소형 동물 모델에서의 동정맥 (AV) 루프는 혈관 신생과 혈관을 조성한 조직 공학을 공부하기

우리는 고립과 잘 특성화 된 환경에서 생체 내에서 혈관을 분석하기위한 모델로서 동정맥 (AV) 루프의 생성을위한 미세 수술 방법을 설명합니다. 이 모델은뿐만 아니라 혈관 신생의 조사에 유용 할뿐만 아니라 최적의 엔지니어링 축 방향으로 혈관 및 이식 가능한 조직에 적합합니다.

A functional blood vessel network is a prerequisite for the survival and growth of almost all tissues and organs in the human body. Moreover, in pathological situations such as cancer, vascularization plays a leading role in disease progression. Consequently, there is a strong need for a standardized and well-characterized in vivo model in order to elucidate the mechanisms of neovascularization and develop different vascularization approaches for tissue engineering and regenerative medicine.

We describe a microsurgical approach for a small animal model for induction of a vascular axis consisting of a vein and artery that are anastomosed to an arteriovenous (AV) loop. The AV loop is transferred to an enclosed implantation chamber to create an isolated microenvironment in vivo, which is connected to the living organism only by means of the vascular axis. Using 3D imaging (MRI, micro-CT) and immunohistology, the growing vasculature can be visualized over time. By implanting different cells, growth factors and matrices, their function in blood vessel network formation can be analyzed without any disturbing influences from the surroundings in a well controllable environment.

In addition to angiogenesis and antiangiogenesis studies, the AV loop model is also perfectly suited for engineering vascularized tissues. After a certain prevascularization time, the generated tissues can be transplanted into the defect site and microsurgically connected to the local vessels, thereby ensuring immediate blood supply and integration of the engineered tissue. By varying the matrices, cells, growth factors and chamber architecture, it is possible to generate various tissues, which can then be tailored to the individual patient's needs.

인체의 대부분 조직 및 기관은 영양소를 공급하는 가스 교환 및 노폐물을 제거하는 기능 혈관 네트워크에 의존한다. 로컬 또는 전신 혈관의 문제로 인해이 시스템의 고장은 심각한 질병의 무리로 이어질 수 있습니다. 또한, 이러한 조직 공학 또는 재생 의료 등의 연구 분야에서 인위적으로 생성 된 이식 조직 또는 기관 내에서 기능적 혈관 네트워크가 성공적으로 임상 응용에 필수적이다.

수십 년간 연구가 신규 치료 개입을 찾아 혈관 장애의 예방을 더 제공하기 위해 병리학 적 상황에 대한 깊은 통찰력을 얻을 혈관 성장에 관여하는 정확한 메커니즘을 조사 하였다. 첫 번째 단계에서는, 예컨대 세포 - 세포 상호 작용 또는 혈관계의 세포에 대한 분자의 효과의 기본 프로세스는 일반적으로 시험관 2D 또는 3D에 의해 조사되고실험. 전통적인 2D 모델은 잘 확립되어 쉽게 실행할 수 있으며이 과정에 대한 이해에 크게 기여 하였다. 1980 년 처음으로, 문헌 [Folkman 등. 젤라틴 코팅 된 플레이트 ¹ 모세 혈관 내피 세포의 생체 외 혈관 신생 시드에보고했다. 이것은 바로 더 2D 혈관 내피 세포 관 형성 분석 ^(2), 마이그레이션 분석 ⁽³⁾ 다른 세포 유형 ^4의 공동 배양 실험뿐만 아니라 다른 사람의 다수의 출판물에 방법을 주었다. 이러한 분석은 오늘날 사용되는 체외 방법에서 표준으로 인정된다.

대부분의 세포 유형이 중요한 생리 조직 구조 ^(5)를 형성하는 3 차원 환경을 요구하기 때문에,이 실험 장치는 항상 생체 내에서 세포 거동의 연구에 적합하지 않다. 3D 매트릭스의 아키텍처는 모세관 morphogenesi에 대한 결정적인 것으로 표시 될 수있다(S) ^(6)과 그 셀 세포 외 기질 (ECM)의 상호 작용 및 3D 배양 조건은 종양 혈관 신생에 관여 ⁷ 중요한 요소를 조절한다. 3 차원 행렬은 이펙터 단백질을 결합하고 조직 규모의 용질 농도 구배를 설정할 수 있습니다, 복잡한 기계 입력을 제공한다. 또한,이 복합 조직 ^(5)에 생체 형태 형성 및 리모델링 단계 모방하기 위하여 필요하다고 생각된다. 이러한 시스템에있어서, 혈관 신생 및 혈관 형성을 모두 연구 할 수있다. 혈관 신생은 혈관 ⁽⁸⁾ 기존의 모세 혈관 발아를 설명하지만, 혈관 형성은 내피 세포 또는 전구 세포 ^9,10- 통해 혈관 새로이 형성을 의미한다. 혈관의 성숙 평활근 세포 ^(11)의 채용을 통해 '동맥'이라는 과정을 설명한다. 시험 관내 모델에서 일반적인 혈관 신생은 기존의 단층에서 내피 세포의 발아이고s는 젤에 내장 된 마이크로 스피어의 표면에 겔 표면에 단일 층, 또는 내피 세포 타원체 ^(12)을 구축하여 시드. 혈관 신생 모델에서 하나의 내피 세포는 3D 겔 포획된다. 이들은지지 셀 ^(12)과 일반적으로 조합하여, 혈관의 구조와 새로이 네트워크를 형성하도록 인접하는 내피 세포와 상호 작용한다.

