>, un idrogel o una matrice ossea con o senza cellule). Incorporare il loop nella camera di impiantazione.
   24. Riempire la camera impiantazione con la seconda metà della matrice ad un volume totale di 1000 ml. Sigillare la camera con il coperchio della camera.
   25. Fissare la camera di fissaggio sulla coscia con un non-assorbibile 6-0 suture. Fissare il coperchio della camera con un non-assorbibile 6-0 suture. Smettere di eventuali sanguinamenti con la coagulazione elettrica.
   26. Chiudere la pelle con assorbibili 4-0 punti di sutura. Coprire la ferita con spray in alluminio.
   27. Somministrare antibiotici e analgesici (ad esempio, 7,5 mg / kg sc enrofloxacina, tramadolo 12,5 mg / kg per os (PO) (attraverso l'acqua potabile) per 3 - 5 giorni e poi a seconda del comportamento del ratto).
   28. Girare il vaporizzatore fuori e lasciare il ratto di respirare i gas di alimentazione fino a quando non comincia a svegliarsi.
   29. Posizionare il topo in una scatola con supporto termico e osservare con attenzione fino alla completa guarigione.
   30. Non lasciare le Nazioni Unite topofrequentato fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale.
   31. Non restituire il ratto alla compagnia di altri animali fino alla completa guarigione.
2. procedura espianto
   1. Eseguire l'espianto dopo un breve tempo o di lunga data di impianto (secondo il disegno dello studio, per gli esempi si veda Bibliografia 27-32). Anestetizzare il topo indicato ai punti 1,1,1-1.1.9.
   2. Aprire la pelle dell'addome con un bisturi (No. 10) e spostare l'intestino parte con una compressa. Esporre l'aorta addominale e le tamponi di cotone vena cava caudalis utilizzando.
   3. Cannulate l'aorta addominale (ad es., 24 calibro plastica cannula) e tagliare la vena cava caudale con le forbici dissezione.
   4. Lavare l'aorta addominale con soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% contenente 100 IU / ml di eparina fino il liquido è chiaro. Profumato l'aorta con 30 ml di soluzione di perfusione (ad es., Il contrasto agente o l'India inK).
   5. Euthanize ratto mediante iniezione di una dose letale di embutramide, mebezonium ioduro, soluzione tetracaina cloridrato iniettabile (0.1 - 0.2 ml / kg) in anestesia profonda.
   6. Legare l'aorta addominale e la vena cava caudalis con un non-assorbibile sutura 4-0.
   7. Chiudere l'area ferita aperta con 1 - 2 pinze. Conservare il ratto per 24 ore a 4 ° C (polimerizzazione della soluzione di perfusione).
   8. Posizionare il topo sul dorso. Distribuire gli arti posteriori e fissarli con nastro adesivo.
   9. Aprire la pelle sopra la camera con una incisione longitudinale con un bisturi (No. 10).
   10. Rimuovere il tessuto connettivo dalla camera e il peduncolo ciclo con le forbici dissezione e microforceps. Tagliare il peduncolo ciclo ad una distanza di 1 cm dalla apertura della camera con le forbici dissezione e rimuovere la camera.
   11. Aprire il coperchio della camera e rimuovere con attenzione il costrutto dalla camera con una pinza e fissarlo in 4% soluzione di formalina tamponata per 24 ore a cameratemperatura. Successivamente utilizzare il costrutto per il 3D micro-tomografia computerizzata o inclusi in paraffina per l'analisi istologica ^30.

