Um método eficiente para obter células de gordura desdiferenciado

We have modified the conditions for DFAT cell generation and provide herein information regarding the use of an improved growth medium for the production of these cells.

engenharia de tecidos e terapia celular são uma grande promessa clinicamente. A este respeito, as células multipotentes, tais como células estaminais mesenquimais (MSCs), pode ser utilizado terapeuticamente, no futuro próximo, para restaurar a função de órgãos danificados. No entanto, várias questões técnicas, incluindo o procedimento altamente invasivo de isolar MSCs e da ineficiência que cerca sua amplificação, atualmente dificultam o potencial uso clínico dessas modalidades terapêuticas. Aqui, nós apresentamos um método altamente eficiente para a geração de células indiferenciadas de gordura (DFAT), células MSC-like. Curiosamente, as células DFAT podem ser diferenciados em vários tipos de células, incluindo adipogênica, osteogênico, e células condrogênicas. Embora outros grupos apresentaram anteriormente vários métodos para gerar células DFAT a partir de tecido adiposo maduro, nosso método nos permite produzir células DFAT de forma mais eficiente. A este respeito, foi demonstrado que o meio de cultura DFAT (DCM), suplementado com FBS a 20%,é mais eficaz na geração de células DFAT que DMEM, suplementado com 20% FBS. Além disso, as células DFAT produzidos pelo nosso método de cultura de células pode ser redifferentiated em vários tipos de tecidos. Como tal, é apresentado um modelo muito interessante e útil para o estudo de desdiferenciação tecido.

A terapia celular e engenharia de tecidos são tópicos quentes no campo da medicina regenerativa ^1-5. Embora essas modalidades terapêuticas são uma grande promessa, várias questões técnicas actualmente dificultam a sua utilização clínica. A este respeito, como na geração de células iPS, todas as terapias de engenharia de tecidos devem produzir células livres de transduções de genes externos, a fim de manter a segurança do paciente. Dessa forma, foram o primeiro grupo a produzir com sucesso células DFAT humanos ^6. Vários outros grupos de pesquisa têm uma vez adoptada nosso método para gerar células de origem em mamíferos DFAT ^7-9, destacando ainda mais a utilidade do nosso modelo.

Ao longo de vários estudos, verificou-se que a qualidade do ambiente de cultura de células podem ser modificadas por ajustamento do teor do meio celular. Esta descoberta conduziu a um aumento na taxa de sucesso da produção de células DFAT e melhoria da qualidade de células; ambos os fatores críticos paraeficiente geração de células para futuros ensaios clínicos. A este respeito, um melhor meio de cultura DFAT (DCM, um produto semelhante a CTM a forma de células, que contém a insulina recombinante humana, albumina de soro, ácido L-glutâmico, vários ácidos gordos, e colesterol) e um método para a geração de células DFAT e proliferação foi desenvolvido (mais informações sobre o conteúdo do DCM está disponível mediante solicitação). Usando este método de elevada qualidade DFAT células foram gerados com a capacidade de se diferenciar em vários tipos de células, incluindo adipogênica, osteogénica, e as células condrogénicas. Ao todo, este protocolo de cultura celular validado melhora a qualidade das células DFAT e pode ser bastante útil para melhorar aplicações clínicas de terapia celular e engenharia de tecidos.

As amostras de gordura subcutânea humana foram obtidos de pacientes submetidos à cirurgia nos Departamentos de Cirurgia Plástica, Urologia, Cirurgia Pediátrica e Cirurgia Ortopédica da Universidade Nihon Itabashi Hospital (Tóquio, Japão). Os pacientes deram consentimento informado por escrito, e do Comité de Nihon University School of Medicine de Ética aprovou o estudo.

1. Preparação do Tecido

1. Traga a amostra de tecido da sala de operações para o laboratório.
2. Lavar 1-2 g de tecido adiposo com 5 ml de PBS (-) à temperatura ambiente (TA), uma vez, em um tubo de 50 ml e, em seguida, colocar a amostra num prato de plástico de 10 cm.