그러나, 생체 설정에서 모방 할 수없는 체외 모델에서 복잡한 3D는 완전히 세포 - 세포의 무리를 주어 세포 ECM ^13의 상호 작용을. 높은 시험 관내 활성 물질은 자동으로 그 반대의 경우도 마찬가지 ^(14)와 동일한 생체 내에서 효과를 표시하지 않습니다. 혈관의 포괄적 인 분석에 더 신체 상황을 시뮬레이션하는 생체 모델의 개발이 절실히 필요가 처리한다. 생체 내 혈관 신생 어 세이의 큰 범위가 포함 문헌에 기재되어있다병아리 융모 막 분석 (CAM), 제브라 피쉬 모델, 각막 신생 혈관 분석, 지느러미 공기 주머니 모델, 지느러미 피부 집계 실, 피하 종양 모델 ^14. 그러나 이러한 분석은 종종 빠른 형태 변화는 CAM 검정, 또는 각막 혈관 신생 어 세이 ⁽¹⁵⁾ 내의 제한된 공간에서 기존의 것과는 구별되는 새로운 모세 혈관의 문제와 같은 제한과 연관된다. 또한, 비 - 포유 동물 시스템이 사용된다 (예., 제브라 피쉬 모델 ^(16))의 이종 이식 ^(17)에 문제를 초래. 인접 조직이 크게 혈관 신생 과정에 기여 때문에 피하 종양 모델에서 종양 자체에서만 발생 혈관을 분석 할 수 없다. 또한, 주변 조직의 종양 미세 환경 ^(18)을 형성하는 데 결정적인 역할을 할 수있다.

뿐만 아니라 혈관 신생 또는 혈관 생성을 공부에 대한 강한 북동가있다에디션에 대한 표준화 및 생체 내 모델에서뿐만 아니라 조직 공학 및 재생 의학에 다른 혈관 전략을 공부 잘 특징. 현재 복합 인공 장기 나 조직의 생성은 시험관 내 및 생체 내 모두에서 가능하다. 차원 bioprinting 복잡한 3D 기능 살아있는 조직 ^{(19)를 발생시키기위한} 주문형 제조 기술을 제공한다. 또한, 바이오 리액터는 조직 ⁽²⁰⁾ 또는 자기 체 생성에 사용될 수는 바이오 리액터 ^(21)로서 사용될 수있다. 그러나, 인위적으로 생성되는 조직의 성공적인 적용의 주요 장벽은 설계 구조 내의 혈관의 부족이다. 이식 후 숙주의 혈관에 직접 연결은 특히 대규모 인공 조직 또는 기관의 경우에 생존의 주요 조건이다.

시험 관내 또는 생체 내 prevascularization 전략에 다른이 (STABLE)했다oped 전에 주입 ⁽²²⁾ 구조의 기능성 미세 혈관을 설정합니다. 쥐의 등 피부에 시험 관내 예비 성형 설계 모세 혈관과 골격의 주입은 하루에 ^23에서 쥐의 혈관의 급속한 문합되었다. 대조적으로, 입체 prevascular 네트워크로 조립 인간 중간 엽 줄기 세포 및 인간 제대 정맥 내피 세포로 구성된 구형 공동 배양은 생체 내 이식 후 더 발전시켰다. 그러나, 호스트와 혈관 문합 ^(24)를 한정한다. 무엇보다도, 이러한 괴사 또는 조사 지역으로 저조한 혈관 결함,에,이 소위 외부 혈관 - 발판으로 주변 지역에서 혈관의 증식은 - 실패 자주. 내장 혈관이, 다른 한편으로는, 지지체 ^(25)에 돋 새로운 모세 혈관의 소스로 혈관성 축선에 기초한다. 축 혈관 접근 방식을 사용상기 설계 조직은 혈관 축 이식 수신자 사이트에서 로컬 용기에 연결될 수있다. 즉시 이식 후 조직을 적절하게 최적의 통합을위한 적절한 조건을 생성 산소 및 영양분에 의해지지된다.

때문에 생체 내 혈관 신생을 조사하는 축 방향 혈관 조직을 생성하는 중요성의 인식에서 모델의 제한된 가용성, 우리는 동물 모델 ^(26)의 동정맥 (AV) 루프를 생성하기 위해 더 에롤과 스피라의 미세 수술 방법을 개발했다. 완전히 폐쇄 된 주입 챔버의 사용은이 방법이 잘 아니라 생체 내 환경에있어서, "제어"(도 1)에 따라, 혈관 형성을 연구하기 위해 적합하다. 이 모델은하지 혈관 신생의 조사에만 유용뿐만 아니라 최적의 조직 지점을 인식하기위한 발판의 축 혈관에 적합eering 목적.

