Die arteriovenöse (AV) Loop in einem Kleintiermodell zur Untersuchung Angiogenesis und Vaskularisierte Tissue Engineering

Wir beschreiben ein mikrochirurgisches Ansatz zur Erzeugung eines arteriovenösen (AV) loop als Modell Vaskularisierung in vivo in einem isolierten und gut charakterisierten Umgebung zur Analyse. Dieses Modell ist nicht nur nützlich für die Untersuchung der Angiogenese, ist aber auch für den Maschinenbau axial vaskularisiert und transplantierbaren Geweben optimal geeignet.

A functional blood vessel network is a prerequisite for the survival and growth of almost all tissues and organs in the human body. Moreover, in pathological situations such as cancer, vascularization plays a leading role in disease progression. Consequently, there is a strong need for a standardized and well-characterized in vivo model in order to elucidate the mechanisms of neovascularization and develop different vascularization approaches for tissue engineering and regenerative medicine.

We describe a microsurgical approach for a small animal model for induction of a vascular axis consisting of a vein and artery that are anastomosed to an arteriovenous (AV) loop. The AV loop is transferred to an enclosed implantation chamber to create an isolated microenvironment in vivo, which is connected to the living organism only by means of the vascular axis. Using 3D imaging (MRI, micro-CT) and immunohistology, the growing vasculature can be visualized over time. By implanting different cells, growth factors and matrices, their function in blood vessel network formation can be analyzed without any disturbing influences from the surroundings in a well controllable environment.

In addition to angiogenesis and antiangiogenesis studies, the AV loop model is also perfectly suited for engineering vascularized tissues. After a certain prevascularization time, the generated tissues can be transplanted into the defect site and microsurgically connected to the local vessels, thereby ensuring immediate blood supply and integration of the engineered tissue. By varying the matrices, cells, growth factors and chamber architecture, it is possible to generate various tissues, which can then be tailored to the individual patient's needs.

Den meisten Geweben und Organen im menschlichen Körper sind abhängig von einem funktionellen Blutgefäßnetzwerk, das Nährstoffe, tauscht Gase und entfernt Abfallprodukte liefert. Störung dieses Systems verursacht durch lokale oder systemische vaskuläre Probleme können zu einer Vielzahl von schweren Krankheiten führen. Darüber hinaus wird in Forschungsbereichen wie Tissue Engineering oder der regenerativen Medizin, ein funktionelles Blutgefäßnetz innerhalb künstlich erzeugte Gewebe oder transplantierten Organen ist unverzichtbar für eine erfolgreiche klinische Anwendung.

Seit Jahrzehnten Forscher untersuchen wurden die genauen Mechanismen im wachsenden Gefäß beteiligt tieferen Einblick in pathologischen Situationen, um neue therapeutische Interventionen zu finden, gewinnen und eine bessere Prävention von Gefäßerkrankungen bieten. In dem ersten Schritt grundlegende Prozesse wie Zell-Zell - Wechselwirkungen oder der Wirkung von Molekülen auf Zellen des vaskulären Systems werden gewöhnlich durch in vitro 2D- oder 3D suchtenExperimente. Herkömmlichen 2D-Modelle sind einfach durchzuführen, sind gut etabliert und haben stark zu einem besseren Verständnis dieser Verfahren beigetragen. Zum ersten Mal im Jahre 1980 Folkman et al. in vitro Angiogenese Animpfen von kapillaren Endothelzellen auf mit Gelatine beschichteten Platten ¹ angegeben. Man erhielt sofort Weg zur Veröffentlichung einer Vielzahl weiterer Angiogenese 2D Experimenten an Endothelzellen tube formation Assay ^2, Migrationstest ³ und der Co-Kultivierung verschiedener Zelltypen ^4, sowie andere. Diese Tests werden heute noch verwendet und akzeptiert als Standard in vitro - Methoden.

Allerdings ist diese Versuchsaufbau nicht immer geeignet für die Untersuchung von in vivo Zellverhalten , da die meisten Zelltypen eine 3D - Umgebung benötigen relevante physiologische Gewebestrukturen ⁵ zu bilden. Es konnte gezeigt werden, dass die Architektur der 3D-Matrix für die Kapillar morphogenesi entscheidend ists ⁶ und dass zellextrazellulären Matrix (ECM) Wechselwirkungen und 3D - Kulturbedingungen regulieren wichtige Faktoren , die bei der Tumorangiogenese ^7. Die 3D-Matrix bietet komplexe mechanische Eingaben können Effektor-Proteine ​​binden und Gewebe-Skala solute Konzentrationsgradienten herzustellen. Darüber hinaus wird es als notwendig erachtet , um in vivo morphogenetic und Umbau Schritte in komplexen Geweben ⁵ nachzuahmen. In diesen Systemen sowohl Angiogenese und Vaskulogenese untersucht werden. Während der Angiogenese von der Sprießen von Kapillaren beschreibt Blutgefäße bereits existierenden ^8, bezieht sich Vaskulogenese auf die De - novo - Bildung von Blutgefäßen durch Endothelzellen oder deren Vorläufern ^9,10. Die Reifung der Schiffe wird in einem Prozess namens "Arteriogenese" über die Rekrutierung von glatten Muskelzellen ¹¹ beschrieben. Ein typisches angiogenen in - vitro - Modell ist das Sprießen von Endothelzellen aus bestehenden einschichtigens ausgesät als Monoschicht auf Geloberflächen, auf der Oberfläche der Mikrokügelchen in einem Gel eingebettet oder durch den Bau von Endothelzellen Sphäroiden ^12. In vaskulogener Modelle sind einzelne Endothelzellen in einem 3D-Gel eingeschlossen. Sie interagieren mit benachbarten Endothelzellen vaskulären Strukturen und Netzwerke de novo bilden, in der Regel in Kombination mit unterstützenden Zellen ^12.

