효율적인 방법은 탈분화 지방 세포를 얻는 방법

We have modified the conditions for DFAT cell generation and provide herein information regarding the use of an improved growth medium for the production of these cells.

조직 공학 및 세포 치료는 임상 적으로 큰 약속을 잡으십시오. 이와 관련하여, 이러한 중간 엽 줄기 세포 (MSC들)와 같은 다 능성 세포가 손상된 장기 기능을 복원하기 위해, 가까운 미래에, 치료 학적으로 이용 될 수있다. 그럼에도 불구하고, 중간 엽 줄기 세포의 증폭과 그 주변의 비 효율성을 분리하는 매우 침습적 등 여러 가지 기술적 인 문제는 현재 이러한 치료 양식의 잠재적 임상 사용을 방해. 여기서, 우리는 탈분화 지방 세포 (DFAT) MSC 유사 세포의 생성을위한 매우 효율적인 방법을 소개한다. 흥미롭게도, DFAT 세포는 지방 세포, 골 세포, 연골 세포 및 세포를 포함한 여러 세포 유형으로 분화 될 수있다. 다른 그룹이 이전 성숙한 지방 조직에서 DFAT 세포를 생성하는 다양한 방법을 제시하였으나, 우리의 방법이보다 효율적으로 DFAT 세포를 생성 할 수있다. 이러한 관점에서, 우리는 보여 DFAT 배지 (DCM)는, 20 % FBS로 보충 된 것을20 % FBS 보충 된 DMEM보다 DFAT 세포를 생성하는데보다 효과적이다. 또한 우리의 세포 배양 방법에 의해 제조 DFAT 세포는 여러 조직 유형으로 재분화 될 수있다. 따라서, 조직의 탈분화의 연구를위한 매우 흥미롭고 유용한 모델이 제시된다.

세포 치료 및 조직 공학 재생 의학 ^1-5의 분야에서 뜨거운 주제이다. 이러한 치료 양식은 큰 약속을 보유하지만, 몇 가지 기술적 인 문제는 현재 임상 사용을 방해. 이와 관련하여, IPS 세포의 생성과 모든 조직 공학 요법은 환자의 안전성을 유지하기 위해 외부 유전자 transductions없는 세포를 생산한다. 따라서, 우리는 성공적 DFAT 인간 세포 ^(6)를 제조하는 첫 번째 그룹이었다. 다른 여러 연구 그룹은 이후 더 우리의 모델의 유용성을 강조, 포유 동물 기원 ^7-9의 DFAT 세포를 생성하는 우리의 방법을 채택하고있다.

여러 연구의 과정 동안, 우리는 세포 배양 환경의 품질이 셀 매체의 내용을 조정함으로써 수정 될 수 있음을 발견 하였다. 이 발견은 DFAT 셀 생산 성공률의 증가를 이끌고 셀의 품질을 개선하고있다; 모두 중요한 요인효율적으로 향후 임상 시험에 대한 세포를 생성하는 단계를 포함한다. 이와 관련하여, 그리고 DFAT 셀 생성하는 방법 (유사한 매체 세포 재조합 인간 인슐린, 혈청 알부민, L- 글루탐산, 여러 지방산이 포함 매체 및 콜레스테롤 유래 간엽하는 DCM) 개선 DFAT 배지 및 확산 (DCM의 내용에 대한 자세한 정보는 요청시 사용 가능)을 개발했다. 사용 방법이 고품질 DFAT 세포는 지방 세포, 골 세포, 연골 세포 및 세포를 포함한 여러 세포 유형으로 분화하는 능력을 생성 하였다. 요컨대,이 검증 세포 배양 프로토콜 DFAT 셀의 품질을 향상시켜 세포 치료 및 조직 공학의 임상 적용을 향상시키기위한 매우 유용 할 수있다.

인간의 피하 지방의 샘플은 성형 외과, 비뇨기과, 소아 외과 및 일본 대학 이타바 병원 (도쿄, 일본)의 정형 외과의 부서에서 수술을받은 환자에서 얻었다. 환자는 동의서를 작성 준, 의학의 일본 대학의 윤리위원회는 연구를 승인했다.

1. 조직 준비

1. 실험실에 수술실에서 조직 샘플을 가져와.
2. (-) 5 ml의 PBS로 세척 된 지방 조직의 1-2 g이어서 50 ㎖ 튜브에서 한번 실온 (RT)에서, 그리고 10cm의 플라스틱 접시에 시료를 배치했다.

2. 콜라게나 소화

1. (-)를 PBS에서 샘플을 제거 멸균 0.1 % 10ml를 부가 한 다음 (/ w를 V) 조직 샘플을 함유하는 접시 콜라게나 제 용액 (콜라게나 제 II 형).
2. 이 구성 퓌레에 도달 할 때까지 약 15 분 동안 수술 용 가위로 조직을 잘게ency.
3. 이어서, 0.1 %의 다진 조직 진탕 기에서 교반과 함께 50 ㎖ 튜브에서 30 분 (60 RPM)에서 37 ° C에서 (w / v)의 콜라게나 제 용액을 소화.
4. 50 ㎖의 튜브에 100 μm의 필터를 통해 샘플 분해 필터. 다음에, 필터를 통해 2 % FBS로 보충 된 10 ml의 DCM을 (자재 표 참조)를 통과한다.