에를 랑겐 - 뉘른베르크의 프리드리히 - 알렉산더 대학의 동물 관리위원회 (FAU) 및 중동 프랑켄 정부, 독일, 모든 실험을 승인했다. 실험을 위해, (300)의 체중을 가진 수컷 루이스 래트 - 350g 사용 하였다.

1. 쥐의 동정맥 루프 모델

1. 주입 절차 (그림 2)
   1. 마취를 들어 뚜껑에 의해 이소 플루 란 기화기에 튜브를 통해 연결 및 폐쇄되는 특수 플라스틱 상자를 사용합니다. 공급 가스의 전원을 켜고 0.8 사이 유량계 - 1.5 L / 분.
   2. 유도 플라스틱 상자에 쥐를 놓고 상단을 밀봉. 5 % 이소 플루 란 기화기를 켭니다.
   3. 조심스럽게 마취 유도시 쥐를 관찰합니다. 3 후 - 4 분, 쥐가 마취됩니다.
   4. 적절한 마취 확인 : 바로 잡고 반사, 눈꺼풀 반사 손실, 철수 반사, 긍정적 인 각막 반사 손실.
   5. 상자에서 쥐를 제거하고 확인의약물의 계산에 무게. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈 연고를 적용합니다.
   6. 진통제와 항생제 투여 (예. 7.5 ㎎ / ㎏ enrofloxacin 피하 (SC), 12.5 ㎎ / ㎏ 트라마돌 및 / kg 설피 린 100 mg을 모두 정맥 주사 (IV)). 운전 중에 체중 적응 결정질를 관리 (예. 30 ㎖ / kg 사우스 캐롤라이나).
   7. 마스크를 통해 투여 2 % 이소 플루 란 흡입 - 1 마취하에 37 ° C에서 온난화 접시에 그 뒷면에있는 쥐를 놓습니다.
   8. 적절 마취 모니터 마취 레벨이 너무 낮 으면 (래트의 운동 통증 반응 턱 톤의 반사 손실 (1.1.4 참조). 심박수 증가)을 이소 플루 란을 증가시킨다. 이소 플루 란 (각막 반사, 높은 심박수, 산소 포화도의 감소의 손실)을 과잉 섭취하지 않도록주의하십시오. (- 100 % 95)과 심장 박동 - 쥐 (250 450 / 분)의 산소 포화도를 확인하기위한 작은 동물을위한 특별한 맥박 산소 측정기를 사용합니다. operati 중쥐의 온도 모니터링에 - 필요한 경우 (36 ~ 40 °의 C) 온난화 판의 온도를 조정합니다.
   9. 전기 면도기와 뒷다리의 내측을 면도 소독제로 소독 영역. 뒷다리 사지를 확산하고 접착 테이프로 고정합니다.
   10. 수술 현미경 쥐를 놓고 멸균 입체 재단으로 쥐를 다룹니다. 전체 작업 절차는 무균 조건 하에서 수행되어 있는지 확인합니다.
   11. 메스 (10 호)를 사용하여 사타구니에 상부 무릎에서 세로 절개와 왼쪽 허벅지의 중간에 피부를 엽니 다.
   12. 대퇴 혈관 번들이 무릎 대퇴 동맥의 분기점에 사타구니의 골반 동맥에서 노출 될 때까지 해부 가위와 microforceps를 사용하여 길이가 약 3cm의 층의 피하 조직 및 근막을 잘라.
   13. 혈관을 분리하고 외막 위 및 microforceps를 사용하여 외막을 제거합니다.
   14. B면 응고전기 응고를 사용하여 목장. 젖은 압축과 조작 필드를 커버.
   15. 1.1.14 - 왼쪽위한 1.1.11 바와 같이 우측의 피부를 연다.
   16. 1.5 cm - 정맥 이식편이 수확, 하나의 거리에 근위 및 원위 단부에서 전기 응집하여 우측 대퇴부 정맥을 결찰.
   17. microforceps와 정맥 이식편을 제거하고 관개 캐 뉼러를 사용하여 헤파린 용액 (0.9 % 염화나트륨 수용액 50 IU / mL)로 정맥 이식편 플러시 왼쪽 허벅지에 옮긴다. 축축한 압축과 오른쪽에있는 작업 영역을 커버.
   18. 근위 미세 혈관 클램프와 서혜부의 좌측 대퇴부 정맥을 결찰. 약 2 ㎝의 거리에서, 분기 전 상부 무릎 전기 응고 원위 대퇴 정맥 응고.
   19. 문합위한 11-0 sutur 함께 종단 간 문합술에 의해 정맥의 기단부와 정맥 이식편의 기단부에 연결이자형. 약 8 중단 봉합사를 사용합니다. 12시와 6시 위치에 처음 두 봉합을 배치하여 시작합니다. 이어서, 전면에 이러한 점 간의 3 개의 봉합사 2에 넣고 배면에 3 개의 봉합사 2을 넣어.
   20. 대퇴 정맥에 대해 기술 된 것과 동일한 방식으로 대퇴부 동맥 결찰 (1.1.18한다.). 루프 혈관이 꼬여 있지 않은지 확인합니다. 대퇴 정맥에 상술 한 동맥의 기단부와 정맥 이식편의 말단부 문합 (단계 1.1.19.).
   21. 정맥 25 IU의 헤파린을 관리 할 수 ​​있습니다. 루프 용기가 트위스트되지 않습니다 다시 확인 클램프를 제거하고 약 5 분 동안 누설 루프의 개통을 확인합니다.
   22. 용기에 드리블 파파 베린 (예를 들어, 4 ㎎ / ㎖)는 혈관 경련을 방지 할 수있다. 개방성이있는 경우, 루프는 팽창 동맥의 펄스가 관찰 될 수있다.
   23. (매트릭스의 첫번째 절반 (약 500 μL)을 주입 챔버를 미리 기입 예 </ EM>, 하이드로 겔 또는 세포 유무에 관계없이 뼈 매트릭스). 주입 챔버로 루프를 포함.
   24. 1000 ㎕의 총 부피로 행렬의 후반부로 주입 챔버를 채운다. 챔버 뚜껑 챔버를 밀봉합니다.
   25. 비 흡수성 6-0 봉합사와 허벅지에 주입 챔버를 수정합니다. 비 흡수성 봉합사 6-0와 챔버 리드를 고정. 전기 응고와 가능한 출혈을 중지합니다.
   26. 흡수성 4-0 봉합사로 피부를 닫습니다. 알루미늄 스프레이와 함께 상처를 커버.
   27. 항생제와 진통제를 관리 (예를 들면, 7.5 ㎎ / ㎏ enrofloxacin 사우스 캐롤라이나, 마시는 물을 통해 운영 체제 (포 당 트라마돌 12.5 ㎎ / ㎏) () 3 - 쥐의 행동에 따라 오일 및 이후).
   28. 오프 기화기를 켜고 그것을 자각하기 시작 때까지 쥐가 공급 가스를 흡입 할 수 있습니다.
   29. 열 지원하는 상자에 쥐를 놓고 완전히 회복 될 때까지주의 깊게 관찰한다.
   30. 쥐 취소를 두지 마십시오이 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 참석했다.
   31. 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사에 쥐를 반환하지 않습니다.
2. 외식 절차
   1. 짧은 시간 또는 긴 시간 주입 후 외식를 수행 (연구 설계에 따라, 예제 참조 27-32 참조). 단계 1.1.1.-1.1.9에 따라 쥐를 마취.
   2. 메스 (10 번)와 복부의 피부를 열고 압축 제쳐두고 창자를 이동합니다. 복부 대동맥과 대정맥 caudalis 사용 면봉을 노출.
   3. 복부 대동맥 (예., 24 게이지 플라스틱 캐 뉼러를) Cannulate 및 해부 가위로 대정맥 caudalis를 잘라.
   4. 누출 유체가 깨끗해질 때까지 100 IU / ㎖의 헤파린을 함유하는 0.9 % 식염수로 복부 대동맥 플러시. (30 ml의 관류 솔루션 대동맥을 관류 예.에 에이전트 또는 인도를 대조케이).
   5. 깊은 마취에서 - (0.2 ㎖ / kg 0.1) embutramide, mebezonium, 요오드화 tetracaine에 염산염 주사 용액의 치사량을 주입하여 쥐를 안락사.
   6. 비 흡수성 봉합사 4-0으로 대정맥 caudalis 복부 대동맥을 결찰하고.
   7. 2 클램프 - 1 오픈 상처 영역을 닫습니다. 4 ° C (관류 액의 경화)에서 24 시간 동안 쥐를 저장합니다.
   8. 그 뒷면에있는 쥐를 놓습니다. 뒷다리 사지를 확산하고 접착 테이프로 고정합니다.
   9. 메스 (10 번)와 세로 절개와 챔버 위의 피부를 엽니 다.
   10. 챔버의 결합 조직 및 해부 가위와 microforceps를 사용하여 루프 척추 경을 제거합니다. 해부 가위로 실 입구에서 1cm의 거리에서 루프 척추 경을 잘라 챔버를 제거합니다.
   11. 챔버의 뚜껑을 열고 조심스럽게 집게와 챔버에서 구조를 제거하고 방에서 24 시간 동안 4 % 포르말린 용액에 고정온도. 이후 3D 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 또는 파라핀 조직 학적 분석 ^(30)의 구조를 사용합니다.