Aber auch komplexe 3D in vitro Modelle können nicht in vivo nachahmen Einstellungen vollständig die Vielzahl von Zell-Zell und Zell-ECM - Wechselwirkungen ¹³ gegeben. Stoffe mit hoher Aktivität in vitro nicht automatisch die gleichen Effekte in vivo zeigen und umgekehrt ^14. Für eine umfassende Analyse der Vaskularisation verarbeitet es dringend notwendig ist , in vivo - Modelle , die besser simulieren , um die Situation in den Körper zu entwickeln. Eine große Auswahl von in vivo - Angiogenese - Assays sind in der Literatur beschrieben, einschließlich derKüken Chorionallantoismembran Assay (CAM), der Zebrabärbling - Modell, das Hornhaut Angiogenese - Assay wird die dorsale Luftsack Modell, Kammer der Rückenhaut, die subkutanen Tumormodellen ^14. Jedoch sind diese Tests oft mit Einschränkungen verbunden sind , wie eine schnelle morphologische Veränderungen, Probleme bei der Unterscheidung neuer Kapillaren aus schon bestehenden im CAM - Assay oder den begrenzten Raum in der Cornea - Angiogenese - Assay ^15. Weiterhin Nichtsäugetiersystemen verwendet werden (z. B. der Zebrabärbling - Modell ^16), die in der Xenotransplantation ¹⁷ zu Problemen führt. In der subkutanen Tumormodell, mit Ursprung Angiogenese nur vom Tumor selbst nicht analysiert werden kann, da stark das angrenzende Gewebe zu dem Vaskularisierung Prozess beiträgt. Darüber hinaus kann das umgebende Gewebe eine entscheidende Rolle , den Tumor - Mikroumgebung ¹⁸ zu gestalten.

Nicht nur für die Untersuchung der Angiogenese oder Vaskulogenese gibt es eine starke need für eine standardisierte und in - vivo - Modell gut charakterisiert , sondern auch unterschiedliche Vaskularisierung Strategien im Tissue Engineering und der regenerativen Medizin zu studieren. Heute ist die Erzeugung komplexer künstliche Organe oder Gewebe ist möglich , sowohl in vitro als auch in vivo. 3D Bioprinting bietet eine On-Demand - Herstellungstechnik für ¹⁹ komplexe 3D - funktionellen Wohn Gewebe zu erzeugen. Weiterhin kann Bioreaktoren zum Erzeugen Gewebe ²⁰ oder sogar den eigenen Körper verwendet werden kann , als Bioreaktor ²¹ verwendet werden. Jedoch ist das Haupthindernis für eine erfolgreiche Anwendung von künstlich erzeugten Geweben der Mangel an Vaskularisierung innerhalb der Konstrukte. Unmittelbaren Anschluss an das Gefäßsystem des Host nach der Transplantation ist eine wesentliche Voraussetzung für das Überleben, insbesondere im Fall von großen künstlichen Geweben oder Organen.

Verschiedene in vitro oder in vivo Prävaskularisation Strategien waren Entwickckelt eine funktionelle Mikrovaskulatur in Konstrukten der Implantation ²² vor herzustellen. Die Implantation eines Gerüsts mit in vitro vorgeformten engineered Kapillaren auf die Rückenhaut der Mäuse führte zu einer schnellen Anastomose der Mäuse Vaskulatur innerhalb eines Tages ^23. Im Gegensatz dazu ist ein Sphäroid Kokultur bestehend aus humanen mesenchymalen Stammzellen und menschlichen Nabelschnurvenen - Endothelzellen in einem dreidimensionalen Netzwerk prevascular montiert Zellen entwickelt weiter nach in vivo - Implantation. Allerdings Anastomose mit dem Host - Gefäßen wurde ²⁴ begrenzt. Vor allem in schlecht vaskularisierten Defekte wie nekrotischen oder bestrahlten Bereiche, diese so genannte extrinsische Vaskularisierung - das Einwachsen von Gefäßen aus der Umgebung in das Gerüst - oft nicht. Intrinsic Vaskularisation, auf der anderen Seite ist, auf der Grundlage einer Gefäßachse als Quelle neuer Kapillaren in das Gerüst Sprießen ^25. Mit der axial Vaskularisierung AnsatzKann das technisch hergestellte Gewebe mit seiner Gefäßachse transplantiert werden und an die lokalen Gefäße an der Empfängerstelle verbunden. Unmittelbar nach der Transplantation wird das Gewebe ausreichend mit Sauerstoff und Nährstoffen unterstützt, die die Voraussetzungen für eine optimale Integration entsteht.

Aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit von Modellen für in vivo - Angiogenese und in Anerkennung der wachsenden Bedeutung der Untersuchung axial vaskularisierten Gewebe zu erzeugen, entwickelten wir die mikro Ansatz von Erol und Spira weitere ²⁶ eine arteriovenöse (AV) Schleife im Tiermodell zu erzeugen. Die Verwendung einer vollständig geschlossenen Implantationskammer macht dieses Verfahren sehr gut geeignet , um die Blutgefäßbildung unter "kontrollierten", gut charakterisiert in vivo - Bedingungen (Figur 1) zu studieren. Dieses Modell ist nicht nur nützlich für die Untersuchung der Angiogenese, sondern auch optimal für die axiale Vaskularisation von Gerüsten für Gewebe engin geeigneteering Zwecke.

The Animal Care Committee der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU) und der Regierung von Mittelfranken, Deutschland, genehmigt alle Experimente. Für die Versuche männliche Lewis-Ratten mit einem Körpergewicht von 300-350 g verwendet wurden.