Ingegneria dei tessuti
Per scopi di ingegneria del tessuto osseo, diversi sostituti ossei sono stati impiantati nel piccolo animale ratto modello ciclo AV ^27,28,33,34. Vascolarizzazione potrebbe perfettamente essere dimostrata da 3D micro-tomografia computerizzata (micro-CT) (Figura 3A). Vascolarizzazione di una matrice bovina elaborato osso spugnoso (PBCB) è risultata significativamente più alta nel gruppo ciclo rispetto al gruppo senza vascolarizzazione. Una rete di vasi sanguigni in costante crescita e maturating sviluppato all'interno della camera di impianto oltre 8 settimane. Tra 4 e 8 settimane, è stata osservata una crescita continua del tessuto vascolarizzato verso il centro dei costrutti, mentre nessun aumento è stato rilevato nel gruppo non vascolarizzato ^33. Prevascularization della matrice PBCB per 6 settimane nel modello ciclo AV portato alla sopravvivenza superiore degli osteoblasti iniettati rispetto ai osteoblasti controllo. In contrasto con i gruppi di controllo, l'espressione di geni specifici per osso è stato rilevato nel gruppo ciclo AV con osteoblasti impiantati ^28. Come ulteriore matrice vetro bioattivo sinterizzato insieme con gel di fibrina è stato impiantato negli anelli AV dei ratti. Dopo 3 settimane, una fitta rete di vasi neoformati ha sviluppato dimostrato da micro-CT ed istologia ^27.

La camera l'impianto è stato modificato al fine di accelerare patibolo vascolarizzazione. Utilizzando una camera di titanio perforata, vascolarizzazione intrinseca è stata supportata da navi estrinseci dal tessuto circostante. A sole 2 settimane dopo l'impianto di un idrossiapatite β-tricalciumphosphate (β-TCP / HA) / matrice di fibrina, 83% delle navi sono stati collegati alla rete AV con un aumento continuo nel tempo e ha raggiunto il 97% di connessione dopo 8 settimane ^34. Con l'impianto di cellule staminali mesenchimali del midollo derivate 5 x 10 ⁶ ossee (MSC) e proteina ossea morfogenetica 2 (BMP-2), un significativo aumento della formazione ossea rispetto alle BMP-2 o MSC soli gruppi potrebbero essere indotti. A 6 e 12 settimane, la matrice di fibrina era completamente degradato e sostituito da tessuto altamente vascolarizzato connettivo tutti i gruppi (Figura 3B sei settimane impianto). C'è stata una diminuzione significativa del numero nave nel gruppo BMP-2 / MSC tra 6 e 12 settimane e dopo 12 settimane negli altri gruppi. Questo è probabilmente dovuto alla maturazione della rete vascolare o la disposizione compatta delle strutture ossee che portano alla formazione della rete vascolare limitata ^32.

Oltre ossa, altri tessuti come i muscoli e il fegato possono essere progettati nel modello di ciclo AV.

Per engineering vascolarizzato assialmente tessuto muscolare, esperimenti con mioblasti primari in una matrice di fibrina ciclo AV sono stati effettuati. Dopo un prevascultempo arization di 2 settimane per 2, 4 e 8 settimane, 1 x 10 ⁶ mioblasti sono stati trapiantati nella camera di ciclo AV. mioblasti trapiantati potrebbero essere nuovamente rilevati anche dopo 8 settimane utilizzando carboxyfluorescein diacetato succinimidyl estere (CFDA) etichettatura. Le cellule mantenuto il loro fenotipo miogenico all'interno della matrice di fibrina e l'espressione dei marcatori specifici del muscolo MEF-2 e desmina è stato positivo dopo 4 settimane. Tuttavia, myogenic espressione gene marcatore è negativo dopo 8 settimane, probabilmente a causa della mancanza di stimoli miogeniche e rapido assorbimento della matrice di fibrina ^35. Per aumentare la stimolazione miogenico, una nuova modifica del ciclo di ratto AV è stato sviluppato utilizzando la vena epigastrica invece della vena safena per ottenere un posizionamento più prossimale della camera di isolamento. Quindi, ulteriore incorporazione della nervo motore otturatore è stato geometricamente facilitato. Utilizzando questa modifica ciclo AV, che viene indicato come il ciclo EPI, abbiamo potuto dimostrare miogenico differentiation di mioblasti co-impiantato e MSC ^36.