조직 공학
골조직 공학을 위해, 다른 뼈 대체 물질의 수는 작은 동물 쥐 AV 루프 ^27,28,33,34 모델에 이식 하였다. 혈관은 (는) 도심에 3D 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (마이크로 CT) (그림 3A)에 의해 설명 될 수있다. 처리 된 소 해면골 (PBCB) 행렬의 혈관은 혈관이없는 그룹에 비해 루프 군에서 유의하게 높았다. 끊임없이 성장 maturating 혈관 네트워크를 8 주 동안 주입 챔버 내에서 개발 하였다. 더 증가는 비 혈관 기 ^(33)에서 검출되지 않은 반면, 4 주와 8 주 사이의 구조의 중심을 향해 혈관 조직의 지속적인 성장이 관찰되었다. 된 AV 루프 모델 6 주간 PBCB 행렬 Prevascularization는 제어 골아 세포에 비해 주입 된 조골 세포의 생존율이 우수 주도. 대조군과는 대조적으로, 뼈 특정 유전자의 발현은 이식 ²⁸ 골아 세포와 AV 루프 그룹에서 검출되었다. 또 매트릭스 함께 피브린 겔 소결 생활 성 유리는 쥐의 AV 루프에 이식 하였다. 삼주 후, 새로 형성된 혈관의 조밀 한 네트워크는 마이크로 CT 및 조직학 ^(27)에 의해 입증 개발했다.