1. Die arteriovenöse Loop-Modell in der Ratte

1. Implantationsverfahren (Figur 2)
   1. Zur Anästhesie eine spezielle Kunststoff - Box verwenden , die über ein Rohr mit dem Isofluran Verdampfer und geschlossen mit einem Deckel verbunden ist. Schalten Sie liefern Gas-und Durchflussmesser zwischen 0,8 bis 1,5 l / min.
   2. Legen Sie die Ratte in der Plastikkasten Induktion und versiegeln die Spitze. Schalten Sie Isofluran Verdampfer bis 5%.
   3. Beachten Sie sorgfältig die Ratte während der Einleitung der Narkose. Nach 3 bis 4 min, wird die Ratte narkotisiert.
   4. Bestätigen Sie die richtige Anästhesie: Verlust von Aufrichtreflex, Verlust der Augenlidreflexe, Rückzugsreflex, positive Kornealreflex.
   5. Entfernen Sie die Ratte aus der Box und überprüfen Sie dieGewicht für die Berechnung von Drogen. Bewerben Augensalbe Trockenheit zu verhindern, während der Narkose.
   6. Verabreichen Schmerzmittel und Antibiotika (z. B. 7,5 mg / kg Enrofloxacin subkutan (sc), 12,5 mg / kg Tramadol und 100 mg / kg Metamizol sowohl intravenös (iv)). Administrieren gewichts angepasst Kristalloide während des Betriebs (z. B. 30 ml / kg sc).
   7. Legen Sie die Ratte auf dem Rücken auf einer Wärmeplatte bei 37 ° C unter Anästhesie mit 1 bis 2% Isofluran Inhalation über Maske verabreicht.
   8. Monitor-Narkose richtig und erhöhen Isofluran wenn Anästhesie Pegel zu niedrig ist (Bewegung der Ratte, als Reaktion auf Schmerz, Kiefer Ton, kein Verlust von Reflexen (siehe 1.1.4.), Herzfrequenz zu erhöhen). Seien Sie vorsichtig, nicht zu einer Überdosierung von Isofluran (Verlust der Corneareflexe, hohe Herzfrequenz, Abnahme der Sauerstoffsättigung). Verwenden eine spezielle Pulsoximetrie für kleine Tiere zur Kontrolle der Sauerstoffsättigung (95-100%) und Herzfrequenz (250 bis 450 / min) der Ratte. Während der operatiauf dem Monitor Temperatur der Ratte (36 - 40 ° C) und die Temperatur der Wärmeplatte bei Bedarf anpassen.
   9. Shave die Innenseiten der Hinterbeine mit einem elektrischen Rasierer und desinfizieren Sie den Bereich mit Antiseptika. Verbreiten Sie die Hinterbeine und befestigen Sie sie mit Klebeband.
   10. Legen Sie die Ratte unter einem Operationsmikroskop und decken die Ratte mit sterilen Abdeckung. Sicherzustellen, dass der gesamte Vorgang Verfahren wird unter sterilen Bedingungen durchgeführt.
   11. Öffnen die Haut in der Mitte des linken Oberschenkels mit einem Längsschnitt von der oberen Knie bis zur Leiste unter Verwendung eines Skalpells (No. 10).
   12. Schneiden Sie das subkutane Gewebe und Fascia in Schichten von etwa 3 cm Länge verwendet Dissektionsscheren und microforceps bis die femorale Gefäßbündel von der Beckenarterie in der Leiste an der Gabelung der Femoralarterie im Knie ausgesetzt ist.
   13. Trennen Sie die Gefäße und entfernen Sie die Adventitia mit adventitia Schere und microforceps.
   14. Gerinnen die Seite bRanches elektrische Koagulation verwendet wird. Decken Sie das Operationsfeld mit einem feuchten Kompresse.
   15. Öffnen der Haut auf der rechten Seite, wie für die linke Seite beschrieben ist, 1.1.11 - 1.1.14.
   16. Für den venösen Transplantats Ernte, ligieren die rechte femorale Vene von elektrischen Koagulation auf den proximalen und distalen Enden in einem Abstand von 1 bis 1,5 cm.
   17. Entfernen Sie die venöse Transplantat mit microforceps und spülen Sie das venöse Transplantat mit einer Heparin-Lösung (50 IU / ml in 0,9% Natriumchloridlösung) unter Verwendung einer Spülkanüle und übertragen sie auf den linken Oberschenkel. Decken Sie das Operationsfeld auf der rechten Seite mit einem feuchten Kompresse.
   18. Ligieren die Oberschenkelvene auf der linken Seite proximal am Leistenbereich mit einer microvessel Klemme. Koagulieren die Oberschenkelvene distal durch elektrische Koagulation, an dem oberen Knie vor in einem Abstand von etwa 2 cm Verzweigung.
   19. Für Anastomose verbinden das proximale Ende des venösen Transplantat mit dem proximalen Ende der Vene durch End-to-End-Anastomose mit einem 11-0 Suture. Verwenden Sie ca. 8 unterbrochen Nähten. Beginnen Sie mit den ersten beiden Nähten an den 12 Uhr und 6 Uhr-Position platzieren. Dann wird zwischen diesen Punkten auf der Vorderseite in 2 bis 3 weitere Nähte vorbringen, und dann 2 bis 3 weitere Nähte in der Rückseite.
   20. Ligieren der Femoralarterie in der gleichen Weise für die Oberschenkelvene beschrieben (1.1.18.). Stellen Sie sicher, dass die Schleife Gefäße nicht verdreht sind. Anastomosieren das distale Ende des venösen Transplantats mit dem proximalen Ende der Arterie wie die Oberschenkelvene beschrieben (Schritte 1.1.19.).
   21. Verwalten 25 IE Heparin intravenös. Stellen Sie erneut sicher, dass die Schleife Gefäße nicht verdreht sind, entfernen Sie die Klemmen und auf Dichtigkeit prüfen und die Durchgängigkeit der Schleife für ca. 5 min.
   22. Tröpfeln Papaverin (beispielsweise 4 mg / ml) auf die Gefäße Gefäßspasmen zu verhindern. Wenn es Durchgängigkeit wird, dehnt sich die Schlaufe und der Impuls der Arterie beobachtet werden.
   23. Prefill der Implantationskammer mit der ersten Hälfte (etwa 500 & mgr; l) der Matrix (zB </ Em>, ein Hydrogel oder ein Knochenmatrix mit oder ohne Zellen). Einbetten der Schleife in die Implantationskammer.
   24. Füllen Sie die Implantationskammer mit der zweiten Hälfte der Matrix auf ein Gesamtvolumen von 1000 ul. Verschließen Sie die Kammer mit dem Kammerdeckel.
   25. Fixieren der Implantationskammer auf den Oberschenkel mit einem nicht resorbierbaren Nahtmaterial 6-0. Befestigen Sie den Kammerdeckel mit einem nicht resorbierbaren 6-0 Naht. Stoppen möglich Blutung mit elektrischer Koagulation.
   26. Schließen Sie die Haut mit resorbierbaren 4-0 Nähten. Decken Sie die Wunde mit Aluminium-Spray.
   27. Verabreichen Antibiotika und Analgetika (zB 7,5 mg / kg Enrofloxacin sc, Tramadol 12,5 mg / kg per os (po) (über das Trinkwasser) für 3 bis 5 Tage und danach in Abhängigkeit von dem Verhalten der Ratte).
   28. Schalten Sie den Verdampfer aus und lassen Sie die Ratte Gaszufuhr zu atmen, bis es zu erwachen beginnt.
   29. Legen Sie die Ratte in einem Kasten mit thermischer Unterstützung und beobachten sie vorsichtig, bis sie vollständig erholt.
   30. Sie nicht die Ratte un verlassenbesucht, bis es genügend Bewusstsein zu halten Brustlage wiedergewonnen hat.
   31. Sie nicht die Ratte in die Gesellschaft anderer Tiere zurückkehren, bis sie vollständig erholt.
2. Explantation Verfahren
   1. Führen Sie die Explantation nach einer Kurzzeit- oder Langzeitimplantation (nach dem Studiendesign, für Beispiele siehe Referenzen 27-32). Anesthetize die Ratte nach den Schritten 1.1.1.-1.1.9.
   2. Öffnen Sie die Haut des Bauches mit einem Skalpell (Nr 10) und den Darm zur Seite mit einer Kompresse bewegen. Setzen Sie die Bauchaorta und die Hohlvene caudalis mit Wattestäbchen.
   3. Kanülieren die Bauchaorta (z. B. 24 Gauge Kunststoffkanüle) und schneiden Sie die Hohlvene caudalis mit Dissektionsscheren.
   4. Spülen Sie die Bauchaorta mit 0,9% Natriumchloridlösung, die 100 IU / ml Heparin, bis das austretende Flüssigkeit klar ist. Perfuse die Aorta mit 30 ml Spüllösung (z. B. Kontrastmittel oder Indien ink).
   5. Euthanize die Ratte durch Injektion einer letalen Dosis von Embutramid, Mebezonium Iodid, Tetracain-Hydrochlorid Injektionslösung (0,1 bis 0,2 ml / kg) in tiefer Narkose.
   6. Ligieren der abdominalen Aorta und Vena cava caudalis mit einem nicht resorbierbaren Nahtmaterial 4-0.
   7. Schließen Sie die offene Wunde Bereich mit 1 bis 2 Klemmen. Speichern die Ratten für 24 Stunden bei 4 ° C (Härtung der Perfusionslösung).
   8. Legen Sie die Ratte auf dem Rücken. Verbreiten Sie die Hinterbeine und befestigen Sie sie mit Klebeband.
   9. Öffnen der Haut oberhalb der Kammer mit einem Längsschnitt mit einem Skalpell (No. 10).
   10. Entfernen Sie das Bindegewebe aus der Kammer und die Schleife Stiels mit Dissektionsscheren und microforceps. Schneiden Sie die Schleife Stiel in einem Abstand von 1 cm von der Kammeröffnung mit Dissektionsscheren und die Kammer zu entfernen.
   11. Öffnen Sie den Deckel der Kammer und entfernen Sie vorsichtig das Konstrukt aus der Kammer mit einer Pinzette und fixieren Sie es in 4% gepuffertem Formalin-Lösung für 24 Stunden bei RaumTemperatur. Danach verwenden das Konstrukt für die 3D - Mikro-Computertomographie oder in Paraffin eingebettete für die histologische Analyse ^30.