Per engineering tessuto epatico 4 x 10 ⁶ PKH-26 etichettati cellule di fegato fetale sono state trapiantate all'interno di una matrice di fibrina nel modello di ratto ciclo AV per 2 settimane. Nel gruppo di controllo, sono stati impiantati matrici senza un ciclo AV e matrici acellulari. capillari funzionali sorti dai vasi ciclo AV e altamente vascolarizzato neo-tessuto è stato osservato nella camera dopo 14 giorni dall'impianto, come dimostrato da CD31 colorazione e etichettatura china. Non c'era alcuna differenza tra il gruppo del ciclo cellulare-libero e epatociti AV. Il ciclo AV vascolarizzato matrice di fibrina densamente e cellule fetali vitali potrebbe essere rilevata dopo espianto dal positivo PKH-26 colorazione e citocheratina 18 immunoistologia specifiche cellule epatiche (CK-18) principalmente in prossimità dell'asse vascolare maggiore. livelli di mRNA di CK-18 sono stati elevati nel gruppo AV cellule ciclo. Al contrario, non CK-18 expression potrebbe essere rilevato in costrutti senza un loop o celle ^37.

Studi angiogenesi
Il ciclo AV è costituito da tre segmenti: la vena, l'innesto arterioso e il segmento interposizionale graft venoso (IVG) (Figura 1). valutazione tridimensionale del sistema vascolare dimostrato che vasi neoformati origine sia dal venose e arteriose porzione nonché dalla interponate venosa. Un gran numero di vasi neoformati sono stati osservati dalla IVG ^33. Con in vivo MRA, microscopia elettronica a scansione di calchi di corrosione e istologia immunitario, è stata osservata l'insorgenza di angiogenesi in una matrice di fibrina tra il giorno 10 e 14. In particolare, venoso e segmenti IVG dato luogo a molti capillari e vasi grandi. Una progressiva riduzione del calibro del lume in segno di arterialization della IVG a causa dell'aumento della pressione endovascolare e wa shear stresss rilevato dal giorno 7 su ^38. In ulteriori studi, potrebbe essere confermato che spuntano vascolare si svolge principalmente presso il trapianto non-arteriosa ^39.

L'analisi esatta dei processi di angiogenesi e la stimolazione e inibizione della formazione dei vasi sanguigni può essere visualizzato nella camera AV ciclo impiantazione. I fattori di crescita vascolare endoteliale fattore di crescita A (VEGFA) e il fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF) indotte una densità vascolare maggiore assoluta e relativa e più veloce riassorbimento della matrice di fibrina rispetto al gruppo di controllo della crescita senza fattore ^31. Inoltre, fenomeni rimodellamento e la maturazione della rete vascolare all'interno della camera di isolamento sono stati visualizzati per un periodo impianto di 8 settimane. In AV sono stati identificati Chambers anello processi di interconnessione intercapillare e l'angiogenesi intussusceptive nel miglior modo possibile la crescita linfatica immunoistologico come parametri di NEla maturazione ovascular ^39. Applicando il PHD (dominio idrossilasi prolil) DMOG inibitore (dimethyloxallyl glicina) sistemica in ratti, si è potuto dimostrare che la concentrazione del fattore alfa ipossia-inducibile (HIF-α) correla con la crescente vascolarizzazione nel ciclo AV ed è un stimolo per nave escrescenza ^40.

Figura 1:. Schema di un ciclo AV nel modello di ratto Il ciclo AV si compone di tre segmenti: la vena (V), il trapianto arteriosa (A) e il segmento di interposizione graft venoso (IVG). Il ciclo AV può essere incorporato in una camera di impianto chiuso (C) per l'induzione della vascolarizzazione intrinseca. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: AV Loop Operazione nel ratto (A):.. La localizzazione del fascio femorale sul lato interno degli arti posteriori di ratto (B / C): Preparazione del fascio vascolare femorale sinistra e destra dell'inguine di il ratto. I vasi sono separati (D), l'interposizione innesto venoso viene raccolto dal lato destro (E) e anastomizzate con la vena femorale (F) e l'arteria femorale del lato sinistro in un loop AV (G, freccia indica anastomosi). I vasi loop vengono trasferite nella camera di impiantazione pre-riempite con una matrice (H) e dopo completo riempimento (I) il coperchio è chiuso (J). A = arteria femorale, V = vena femorale, N = nervo femorale, IVG = interposizionale graft venoso. barra di scala 5 mm (DJ).tp_upload / 54676 / 54676fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Visualizzazione della vascolarizzazione in the Loop modello di ratto AV (A):. Micro-CT dopo perfusione con un mezzo di contrasto (giallo vasi perfusi) (B):. Ematossilina-eosina colorazione di un sostituto osseo β-TCP / HA con MSC impiantato nel AV modello di ciclo di ratto per 6 settimane. I vasi ciclo AV sono perfusi con inchiostro di china (colore nero). Bar Scala 1 mm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Per oltre un decennio, abbiamo utilizzato con successo il ciclo (AV) artero per scopi di ingegneria tissutale e l'angiogenesi studiare in vivo nel piccolo modello animale. Potremmo dimostrare che questo modello di microchirurgia è molto adatto per l'ingegneria dei tessuti diversi e che può essere utilizzato anche per studi di angiogenesi o antiangiogenesi.