주입 챔버는 발판 혈관 신생을 촉진하기 위해 수정되었습니다. 천공 티탄 챔버를 사용하여, 극한 혈관 주변 조직으로부터 외부 용기에 의해 지원되었다. β-tricalciumphosphate의 하이드 록시 아파타이트 (β-TCP / HA) / 섬유소 행렬의 주입 후 불과 2 주에, 선박의 83 %는 시간이 지남에 따라 지속적인 증가와 AV 루프에 연결 주와 8 주 ⁽³⁴⁾ 후 97 % 연결에 도달 하였다. 5 × ^106의 골수 유래 중간 엽 줄기 세포의 주입 (함께MSC) 및 뼈 형태 형성 단백질 2 (BMP-2)를 유도 할 수있는 BMP-2 또는 MSC 단독 군에 비해 골 형성이 크게 증가한다. 6 12 주에서, 섬유소 매트릭스는 완전히 분해하고 모든 그룹에서 높은 혈관 결합 조직 (그림 3B 6 주간 주입)로 대체했습니다. 6 12 주 사이에 다른 그룹 12 주후 BMP-2 / MSC 그룹 혈관 수의 유의 한 감소가 있었다. 이는 혈관 망의 성숙 또는 제한된 혈관 네트워크 형성 ^(32)로 이어지는 뼈 구조의 컴팩트 한 배열 아마도이었다.

뼈 이외에도, 근육이나 간 등의 다른 조직에는 AV 루프 모델을 설계 할 수있다.

공학 축 혈관 근육 조직 들면, AV 루프 피브린 매트릭스 아세포 기본으로 실험을 수행 하였다. prevascul 후2, 4 및 8 주 동안 2 주 arization 시간은 1 × ¹⁰⁶ 아세포는 AV 루프 챔버에 이식 하였다. 이식 된 근육 아세포는 카르복시 디 아세테이트의 숙신 이미 딜 에스테르 (CFDA) 라벨을 사용 후에도 팔주 재 검출 될 수있다. 세포는 MEF-2와 최근 desmin 4 주 후에 긍정적 근육 특이 적 마커의 섬유소 매트릭스와 표현 내에서 근육 조직 표현형을 유지했다. 그러나, 근육 조직 마커 유전자 발현 인해 근육 조직 자극 및 피브린 매트릭스 ^(35)의 신속한 흡수 부재 아마도되는 8 주 후 마이너스였다. 근육 조직 자극을 증가시키기 위해, 래트 AV 루프의 새로운 변형 분리 실보다 근위의 위치를 ​​달성하기 위해 대신 복재 정맥 상복부의 정맥을 이용하여 개발 하였다. 따라서, 폐색 운동 신경의 추가 혼입 기하학적으로 용이하게 하였다. 에피 루프라고도이 AV 루프의 변형을 이용하여, 우리는 근육 조직 (D)를 표시 할 수공동 이식 근육 아세포 및 MSC ^(36)의 ifferentiation.

간 조직 공학 4 × 10 ⁶ PKH-26 표지 태아 간 세포 2 주 동안 쥐 AV 루프 모델의 섬유소 매트릭스 내에 이식했다. 대조군에서, AV 루프 및 무 세포 매트릭스없이 매트릭스가 이식 하였다. 기능 모세 혈관은 AV 루프 혈관에서 일어나 CD31 염색과 인도 잉크 라벨 같이 고도로 혈관 신 조직은 이식 14 일 후 챔버 내에서 관찰되었다. 무 세포 및 간세포 AV 루프 그룹간에 차이가 없었다. 된 AV 루프 조밀 피브린 매트릭스 혈관 및 생존 태아 세포는 주로 주요 혈관성 축선 근방에서 포지티브 PKH-26 염색 및 간세포 특이 사이토 케라틴 18 (CK-18) 면역 조직학에 의해 적출 후 검출 될 수있다. CK-18 mRNA 수준은 AV 루프 셀 그룹에서 증가 하였다. 반대로, 더 CK-18 expressio하지N은 루프 또는 셀 ^(37)없이 구조에서 검출 될 수있다.

혈관 신생 연구
정맥, 동맥 이식과 interpositional 정맥 이식편 (IVG) 세그먼트 (그림 1)는 AV 루프는 세 부분으로 구성되어 있습니다. 혈관계의 입체 평가는 새로 형성된 혈관의 정맥과 동맥 부분에서뿐만 아니라 정맥 interponate에서 모두 유래 보였다. 새로 형성된 혈관의 큰 숫자는 IVG ^(33)에서 관찰되었다. 생체 MRA, 부식 캐스트 및 면역 조직학의 주사 전자 현미경으로, 피브린 매트릭스에서 혈관 신생의 시작은 무엇보다도 하루 10과 14 사이에 관찰, 정맥 및 IVG 세그먼트는 많은 모세 혈관 및 큰 혈관에 상승했다. 때문에 혈관 내 압력 및 전단 응력 웨스턴 오스트 레일 리아의 증가에 IVG의 arterialization의 표시로 내강 구경의 점진적 감소³⁸ 일 7 검출 s의. 상기 연구에서, 혈관 발아 주로 비 동맥 이식편 ^(39)에서 이루어지는 것을 확인할 수 있었다.