Tissue Engineering
Für technische Zwecke Knochengewebe, eine Reihe von verschiedenen Knochenersatzmaterialien wurden in der Kleintier Ratte AV Schleife Modell ^27,28,33,34 implantiert. Vaskularisierung könnte perfekt von 3D - Mikrocomputertomographie (Mikro-CT) (3A) gezeigt werden. Vaskularisierung eines verarbeiteten Rinder spongiösen Knochens (PBCB) Matrix war signifikant höher in der Schleife Gruppe im Vergleich zur Gruppe ohne Vaskularisation. Eine ständig wachsende und maturating Blutgefäßnetz innerhalb der Implantationskammer über 8 Wochen entwickelt. Zwischen 4 und 8 Wochen wurde ein kontinuierliches Wachstum des vaskularisierten Gewebes in Richtung der Mitte der Konstrukte beobachtet, während keine Erhöhung der nicht-vaskularisierten Gruppe ³³ detektiert wurde. Prävaskularisation der PBCB Matrix für 6 Wochen in dem Modell AV-Schleife führte zu überlegen Überleben der injizierten Osteoblasten im Vergleich zu den Kontroll Osteoblasten. Im Gegensatz zu den Kontrollgruppen, die Expression von Knochen-spezifische Gene wurde in der AV Schleifengruppe mit implantierten Osteoblasten ²⁸ detektiert. Als eine weitere Matrix gesinterte bioaktive Glas zusammen mit Fibrin-Gel wurde in den AV-Schleifen der Ratten implantiert. Nach 3 Wochen hat sich ein dichtes Netz von neu gebildeten Gefäße durch Mikro-CT und Histologie ²⁷ gezeigt , entwickelt.