Importanza della tecnica con rispetto agli attuali metodi alternativi /
Tessuti o organi ingegnerizzati richiedono una rete dei vasi sanguigni funzionale a fornire le sostanze nutritive e di ossigeno di cui hanno bisogno per la loro sopravvivenza e l'integrazione di successo dopo il trapianto nel sito del difetto ^41. Un certo numero di differenti strategie prevascularization sono stati sviluppati nel corso degli ultimi decenni, che possono essere differenziati in base alle in vitro contro in vivo ed estrinseca vs approcci intrinseci.

Impalcature possono essere fabricaTed con strutture e seminato con cellule vascolari come le cellule endoteliali o cellule progenitrici in vitro ⁴² a forma tubolare. D'altra parte, per prevascularization in vivo, ponteggi vengono impiantati in una zona altamente vascolarizzata come il tessuto sottocutaneo o muscolare ^21. In seguito, questi costrutti estrinsecamente vascolarizzati possono essere trapiantate nel sito del difetto. Tuttavia, lo svantaggio di questi approcci è la mancanza di connessione microchirurgico con i vasi del ricevente dopo il trapianto. Particolarmente nel caso dei costrutti larga scala, il collegamento diretto al sistema vascolare host è essenziale per fornitura immediata della ingegneria tessutale ^43. La soluzione ovvia e più promettente per questo problema consiste nella generazione di un tessuto intrinsecamente vascolarizzato o organo da un asse vascolare, come il modello ciclo AV.

Oltre a utilizzare il metodo ciclo AV come descritto sopra, vascolarizzazione assiale possibile alin modo da essere indotta utilizzando fasci AV invece ⁴⁴ o solo un serbatoio, come l'arteria epigastrica ^45. Tuttavia, in diverse pubblicazioni modello ciclo AV risultato superiore per quanto riguarda il grado di vascolarizzazione e la quantità di de novo formazione di tessuto. Tanaka et al. Rispetto entrambi gli approcci metodologici e osservata la formazione di tessuto significativamente superiore e un maggior grado di capillari di sviluppo nel ciclo rispetto al gruppo di pacchetti ^46. Dong et al. anche condotto uno studio con l'anello AV o AV fascio approcci per l'ingegneria del tessuto osseo in un modello di coniglio, che pure ha mostrato la densità vascolare significativamente più alta nel ciclo rispetto al gruppo di pacchetti ^47. Siamo stati in grado di confermare questi risultati e spettacolo in un precedente studio che il modello ciclo AV ha una maggiore capacità per l'angiogenesi ^48.

Per quanto a nostra conoscenza, non esiste un modello simile per l'analisivascolarizzazione in vivo in un ambiente isolato e ben caratterizzato. Pertanto, il modello di ciclo AV rappresenta un potente strumento per valutare come i diversi tipi di cellule o fattori di crescita contribuiscono alla formazione o di vascolarizzazione processi di rete nave in tessuti diversi, senza disturbi dalle strutture circostanti, come invadere cellule o fattori di crescita.