혈관 신생 과정과 자극 및 혈관 형성의 억제에 대한 정확한 분석은 AV 루프 주입 챔버 내에서 시각화 될 수있다. 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자 A (VEGFA)와 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF)의 더 높은 절대 및 상대 혈관 밀도와 성장 인자가없는 대조군의 ^{31 일에} 비해 피브린 매트릭스의 빠른 흡수를 유도. 또한, 개장 및 현상 분리 챔버 내의 혈관 네트워크의 성숙 8 주 주입 걸쳐 가시화 하였다. AV에서 루프 실 intercapillary 상호 연결 및 intussusceptive 혈관 신생 과정뿐만 아니라 가능한 림프 성장은 네브라스카의 매개 변수로 immunohistologically 확인되었다ovascular 성숙 ^39. 박사 (프 롤릴 수산화 도메인) 전신적 쥐 억제제 DMOG (dimethyloxallyl 글리신)을 적용함으로써, 이는 저산소증 - 유도 성 인자 알파 (HIF-α)의 농도가 AV 루프 성장 혈관과 상관하고 있는지 표시 할 수있다 선박 가지 ^(40)에 대한 자극.

그림 1 :. 정맥 (V), 동맥 (A) 이식과 interpositional 정맥 이식편 (IVG) 세그먼트 : 쥐 모델에서 AV 루프의 구성표 AV 루프는 세 부분으로 구성되어 있습니다. 는 AV 루프가 내장 혈관의 유도 폐쇄 주입 챔버 (C)에 포함 할 수있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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도 2 : 쥐에서 AV 루프 동작 (A).. 쥐 뒷발의 내측 대퇴 다발의 현지화 (B / C)의 좌우 사타구니 대퇴 관다발의 제조 쥐. 선박은 interpositional 정맥 이식은 오른쪽 (E)에서 수확 및 AV 루프에 대퇴 정맥 (F) 및 좌측 대퇴 동맥과 문합되고, (D) 분리 (G는, 화살표는 문합을 나타냅니다). 루프 용기는 매트릭스 (H)로 채워져 주입 챔버 내로 뚜껑 닫은 완전 충전 (I) (J) 후 전송된다. A = 대퇴 동맥, V = 대퇴 정맥, N = 대퇴 신경, IVG는 = interpositional 정맥 이식편. 스케일 바 5mm (DJ).tp_upload / 54676 / 54676fig2large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3 : 쥐 AV 루프 모델에서 혈관 신생의 시각화 (A). 마이크로 CT 조영제 (노란색 혈관 관류)와 관류 후 (B). 헤 마톡 실린 - 에오신와 β-TCP / HA 뼈 대체의 염색 MSC 6 주 동안 AV 루프 모델 쥐에 이식. 는 AV 루프 선박 인도 잉크 (블랙 컬러)를 관류한다. 스케일 바 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

10 년 이상, 우리는 성공적으로 작은 동물 모델에서 생체 내 동정맥 (AV) 조직 공학의 목적을 위해 루프 공부 혈관 신생을 사용하고 있습니다. 우리는이 미세 수술 모델이 다른 조직 엔지니어링 및 그것은 또한 혈관 신생 또는 혈관 신생 연구에 사용할 수있는 매우 적합 함을 입증 할 수있다.

기존 / 대체 방법에 대하여 기술의 중요성
엔지니어링 조직 또는 기관은 결함 사이트 ^(41)에 이식 후 생존 성공적인 통합에 필요한 영양분과 산소를 공급하는 작용 혈관 네트워크를 필요로한다. 다른 prevascularization 전략의 숫자는 체외 대 생체 내 및 외부 대 고유의 접근 방식에 따라 차별화 될 수있는 과거 수십 년에 걸쳐 개발되었다.

비계는 FABRICA 될 수 있습니다테드 관 형상 구조 및 시험관 ⁽⁴²⁾ 내피 세포 또는 전구 세포와 같은 혈관 세포 시드. 한편, 생체 prevascularization위한 지지체는 피하 또는 근육 조직 ^(21)이 높은 혈관 영역에 주입된다. 그 후,이 extrinsically 혈관 구조 결함 부위에 이식 할 수있다. 그러나, 이러한 접근법의 단점은 이식 후 수신자의 용기와 연결 미세 수술의 부족이다. 특히 대형 구조물의 경우에, 호스트 혈관계에 즉시 연결은 조직 공학 ^(43)의 즉각적인 공급을 위해 필수적이다. 이 문제에 대한 명백하고 가장 유망한 솔루션 같은 AV 루프 모델로 혈관 축에 의해 본질적 혈관 조직 또는 기관의 발생에있다.