Die Implantationskammer wurde modifiziert, um Gerüst Vaskularisierung zu beschleunigen. Unter Verwendung einer perforierten Titankammer, intrinsische Vaskularisierung durch extrinsische Gefäße aus dem umgebenden Gewebe unterstützt. In nur 2 Wochen nach der Implantation eines β-Tricalciumphosphat Hydroxyapatit (β-TCP / HA) / Fibrin - Matrix, 83% der Schiffe wurden an die AV - Schleife verbunden mit einer kontinuierlichen Zunahme im Laufe der Zeit und erreicht 97% Verbindung nach 8 Wochen ^34. Mit der Implantation von 5 x 10 ⁶ Knochenmark stammende mesenchymale Stammzellen (MSC) und bone morphogenetic protein 2 (BMP-2), eine signifikante Erhöhung der Knochenbildung im Vergleich zu BMP-2 oder MSC allein Gruppen induziert werden konnte. Bei 6 und 12 Wochen war die Fibrinmatrix vollständig abgebaut und durch hoch vaskularisierten Bindegewebe in allen Gruppen (3B 6 Wochen Implantations) ersetzt. Es gab eine signifikante Abnahme der Gefäßnummer im BMP-2 / MSC Gruppe zwischen 6 und 12 Wochen und nach 12 Wochen in den anderen Gruppen. Dies war wahrscheinlich auf die Reifung des Gefäßnetzes oder der kompakten Anordnung von Strukturen Knochen in einem begrenzten vaskuläre Netzwerkbildung führt ^32.

Neben Knochen können andere Gewebe wie Muskel oder Leber auch im AV loop Modell konstruiert werden.

Für technische axial Muskelgewebe vaskularisiert, Experimente mit primären Myoblasten in einem AV-loop Fibrinmatrix wurden durchgeführt. Nach einer prevascularization Zeit von 2 Wochen für 2, 4 und 8 Wochen, 1 x 10 ⁶ Myoblasten wurden in die AV Schleifenkammer transplantiert. Transplantierte Myoblasten redetektiert auch nach 8 Wochen mit Carboxyfluoresceindiacetat Succinimidylester (CFDA) Kennzeichnung werden könnte. Die Zellen behielten ihre myogenen Phänotyps in der Fibrinmatrix und die Expression der muskelspezifischen Marker MEF-2 und Desmin nach 4 Wochen positiv war. Jedoch war myogenen Markergenexpression nach 8 Wochen negativ, was wahrscheinlich war aufgrund der Abwesenheit von myogenen Stimuli und eine schnelle Absorption der Fibrinmatrix ^35. Um myogenic Stimulation, eine neue Modifikation des Ratten-AV-Schleife erhöhen wurde mit der epigastrische Vene anstelle der Vena saphena, um eine proximale Positionierung der Isolationskammer zu erreichen, entwickelt. Daher wurde zusätzliche Einbringung des Obturators motorischen Nerven geometrisch erleichtert. Durch die Verwendung dieser AV Schleife Modifikation, die als die EPI-Schleife bezeichnet wird, konnten wir zeigen, d myogenenifferentiation von co-implantierte Myoblasten und ³⁶ MSC.

Für Lebergewebetechnik 4 x 10 ⁶ PKH-26 markierten fötalen Leberzellen wurden für 2 Wochen in einer Fibrinmatrix in der Ratte AV Schleifenmodell transplantiert. In der Kontrollgruppe, Matrizen ohne AV-Schleife und zellfreie Matrices implantiert. Funktionelle Kapillaren ergab sich aus den AV Schleifenbehälter und stark vaskularisierten neo-Gewebe wurde nach 14 Tagen nach der Implantation in der Kammer beobachtet werden, wie durch CD31-Färbung und Tusche Etikettierung. Es gab keinen Unterschied zwischen dem zellfreien und Hepatozyten-AV-Loop-Gruppe. Die AV-loop vaskularisiert die Fibrinmatrix dicht und tragfähig fötalen Zellen konnte nach Explantation durch positive PKH-26-Färbung und Leberzell-spezifisch Cytokeratin 18 (CK-18) Immunhistologie hauptsächlich in der Nähe der Hauptgefäßachse detektiert werden. mRNA-Spiegel von CK-18 wurden in der AV-Loop-Zellengruppe erhöht. Im Gegensatz dazu kein CK-18 expression könnte in Konstrukte ohne eine Schleife oder Zellen nachgewiesen werden ^37.

Angiogenesis Studies
Die AV - Schleife besteht aus drei Segmenten: die Vene, die arterielle Graft und dem interpositional venösen Transplantat (IVG) Segment (Abbildung 1). Dreidimensionale Auswertung des Gefäßsystems gezeigt, dass neu gebildete Gefäße stammen beide von der venösen und arteriellen Teil sowie aus dem venösen Interponat. Eine große Anzahl der neu gebildeten Gefäße wurden aus der IVG ³³ beobachtet. Mit in vivo MRA, Rasterelektronenmikroskopie Korrosions Casts und immune Histologie, das Auftreten von Angiogenese in einer Fibrinmatrix zwischen Tag 10 und 14. Vor allem beobachtet wurde, gab der venösen und IVG Segmente zu vielen Kapillaren und größere Schiffe. Eine schrittweise Verringerung der luminalen Kaliber als Zeichen der Arterialisation des IVG aufgrund der Zunahme der endovaskulären Druck und Scherspannung was von Tag 7 auf ³⁸ festgestellt. In weiteren Studien konnte bestätigt werden , dass vaskuläre sprießen hauptsächlich stattfindet , an dem nicht-arteriellen Transplantat ^39.