LIMITI DELLA TECNICA
Tuttavia, una significativa sfida del modello proposto è l'elevata complessità della chirurgia. Per uno, il trattamento dei difetti che utilizzano il modello di ciclo AV richiede una procedura in due fasi - prevascularization del patibolo e il trapianto nel sito del difetto. Ciò significa che il paziente deve sottoporsi due interventi chirurgici. Inoltre, le competenze di microchirurgia sono un prerequisito necessario per successo vasi submillimetriche anastomotici ^49. Pertanto il complesso AV a volte è considerato più utile per l'applicazione clinica dal momento chet offre anche promettente, anche se meno, potenziale di angiogenesi e generazione dei tessuti rispetto all'anello AV ^46. Tuttavia, questa operazione può essere appreso passo dopo passo anche dai non-chirurghi, utilizzando tubi di piccolo calibro in silicone per la formazione in principio e poi i vasi di animali morti (ad esempio, gambe di pollo) prima di fare l'operazione ciclo AV in un animale vivo. Al contrario, più praticati micro-chirurghi possono eseguire questa operazione con solo un breve periodo di addestramento.

I passaggi critici all'interno del protocollo
In generale, a causa del piccolo calibro dei vasi vi è il rischio di formazione di trombi e la chiusura dei vasi loop. Tuttavia, nel modello di ratto 80% -100% dei cicli, in media, sono stati brevetto utilizzando solo di breve durata eparina anticoagulante post-operatorio ^{28,30,31,34,38,39.}

Inoltre, a causa della complessità della chirurgia ci vorranno un paio d'ore (a seconda tha esperienza del chirurgo). È essenziale per verificare il corretto anestesia degli animali durante tutta l'operazione e per fornire adeguatamente infusione per mantenere una pressione sanguigna adeguata. Durante il periodo post-operatorio è di grande importanza per controllare la salute degli animali più volte, per somministrare farmaci analgesici / antibiotici e per controllare la ferita operazione. Poiché nella maggior parte dei casi viene eseguito l'impianto di una camera isolata, è possibile che l'infezione nel interna della camera avviene senza notare. Pertanto, è molto importante per mantenere la sterilità durante l'intera operazione e somministrazione di antibiotici devono accuratamente essere fatto in un periodo di 3 - 5 giorni.

Modifiche del protocollo
La camera può essere regolata individualmente alle dimensioni e alla forma del difetto. Inoltre, anche membrane possono essere utilizzate per racchiudere il ciclo AV interpretato da Manasseri et al. ^50. Inoltre, l'impalcatura, suppcellule ta implementata e fattori di crescita possono essere scelti in funzione dei diversi tipi di tessuto. Recentemente, Miomas et al. Gene combinato approcci terapeutici con successo con il modello di ciclo AV e potrebbe indurre la valorizzazione di crescita dei vasi da trasduzione con VEGF165 ^51. Recentemente, abbiamo regolato l'AV modello di ciclo di ratto a scopo di ingegneria dei tessuti muscolari. Invece dei vasi femorali, la vena epigastrica e l'arteria safena sono stati utilizzati, che ha permesso l'impianto del nervo otturatore nel patibolo assialmente vascolarizzata per innervazione motoria ( "modello di ciclo EPI") ^36. Oltre l'impianto di un nervo motorio, la neurotizzazione del tessuto osseo ingegnerizzato costrutti con i nervi sensoriali è segnalato per essere utile per una maggiore e migliore osteogenesi riparazione di difetti ossei ^52. Il ciclo AV induce minima sito donatore morbilità e può essere creato in vari siti del corpo ^52. Sarebbe possibile utilizzare vasi superficiali in altri siti diil corpo per la generazione del ciclo AV o anche di utilizzare altri animali come il coniglio o il modello di topo.