전술 한 바와 같이, 축이 혈관 알 수있는 AV 루프 방법을 사용하여 또한그래서 상복부 동맥 ⁽⁴⁵⁾ 대신에 ⁽⁴⁴⁾ 또는 단지 하나의 용기와 같은 AV 번들을 사용하여 유도 될 수있다. 그러나, 여러 출판물에서 AV 루프 모델 혈관의 정도와 새로이 조직 형성의 양에 대해서는 우수한 것을 알았다. 다나카 등. 방법 론적 접근 관찰 상당히 높은 조직 형성 및 묶음 기 ^(46)에 비하여 루프 현상 모세관 큰 정도 양을 비교 하였다. 동아 등. 또한 AV 루프를 사용하여 연구를 수행하거나 AV 번들 마찬가지로 묶음 기 ^(47)에 비해 상당히 높은 루프 혈관 밀도를 보였다 토끼 모델에서 골조직 공학을 위해 접근한다. 우리는 AV 루프 모델은 혈관 신생 ^(48)에 대한 높은 용량을 가지고 이전의 연구에서 이러한 결과뿐만 아니라 쇼를 확인할 수 있었다.

우리가 아는 한, 분석에 대한 비교 모델이 없다고립 잘 특성화 된 환경에서 생체 내 혈관. 따라서, AV 루프 모델 세포 유형 또는 성장 인자는 세포 성장 인자 침입 등의 주변 구조물로부터 방해없이 서로 다른 조직에서의 혈관 망 형성 또는 혈관 신생 과정에 기여하는 방법을 다른 평가하기위한 강력한 도구를 나타낸다.

기술의 한계
그러나, 제안 된 모델의 한 가지 중요한 문제는 수술의 높은 복잡도이다. 하나의 경우, AV 루프 모델을 이용하여 결함의 처리는 두 단계 절차를 필요로 - 결함 부위에 스캐 폴드 및 이식을 prevascularization. 이것은 환자가이 수술을 받아야한다는 것을 의미한다. 또한, 미세 수술 기술이 성공 anastomosing 서브 밀리미터 용기 ^(49)의 필수 전제 조건이다. 따라서, AV 번들은 때때로 난 이후 임상 응용 프로그램에 더 유용한 것으로 간주됩니다혈관 신생 및 조직 생성 적은 전위가 AV 루프 ^(46)와 비교하더라도 t는, 유망 제공한다. 그러나이 작업은의 AV 루프 작업을 수행하기 전에 나중에 처음에 훈련과 죽은 동물 (예를 들면, 닭 다리)의 혈관을 작은 구경의 실리콘 튜브를 사용하여, 단계별에도 비 외과 의사에 의해을 배울 수 있습니다 살아있는 동물. 대조적으로, 대부분의 실시 마이크로 외과 훈련 짧은 시간이 작업을 수행 할 수있다.

프로토콜 내에서 중요한 단계
일반적으로 인한 혈관의 작은 구경으로 루프 혈관 혈전 형성 및 폐쇄의 위험이있다. 그러나 평균 루프의 쥐 모델 80 % -100 %에 특허 항 응고 수술 후 ^{28,30,31,34,38,39 헤파린} 만 짧은 시간을 사용 하였다.

수술의 높은 복잡성은 몇 시간 걸릴 것 때문에 또한, (t에 따라그는 외과 의사의 전문 지식). 전체 작동 중에 동물의 적절한 마취를 확인하고 충분하게 적절한 혈압을 유지하는 주입을 제공하는 것이 필수적이다. 수술후 중에 진통제 / 항생제를 투여하고, 수술 상처를 확인하는, 동물 여러번의 상태를 확인하는 높은 중요하다. 대부분의 경우, 분리 된 챔버의 주입이 수행되므로, 상기 챔버의 내부 감염이 경고없이 발생할 가능성이있다. 오일 - 따라서, 항생제의 전체 동작을 관리하고 신중 3에 걸쳐 수행되어야하는 동안 무균 성을 유지하는 것이 매우 중요하다.

의정서의 수정
챔버는 각각 결함의 크기 및 형상으로 조절 될 수있다. 또한,도 막은 Manasseri 등. ^(50)에 의해 수행으로 AV 루프를 둘러싸는 사용할 수 있습니다. 또한, 발판, SUPPlemented 세포 성장 인자는 서로 다른 조직 유형에 따라 선택 될 수있다. 최근 Miomas 등.는 AV 루프 모델과 성공적으로 결합 된 유전자 치료 접근법과 VEGF165 ^(51)로 전달하여 혈관 성장의 향상을 유도 할 수있다. 최근에는 근육 조직 공학 목적을위한 래트 AV 루프 모델을 조정했다. 대신 대퇴부 혈관 중, 상복부 복재 정맥 및 동맥 운동 근육 신경 분포 ( "EPI 루프 모델") ^(36)에 대해 축 방향으로 혈관 지지체에 폐색 신경 이식을 활성화하는 데 사용 하였다. 운동 근육 신경의 주입 외에도, 뼈 조직의 neurotization는 감각 신경과 구조가 개선 된 골 형성 및 골 결손 ^(52)의 더 나은 수리를 위해 도움이 될 것으로보고 설계. 된 AV 루프 최소 공여부 이환율을 유도하고, 본체 ^(52)의 다양한 부위에서 생성 될 수있다. 이는 다른 부위에 표재성 혈관을 사용하여 가능한 것는 AV 루프 또는 생성의 몸은 토끼 나 마우스 모델로 다른 동물을 사용합니다.