Die genaue Analyse der Angiogenese-Prozesse und die Stimulation und Hemmung der Blutgefäßbildung könnte in der AV-Loop-Implantationskammer visualisiert werden. Die Wachstumsfaktoren vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors A (VEGFA) und basischem Fibroblasten - Wachstumsfaktor (bFGF) induzierte eine höhere absolute und relative Gefäßdichte und schnellere Resorption der Fibrinmatrix gegenüber dem Wachstumsfaktor-freien Kontrollgruppe ^31. Ferner wurden Remodeling Phänomene und Reifung des Gefäßnetz innerhalb der Isolationskammer über einer Implantationszeit von 8 Wochen sichtbar gemacht. Im AV-Loop-Kammern Prozesse der interkapilläre Zusammenschaltung und intussusceptive Angiogenese so gut wie möglich wurden lymphatische Wachstum immunohistologically als Parameter ne identifiziertovascular Reifung ^39. Durch Anwendung des PHD (prolyl hydroxylase Domäne) -Inhibitor DMOG (dimethyloxallyl Glycin) systemisch an Ratten konnte gezeigt werden, dass die Konzentration des Hypoxie-induzierbaren Faktor alpha (HIF-α) korreliert mit der wachsenden Vaskularisation in der AV-Schleife und eine Anreiz für die Gefäß Auswuchs ^40.

Abb . 1: Schema eines AV - Loop in der Rattenmodell Die AV - Schleife besteht aus drei Segmenten: die Vene (V), der arteriellen (A) Graft und dem interpositional venösen Transplantat (IVG) Segment. Die AV - Schleife kann in eine geschlossene Implantationskammer (C) für die Induktion der intrinsischen Vaskularisierung eingebettet werden. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 2: AV Loop - Betrieb in der Ratte (A):.. Die Lokalisierung des femoralen Bündel auf der Innenseite der hinteren Extremitäten der Ratte (B / C): Herstellung des femoralen vaskulären Bündel in der linken und der rechten Leiste des die Ratte. Die Behälter werden getrennt (D), die interpositional Venentransplantat von der rechten Seite (E) und anastomosiert mit der Femoralvene (F) und Arteria femoralis von der linken Seite in eine AV - Schleife geerntet wird (G, Pfeil zeigt die Anastomosen). Die Schleifengefäße werden in die Implantationskammer mit einer Matrix (H) und nach vollständiger Füllung (I) der Deckel geschlossen ist (J) vorbefüllt übertragen. A = Femoralarterie, V = Oberschenkelvene, N = N. femoralis, IVG = interpositional venösen Transplantat. Maßstabsbalken 5 mm (DJ).tp_upload / 54676 / 54676fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3: Visualisierung der Vaskularisation in der Ratte AV Loop - Modell (A):. Micro-CT nach Perfusion mit einem Kontrastmittel (gelbe Gefäße durchbluteten) (B):. Hämatoxylin-Eosin - Färbung eines β-TCP / HA Knochenersatz mit MSC für 6 Wochen in der AV-Loop-Modell der Ratte implantiert. Die AV-Loop-Behälter sind mit Tusche (schwarze Farbe) perfundiert. Maßstabsleiste 1 mm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Seit mehr als einem Jahrzehnt haben wir erfolgreich die arteriovenöse (AV) Schleife für das Tissue Engineering Zwecke und das Studium der Angiogenese in vivo im Kleintiermodell verwendet. Wir konnten zeigen, dass dieses Modell für mikrochirurgisches Engineering verschiedenen Geweben sehr gut geeignet ist, und dass es auch für die Angiogenese oder Antiangiogenese-Studien verwendet werden.

Bedeutung der Technik in Bezug auf bestehende / Alternativmethoden
Engineered Gewebe oder Organe erfordern eine funktionelle Blutgefäßnetz , die Nährstoffe und Sauerstoff , den sie benötigen , um ihr Überleben und die erfolgreiche Integration nach der Transplantation in die Defektstelle ⁴¹ zu liefern. Eine Anzahl verschiedener Prävaskularisation Strategien wurden in den vergangenen Jahrzehnten entwickelt, die nach unterschieden werden können in vitro gegen in vivo und extrinsische vs. intrinsische Ansätzen.

Scaffolds kann Fabricaçãoted mit rohrförmigen Strukturen und entkernt mit in vaskulären Zellen, wie Endothelzellen oder Vorläuferzellen - vitro - ^42. Auf der anderen Seite, für die in vivo Prävaskularisation, Gerüste werden in einem stark vaskularisierten Bereich wie subkutane oder Muskelgewebe ²¹ implantiert. Danach können diese extrinsisch gefäß Konstrukte in der Defektstelle transplantiert werden. Jedoch ist der Nachteil dieser Ansätze der Mangel an mikrochirurgisches Verbindung mit dem Empfänger Gefäßen nach der Transplantation. Insbesondere im Fall von großen Konstruktionen, unmittelbare Verbindung zum Host Vaskulatur ist sofort Versorgung des technisch hergestellte Gewebe ⁴³ wesentlich. Die offensichtliche und vielversprechendste Lösung für dieses Problem liegt in der Erzeugung eines eigen vaskularisierte Gewebe oder Organ von einer Gefäßachse, wie die AV-Schleife-Modell.