Le applicazioni future o Indicazioni Dopo aver imparato questa tecnica
Recentemente, il nostro gruppo di lavoro impiantato una linea ben caratterizzato murino embrionale di cellule progenitrici endoteliali (EPC) (T17b) che esprime il legame con le proteine-1 (GBP-1) guanilato - un inibitore marcatore e intracellulare di funzioni delle cellule endoteliali quali la proliferazione, la migrazione e invasione - nel modello di ciclo di ratto AV. La capacità di antiangiogenica differenziata GBP-1-EPC potrebbe essere dimostrata una significativa riduzione della densità dei vasi sanguigni nei costrutti di loop AV. Per quanto riguarda le applicazioni cliniche, il proinfiammatoria antiangiogenica GTPasi GBP-1 potrebbe aprire nuove vie di terapie antiangiogenici, ad es., Per il cancro o di altre malattie ^53. Sulla base di questo studio, è ipotizzabile che il modello di ciclo AV può essere utilizzato per stabilire una patologicarete vascolarizzazione per ulteriori analisi e possibile modulazione. Ad esempio, questo modello fornisce un'opportunità ottimale per ottenere una migliore comprensione di angiogenesi tumorale, suoi fattori che influenzano e il ruolo esatto delle diverse cellule coinvolte nella formazione delle reti vasi tumorali come EPC, cellule tumorali e cellule staminali ^54. In vivo modelli di cancro sono spesso svolte in topi geneticamente modificati per simulare i processi e le caratteristiche di crescita di diversi tipi di cancro umano e hanno dimostrato di essere eccellente per lo sviluppo di farmaci e delle sperimentazioni precliniche ^55. Inoltre, ci sono modelli di xenotrapianto per il trapianto tumori in animali da esperimento come i topi immunocompromessi ^56. Un approccio più clinicamente correlate coinvolge il trapianto dal tumore del paziente, noto come "modelli di mouse personalizzati" o "paziente-derivato xenotrapianti tumorali modelli" ^57. Tuttavia, questi modelli non sono pratici per studiare l'inflinfluenza di un fattore singola fonte o la crescita delle cellule senza effetti dal tessuto circostante.

Il modello di ciclo AV rende possibile l'uso di metodi di ingegneria tissutale per studiare la biologia del tumore. Questo è definito come "ingegneria tumorale" di Ghajar et al. e prevede "la costruzione di modelli di coltura complessi che ricapitolano aspetti del microambiente tumorale in vivo per studiare le dinamiche di sviluppo del tumore, la progressione e la terapia su scale multiple" ^58. Un ambiente tumore può essere costruita entro la camera impiantazione isolato, che permette una precisa analisi delle interazioni cellula-cellula, l'angiogenesi, la modulazione, valorizzazione e inibizione. Inoltre, il modello ciclo AV può rivelarsi utile per lo sviluppo o la convalida terapie riguardanti l'interruzione della neoangiogenesi o l'inibizione della crescita tumorale.

Usando questo approccio per indurre vascolarizzazione, è possibile Engineer tessuti in formato clinicamente rilevante. In ulteriori studi, siamo stati in grado di generare tessuto osseo assialmente vascolarizzato per il trapianto con un volume significativo di circa 15 cm³ in un tempo relativamente breve di 12 settimane ^59,60. Per tradurre questi risultati alla pratica clinica, una prova di principio studio utilizzando il modello di difetto di tibia sarà effettuata nel prossimo futuro, prima per l'applicazione negli esseri umani. Come primo passo, si potrebbe dimostrare con successo in ingegneria del tessuto osseo situ in un grande difetto di volume in uno scenario clinico con stabilità a lungo termine ^61. Applicando il modello ciclo AV descritta rende possibile fornire una terapia su misura per le esigenze del singolo paziente. Sulla base dei nostri risultati idea del corpo umano stesso che serve come un bioreattore vivente mantiene ancora una grande promessa per il futuro.

The authors have nothing to disclose.

Vorremmo ringraziare le seguenti istituzioni per sostenere la nostra ricerca ciclo AV: Staedtler Stiftung, il Dr. Fritz Erler Fonds, Else Kröner Fesenius Stiftung, Baxter Healthcare GmbH, DFG, IZKF / ELAN / EFI / Ufficio per genere e la diversità, la Forschungsstiftung Medizin , Friedrich-Alexander di Erlangen-Norimberga (FAU), AO Foundation, Manfred Roth Stiftung, Xue Hong, Hans Georg Geis Foundation, Deutscher Akademischer Austauschdienst (DAAD), Germania, e il Ministero dell'Istruzione superiore e della ricerca scientifica, l'Iraq. Vorremmo ringraziare Stefan Fleischer, Marina Milde, Katrin Kohn e Ilse Arnold-Herberth per la loro eccellente supporto tecnico.