2. A colagenase digestão

1. Retirar a amostra do PBS (-), em seguida, adicionar 10 ml de solução estéril de 0,1% (w / v) de solução de colagenase (colagenase de tipo II) para o prato que contém a amostra de tecido.
2. Picar o tecido com tesouras cirúrgicas durante aproximadamente 15 minutos, até que se atinja um puré consistemrência.
3. Subsequentemente, digerir o tecido picada no 0,1% (w / v) de solução de colagenase a 37 ° C durante 30 minutos (60 rpm) num tubo de 50 ml com agitação suave num agitador.
4. Filtrar a amostra digerida através de um filtro de 100 um para um tubo de 50 ml. Em seguida, passar 10 ml de DCM (ver Tabela de Materiais) suplementado com FBS a 2% através do filtro.

Isolamento 3. celular

1. Centrifugar as células filtradas em 100 xg durante 1 min à temperatura ambiente.
2. Neste ponto, preparar 5 ml de DCM suplementado com FBS a 2% em um tubo de 50 ml.
3. Em seguida, elaborar as células de gordura flutuantes utilizando uma pipeta ul 1.000 e adicionar as células a um meio contendo 50 ml tubo.
4. Posteriormente, agite o tubo de 50 ml suavemente para misturar o meio DCM com as células.
5. Em seguida, o tubo de centrifugação a 100 xg durante 1 min à temperatura ambiente.
6. Descartar a forma na parte inferior do tubo, usando uma agulha 18 G e seringa de 20 ml.
7. Em seguida, adicione 10 ml de DCM supplemented com FBS a 2% para as células colhidas.
8. Misturar o DCM com as células por agitação no tubo de 50 ml suavemente.
9. Centrifuga-se o tubo a 100 xg durante 1 min à temperatura ambiente.

4. Células chapeamento

1. Adicionar 41 ml de DCM ou DMEM suplementado com FBS a 20% a um frasco de 12,5 centímetros.
2. Em seguida, utilizando uma pipeta de 200 uL adicionar 40 ul de células de gordura para o balão.
3. Em seguida, encher o frasco com DCM ou DMEM suplementado com 20% FBS. Passo crítico: Neste momento, assegurar que as células estão espalhados por todo o meio. Verificar visualmente as células destacadas e depois manter o frasco sobre a tampa de uma placa de Petri rodada para mantê-lo liso.
4. Finalmente, colocar o balão no interior da incubadora e deixá-la sem ser perturbado em uma incubadora de CO ₂ a 5% a 37 ° C durante 7 dias.
5. Na sequência de uma semana de incubação, inverter o frasco e verificar se as células DFAT. Em seguida, avaliar DFAT geração de células de proficiência, como descrito ¹⁰ desde a este ponto fibroblcélulas AST-like (células DFAT) estão localizados em regiões distintas a partir de células de gordura.
6. Adicionar 5 ml de DCM ou DMEM suplementado com FBS a 20% para o balão a seguir à remoção do meio de cultura de células anterior. Permitir que as células DFAT a crescer por mais uma semana depois de mudar o meio.
7. Utilizando um contador de células, contar o número de células DFAT gerados sob várias condições de cultura de células (DCM vs DMEM).

Neste estudo, o método e o kit de ferramentas para a geração de célula DFAT foi melhorada (Figura 1). O nosso método permite gerar células DFAT usando tanto DCM e meio DMEM contendo 20% de FBS (Figura 2A). Como tal, comparou-se a eficiência de DCM e DMEM na geração de células DFAT. A este respeito, o DCM promoveu a proliferação de células DFAT por três vezes quando comparado com DMEM, independentemente do número de adipócitos (Figura 2A e B). Utilizando 20% de FBS, também aumenta o crescimento de células, quando comparado com os protocolos utilizando 10% de FBS (dados não mostrados). Nós também confirmado que as células DFAT produzidos utilizando DCM têm a capacidade de redifferentiate em adipócitos e diferenciam-se em osteoblastos (Figura 3). O método para os ensaios é descrita no nosso estudo anterior ^6.