Neben den AV-Loop-Verfahren, wie oben beschrieben, axiale Vaskularisation kann also induziert werden durch AV - Bündel statt ⁴⁴ oder nur ein Schiff wie die A. epigastrica ⁴⁵ verwendet wird . In mehreren Veröffentlichungen jedoch erwies sich die AV Maschenmodell in Bezug auf Grad der Vaskularisierung und der Menge der de novo Gewebebildung überlegen. Tanaka et al. , Verglichen sowohl methodologische Ansätze und beobachtet deutlich höhere Gewebebildung und ein höheres Maß an Entwicklungs Kapillaren in der Schleife gegenüber dem Bündelgruppe ^46. Dong et al. auch eine Studie , die AV - Schleife oder AV - Bündel Ansätze für Tissue Engineering von Knochen in einem Kaninchenmodell verwendet, das ebenfalls ⁴⁷ im Vergleich zu der Bundle - Gruppe signifikant höhere Gefäßdichte in der Schleife zeigte. Wir konnten diese Ergebnisse sowie Show in einer früheren Studie zu bestätigen , dass das AV - Loop - Modell eine höhere Kapazität für die Angiogenese ⁴⁸ hat.

Nach bestem Wissen und Gewissen, gibt es kein vergleichbares Modell für die AnalyseVaskularisierung in vivo in einem isolierten und gut charakterisierte Umwelt. Daher stellt die AV-loop Modell ein leistungsfähiges Werkzeug für die Bewertung, wie verschiedene Zelltypen oder Wachstumsfaktoren zur Gefäßnetzwerkbildung oder Vaskularisation Prozesse in verschiedenen Geweben, ohne Störungen durch die umgebenden Strukturen beitragen, wie beispielsweise Zellen oder Wachstumsfaktoren eindringenden.

Einschränkungen der Technik
Allerdings ist eine große Herausforderung des vorgeschlagenen Modells die hohe Komplexität der Operation. Zum einen erfordert die Behandlung von Defekten des AV-Loop-Modell unter Verwendung eines zweistufigen Verfahren - Prävaskularisation des Gerüsts und Transplantation in der Defektstelle. Dies bedeutet, dass der Patient zwei Operationen zu unterziehen hat. Darüber hinaus sind mikrochirurgisch Fähigkeiten eine notwendige Voraussetzung für eine erfolgreiche anastomosirenden Submillimeter Gefäße ^49. Daher wird das AV-Bündel manchmal, da ich mehr nützlich für die klinische Anwendung in Betracht gezogent bietet auch vielversprechend, wenn auch weniger, Potenzial für die Angiogenese und Gewebebildung an den AV - Schleife ⁴⁶ verglichen. Allerdings kann dieser Vorgang Schritt- für -Schritt auch von Nicht-Chirurgen lernen, Kleinkalibersilikonschläuche für die Ausbildung am Anfang mit und danach die Gefäße von toten Tieren (zB Hähnchenschenkel) , bevor das AV - Loop - Betrieb in ein tun lebendes Tier. Im Gegensatz dazu die meisten praktizierte Mikrochirurgen können mit nur einer kurzen Zeit der Ausbildung diese Operation auszuführen.

Kritische Schritte im Rahmen des Protokolls
Im Allgemeinen aufgrund der kleinen Kaliber der Gefäße besteht die Gefahr der Thrombusbildung und Schließen der Schleife Gefäße. Jedoch in dem Rattenmodell 80% -100% der Schlaufen im Durchschnitt Patent wurden unter Verwendung nur von kurzer Zeit Heparin - Antikoagulation postoperative ^{28,30,31,34,38,39.}

Außerdem ist es aufgrund der hohen Komplexität der Operation wird es ein paar Stunden dauern (je nach ter Know-how des Chirurgen). Es ist wichtig, die richtige Betäubung der Tiere während der gesamten Operation zu überprüfen und angemessen Infusion zu liefern für eine ausreichende Blutdruck aufrechterhalten wird. Während der postoperativen Phase ist es von großer Bedeutung, um die Gesundheit des Tieres mehrmals zu überprüfen, zu verabreichen Analgetika / Antibiotika und die Operationswunde zu überprüfen. Da in den meisten Fällen die Implantation einer isolierten Kammer durchgeführt wird, ist es möglich, dass eine Infektion in dem inneren der Kammer ohne zu bemerken, auftritt. Daher ist es sehr wichtig, die Sterilität während der ganzen Operation und Verabreichung von Antibiotika vorsichtig über einen Zeitraum von 3 durchgeführt werden sollte, zu halten - 5 Tage.

Änderungen des Protokolls
Die Kammer kann individuell an die Größe und Form des Defektes angepasst werden. Darüber hinaus können auch Membranen zum Einschließen des AV - Schleife von Manasseri wie ausgeführt et al. ⁵⁰ verwendet werden. Darüber hinaus ist die Gerüst, supplemented Zellen und Wachstumsfaktoren können entsprechend den unterschiedlichen Gewebearten ausgewählt werden. Vor kurzem Miomas et al. Kombinierten gentherapeutische Ansätze erfolgreich mit dem Modell AV - Schleife und könnte Verbesserung der Gefäßwachstum durch Transduktion mit ^{51 VEGF165} induzieren. Vor kurzem passten wir die Ratte AV Loop-Modell für die Zwecke des Tissue Engineering Muskel. Anstelle der Femoralgefäße wurden die epigastrische Vene und Arterie Vena verwendet, die Implantation des Obturatornervs im axial vaskularisierten Gerüst für Motorische Innervation ( "EPI - Schleife - Modell") aktiviert ^36. Neben der Implantation eines motorischen Nerven, entwickelt die Neurotisation von Knochengewebekonstrukte mit sensorischen Nerven zu sein , wird berichtet, ⁵² für eine verbesserte Osteogenese und eine bessere Reparatur von Knochendefekten von Vorteil. Die AV - Schleife induziert minimaler Morbidität Donorstelle und kann an verschiedenen Stellen des Körpers ⁵² erzeugt werden. Es wäre möglich, oberflächlichen Gefäße an anderen Standorten zu verwenden, vonder Körper für die Erzeugung des AV-Schleife oder auch andere Tiere, wie Kaninchen oder der Maus-Modell zu verwenden.