이 기술을 마스터 한 후 미래의 응용 프로그램 또는 방향
이러한 증식, 이동 및 내피 세포 기능의 마커 및 세포 억제제 - 최근 우리의 작업 그룹은 단백질 1 (GBP-1)를 결합 구아닐산 표현 잘 특징 뮤린 배아 혈관 내피 전구 세포 (EPC) 라인 (T17b)를 주입 침공 - 쥐 AV 루프 모델입니다. 분화 GBP -1- EPC의 항 혈관 용량은 AV 루프 구조에서 혈관 밀도의 현저한 감소에 의해 입증 될 수있다. 임상 적 적용에 관해서는 염증성 항 혈관 신생는 GTPase GBP-1은 항 혈관 신생 치료의 새로운 길, 예. 암이나 다른 질병 ^53를 열 수 있습니다. 본 연구에 기초하여, 상기 AV 루프 모델 병리를 위해서 사용 될 수 있음을 생각할추가 분석 가능한 변조를위한 혈관 네트워크. 예를 들어,이 모델은 종양 혈관 형성, 그 영향 인자와 같은 내피 전구 세포, 종양 세포로 종양 혈관 망 형성에 관여하는 다른 세포의 정확한 역할을보다 잘 이해할 셀 ^(54)을 막기위한 최적의 기회를 제공한다. 생체 내 암 모델 종종 프로세스와 다른 인간의 암 유형의 성장 특성을 시뮬레이션하기 위해 유전자 변형 생쥐에서 수행하고 신약 개발 및 임상 시험 ^(55)에 대한 우수한 것으로 입증했다. 또한, 이러한 면역 마우스 ⁽⁵⁶⁾ 등의 실험 동물에 종양을 이식을위한 이종 이식 모델이 있습니다. 보다 임상 적으로 관련이 접근법은 "개인화 된 마우스 모델"또는 "환자 유래의 종양 이종 이식 ^{모델"(57)로} 알려진 환자의 종양의 이식을 포함한다. 그러나 이러한 모델은 infl 연구를위한 실용적이지 않다주변 조직에서 효과가없는 하나의 단일 셀 소스 또는 성장 인자의 영향력.

된 AV 루프 모델은 가능한 종양 생물학을 연구 조직 공학 방법을 사용한다. 이것은 Ghajar 등의 알에 의해 "종양 기술"로 정의된다. ⁵⁸ "다수 비늘 종양 발생, 진행 및 치료의 동역학을 연구하기 위해 생체 내 종양 미세 환경의 양상 요점을 되풀이 복합 배양 모델의 구성"을 포함한다. 종양 환경은 세포 - 세포 상호 작용, 혈관 신생, 변조 향상 및 억제의 정확한 분석이 가능 단리 주입 챔버 내에 구성 될 수있다. 또한, AV 루프 모델을 개발하거나 neoangiogenesis의 중단 또는 종양 성장의 억제에 관한 치료를 검증하기위한 유익한 증명할 수있다.

혈관 생성을 유도하는이 방법을 사용하면, enginee 할 수있다임상 관련 크기의 연구 조직. 상기 연구에서는, 12 주 ^{59, 60의} 비교적 짧은 시간에 약 15 ㎤의 상당한 부피 이식 혈관 축 뼈 조직을 생성 할 수 있었다. 임상 적으로 이러한 결과를 해석하기 위해, 경골 결함 모델을 사용하는 원리 연구의 증거 전에 인간 애플리케이션 가까운 미래에 수행 될 것이다. 첫 번째 단계로서, 우리는 성공적 장기간 안정성 ⁶¹ 임상 시나리오 대량 결함에 동일계 골조직 공학을 입증 할 수있다. 상술 한 AV 루프 모델을 적용하는 단계는 개별 환자의 요구에 맞는 치료를 제공 할 수 있습니다. 이러한 결과를 바탕으로 자신이 살아있는 생물 반응기로서 인체의 개념은 여전히 ​​향후 큰 가능성을 보유하고있다.

The authors have nothing to disclose.

우리는 우리의 AV 루프 연구를 지원하기 위해 다음과 같은 기관을 감사드립니다 : STAEDTLER 재단, 박사 프리츠 Erler 퐁, 그렇지 크로네 Fesenius 재단, 박스터 헬스 케어 GmbH의, DFG, 성별에 대한 IZKF / ELAN / EFI / 사무실 및 다양성의 Forschungsstiftung Medizin을 , 에어 랑엔 - 뉘른베르크 (FAU), AO 재단, 프레드 로스 재단, 슈 홍콩, 한스 게오르그 GEIS 재단, 독일 Akademischer Austauschdienst (DAAD), 독일, 고등 교육부와 과학 연구, 이라크의 프리드리히 - 알렉산더 대학. 우리는 우수한 기술 지원 스테판 플라이셔, 마리나 MILDE, 카트린 콘과 일제 아놀드-Herberth에게 감사의 말씀을 전합니다.