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Figura 1:. Um diagrama esquemático que descreve o isolamento, desdiferenciação, e cultura de adipócitos maduros Um pequeno pedaço de tecido adiposo foi digerido com 0,1% de colagenase. Após centrifugação, os adipócitos uniloculares foram isolados a partir da camada flutuante. As células isoladas foram cultivadas em frascos cheios com meio contendo FBS a 20% durante 7 dias. Durante a cultura, as células fixadas e achatada para a superfície superior dos recipientes e, em seguida, foram convertidas em células DFAT. Em seguida, os frascos foram invertidas e células DFAT foram cultivadas utilizando métodos convencionais. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: DCM aumenta a geração de células DFAT. ( A) colônias de células DFAT seguintes 14 dias de cultura em DMEM ou DCM. Barra de escala = 200 um (B) a proliferação celular DFAT quantificação em qualquer DMEM ou DCM (média ± DP, n = 3). A eficiência de DCM e DMEM em células DFAT gerando foi comparada. proliferação celular aumentada é observado com a utilização de DCM. Foram quantificados a proliferação de células DFAT utilizando um contador de células, de acordo com as instruções do fabricante. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3:. Potencial multilinhagens de células DFAT células DFAT Humanos gerados usando DCM foram cultivadas durante 3 semanas nos meios de comunicação de indução apropriados para avaliar as habilidades rediferenciação e diferenciação de células DFAT. o cells foram analisadas para osteogênico (ALP e vermelho de alizarina S), adipogênica (Oil red-O) de capacidade. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Adipócitos maduros que passam na desdiferenciação vitro, um processo conhecido como cultura de teto, pode reverter para um fenótipo mais primitivo e ganhar habilidades proliferativa. Estas células são referidas como células de gordura (desdiferenciado DFAT). foi avaliado o potencial de diferenciação das células multilinhagens DFAT. A análise de citometria de fluxo e análise da expressão de genes revelaram que as células DFAT eram altamente homogénea em comparação com ⁶ ASC. Na verdade, o perfil do antigénio da superfície celular de células DFAT é muito semelhante aos encontrados na ASC ^6. Por conseguinte, as células DFAT pode funcionar de forma semelhante para as MSCs.

O outro grupo que tem gerado com êxito células DFAT utilizados num meio de cultura de células F12 de DMEM suplementado com 20% de soro de vitelo ^7-8. Embora uma tentativa para produzir células DFAT usando um meio de cultura celular suplementado com FBS a 10%, o número de células DFAT produzidos com este protocolo foi significativamente menor do que Wgalinha suplementado com FBS a 20% (dados não mostrados). Portanto, a concentração de FBS e / ou o seu conteúdo é importante para qualquer desdiferenciação de células DFAT e / ou proliferação de células DFAT. Como parte de um estudo futuro, vamos tentar elucidar o mecanismo pelo qual o conteúdo de soro rege a geração de células DFAT e proliferação. Por outro lado, o DCM contém menos de glucose, ácidos gordos e outros produtos químicos do que o DMEM utilizado no nosso estudo. Esta variabilidade em cultura de células constituintes do meio pode modular a eficiência de geração de células tanto DFAT e crescimento. Na verdade, a baixa concentração de glicose melhora ligeiramente a eficiência de geração de células DFAT quando se utiliza meio DMEM (dados não mostrados). Embora os mecanismos exactos subjacentes efeito de DCM sobre a geração de células e o crescimento são DFAT desconhecido, postula-se aqui que a concentração de certos constituintes do meio dirige estes eventos celulares. Mais estudos são necessários para esclarecer este ponto. Além disso, uma vez que nós testamos um limited número de formulações de DMEM, experiências adicionais são necessários para comparar a eficiência de outras variações DMEM (por exemplo, meio DMEM contendo L-glutamina ou piridoxina) na produção de células DFAT.

Embora somos capazes de produzir células DFAT, os mecanismos moleculares que regulam a geração de células DFAT ainda é incerto. Questões similares envolvem a produção de células iPS ^11. Como tal uso clínico dessas modalidades terapêuticas vai exigir uma maior exploração dos mecanismos reguladores estaduais celular. Dessa forma, acreditamos fortemente que as células DFAT fornecer um modelo para elucidar como as células retornar a um estado de células-tronco, como, livre de transduções genes externos. protocolos de produção de células DFAT são, portanto, a ser optimizado atualmente para uso em futuros ensaios clínicos.

Garantir que o tratamento de colagenase e gordura isolamento de células são ambos realizados de forma adequada é um fator chave na geração com sucesso células DFAT usando esse protocolo. appruso opriate de tesouras finas e remoção de bolhas durante a cultura também ajuda no aumento da proliferação celular DFAT.

The authors have nothing to disclose.

This research was supported in part by Program for Creating Start-ups from Advanced Research and Technology (START Program) from the Japan Society for the Promotion of Science (ST261006IP, TM) and by Program for the Strategic Research Foundation at Private Universities (2014-2019) (S1411018, TM) from the Ministry of Education, Sports, Science and Technology.