Zukünftige Anwendungen oder Anfahrt nach dieser Technik Mastering
Vor kurzem implantiert unserer Arbeitsgruppe eine gut charakterisierte murine embryonale endotheliale Progenitorzellen (EPC) Linie (T17b) die Guanylat-bindende Protein-1 (GBP-1) zum Ausdruck - einen Marker und intrazellulären Inhibitor der endothelialen Zellfunktionen wie Proliferation, Migration und Invasion - bei der Ratte AV Loop-Modell. Die antiangiogene Kapazität von differenzierten GBP-1-EPC könnte durch eine signifikante Reduktion der Blutgefäßdichte in den AV-Schleife Konstrukten nachgewiesen werden. Im Hinblick auf die klinische Anwendung, die proinflammatorischen antiangiogene GTPase GBP-1 könnte neue Wege der anti - angiogenen Therapien eröffnen, z. B. für Krebs oder andere Krankheiten ^53. Basierend auf dieser Studie ist es denkbar, dass das AV-loop-Modell zur Ermittlung eines pathologischen verwendet werden können,Vaskularisierung Netzwerk für die weitere Analyse und mögliche Modulation. Beispielsweise stellt dieses Modell eine optimale Möglichkeit , ein besseres Verständnis der Tumorangiogenese, dessen Einflussfaktoren und die genaue Rolle der verschiedenen Zellen in Tumorgefäßnetzwerkbildung wie EPCs, Tumorzellen und Stammzellen ⁵⁴ beteiligt zu gewinnen. In vivo Krebsmodellen werden häufig in gentechnisch veränderten Mäusen durchgeführt , die Prozesse und die Wachstumseigenschaften von verschiedenen menschlichen Krebsarten zu simulieren und haben für die Arzneimittelentwicklung und präklinischen Studien ⁵⁵ als hervorragend bewährt. Darüber hinaus gibt es Xenograft - Modellen für ⁵⁶ Tumoren in Versuchstieren wie immunsupprimierten Mäusen Umpflanzen. Eine klinisch verwandten Ansatz beinhaltet die Transplantation aus dem Tumor des Patienten, bekannt als "personifizierte Mausmodelle" oder "Patienten stamm Tumorxenografte Modelle" ^57. Allerdings sind diese Modelle nicht praktisch für die Untersuchung der Einfluss eines einzigen Zellquelle oder Wachstumsfaktor ohne Effekte aus dem umgebenden Gewebe.

Der AV-Loop-Modell ermöglicht es, Tissue-Engineering-Methoden zu verwenden, Tumorbiologie zu studieren. Dies wird als "tumor Engineering" von Ghajar et al definiert. und beinhaltet " , um den Bau von komplexen Kulturmodelle , die Aspekte der in - vivo - Tumor - Mikroumgebung rekapitulieren die Dynamik der Tumorentwicklung zu untersuchen, Progression und Therapie auf mehreren Skalen" ^58. Eine Tumorumgebung innerhalb der Implantationskammer isoliert aufgebaut sein, die eine präzise Analyse von Zell-Zell-Wechselwirkungen, Angiogenese, Modulation, Verstärkung und Hemmung ermöglicht. Darüber hinaus kann das AV Maschenmodell vorteilhaft erweisen für die Entwicklung oder Validieren Therapien die Unterbrechung der Neoangiogenese oder die Hemmung des Tumorwachstums über.

Unter Verwendung dieses Ansatzes zur Induzierung Vaskularisierung, ist es möglich, ENGINEEr Gewebe in einem klinisch relevanten Größe. In weiteren Studien konnten wir axial vaskularisierten Knochengewebe für die Transplantation mit einem signifikanten Volumen von etwa 15 cm³ in einer relativ kurzen Zeit von 12 Wochen ^59,60 zu erzeugen. Um diese Erkenntnisse in die klinische Praxis, ein Proof of Principle-Studie mit dem Tibia-Defektmodell zu übersetzen wird in naher Zukunft vor für die Anwendung beim Menschen durchgeführt werden. Als erster Schritt, könnten wir in situ Engineering Knochengewebe in einem großen Volumen Defekt in einem klinischen Szenario mit Langzeitstabilität zeigen , erfolgreich ^61. die beschriebene AV-Loop-Modell Anwendung macht es möglich ist, eine Therapie für den individuellen Bedarf des Patienten zugeschnitten ist. Basierend auf unseren Ergebnissen die Idee des menschlichen Körpers selbst als lebendes Bioreaktor dienen hält immer noch ein großes Versprechen für die Zukunft.

The authors have nothing to disclose.

Wir möchten die folgenden Institutionen danken für unsere AV-Loop-Forschung unterstützen: Staedtler-Stiftung, Dr. Fritz Erler-Fonds, Else Kröner Fesenius Stiftung, Baxter Healthcare GmbH, DFG, IZKF / ELAN / EFI / Amt für Gender und Diversity, die Forschungsstiftung Medizin , Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU), AO-Stiftung, Manfred Roth Stiftung, Xue Hong, Hans Georg Geis-Stiftung, Deutscher Akademischer Austauschdienst (DAAD), Deutschland, und das Ministerium für Hochschulbildung und wissenschaftliche Forschung, der Irak. Wir möchten, dass Stefan Fleischer, Marina Milde, Katrin Köhn und Ilse Arnold-Herberth für ihre hervorragende technische Unterstützung danken.