3. 세포 분리

1. 실온에서 1 분 동안 100 XG에서 필터링 된 세포를 원심 분리기.
2. DCM는 50 ㎖ 튜브에서 2 % FBS로 보충 된이 시점에서, 5 ㎖를 준비한다.
3. 다음으로, 1,000 μL 피펫을 사용하여 부동 지방 세포를 작성하고 50 ㎖ 튜브 함유 배지에 세포를 추가합니다.
4. 그 후, 세포와 DCM 매체를 섞어 부드럽게 50 ML 튜브를 흔들.
5. 그 후, 실온에서 1 분 동안 100 XG에서 튜브를 원심 분리.
6. 18 G 바늘 및 20 ㎖ 주사기를 사용하여 튜브의 아래쪽 배지를 버리고.
7. 다음으로, DCM의 10 ㎖를 추가수집 된 세포를 2 % FBS와 upplemented.
8. 부드럽게 50 ML 튜브를 흔들어 세포와 DCM을 섞는다.
9. 실온에서 1 분 동안 100 XG에 튜브를 원심 분리기.

4. 도금 세포

1. 12.5 cm 플라스크에 20 % FBS와 보충 DCM 또는 DMEM의 41 ML을 추가합니다.
2. 다음으로, 200 μL 피펫은 플라스크에 지방 세포의 40 μl를 추가하여.
3. 그런 다음, 20 % FBS와 보충 DCM 또는 DMEM으로 술병을 입력합니다. CRITICAL STEP :이 시점에서, 세포는 배지에 걸쳐 확산되도록. 시각적으로 분리 된 세포를 확인하고 나중에 평면을 유지하기 위해 라운드 페트리 접시의 뚜껑에 플라스크를 유지합니다.
4. 마지막 인큐베이터 안에 플라스크를 배치하고 7 일 동안 37 ℃, 5 % CO ₂ 인큐베이터에서 흐트러 떠난다.
5. 배양 일주일 후, 플라스크를 반전하고 DFAT 세포를 확인합니다. 이 시점 fibrobl에서부터 ^{10 설명 된대로} 다음, DFAT 세포 생성 능력을 평가AST와 같은 세포 (DFAT 세포)는 지방 세포에서 특정 영역에 있습니다.
6. DCM 또는 DMEM 5 ㎖의 추가 이전의 세포 배양 배지를 제거한 다음, 플라스크에 20 % FBS가 보충. DFAT 세포 매체를 변경 한 후 다른 주 동안 성장하도록 허용합니다.
7. 세포 계수기를 사용하여, 다양한 세포 배양 조건 (DMEM 대 DCM) 하에서 생성 DFAT 세포의 수를 계산.

이 연구에서, DFAT 세포 생성을위한 방법 및 키트는 (도 1)을 개선 하였다. 우리의 방법은 우리 DCM 및 20 % FBS (도 2a)를 함유하는 DMEM 배지를 모두 사용 DFAT 세포를 생성 할 수있다. 이에 따라 DFAT 세포를 생성하고 DCM DMEM 효율을 비교 하​​였다. 관계없이 지방 세포의 개수 (도 2A와 B)의 DMEM에 비해 이와 관련하여, DCM 세 배 DFAT 세포의 증식을 강화. 10 % FBS (도시되지 않은 데이터)를 사용하여 프로토콜과 비교했을 때 20 % FBS 사용은 세포 성장을 향상시킨다. 우리는 추가로 DCM을 사용하여 제조 DFAT 셀 (도 3)를 지방 세포로 재분화 및 조골 세포로 분화 할 수있는 능력을 갖고 있음을 확인 하였다. 분석법 방법은 이전 연구 ^6에서 설명한다.

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그림 1 :. 분리, 탈분화를 나타내는 개략도, 성숙한 지방 세포의 배양 지방 조직의 작은 조각은 0.1 % 콜라게나로 소화했다. 원심 분리 후, 단원제의 지방 세포는 부동 층으로부터 분리 하였다. 분리 된 세포는 배지 7 일 동안 20 % FBS를 함유하는 충전 플라스크에서 배양 하였다. DFAT 세포로 변환 된 후, 배양하는 동안 세포 부착 플라스크의 상부면에 평평. 다음, 플라스크 반전하고 DFAT 세포는 통상적 인 방법을 사용하여 배양 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2 : DCM이 DFAT 세포 생성을 향상시킵니다. ( A) DMEM 또는 DCM 문화 14 일 다음과 같은 DFAT 세포 식민지. DMEM 또는 DCM 중 하나의 스케일 바 = 200 μm의 (B) DFAT 세포 증식의 정량화 (SD ± 의미, N = 3). 생성 DFAT 세포 DCM 및 DMEM의 효율을 비교 하​​였다. 향상된 세포 증식은 DCM을 사용하여 관찰된다. 우리는 제조 업체의 지시에 따라, 셀 카운터를 사용하여 DFAT 세포의 증식을 정량화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 3 :. DCM을 사용하여 생성 DFAT 셀 Multilineage 전위 인간 DFAT 세포 DFAT 세포의 분화 및 재분화의 능력을 평가하는 적절한 유도 배지에서 3 주간 배양 하였다. 는 CELL 학생은 골 형성 (ALP 및 알리자린 레드 S), 지방 세포 (오일 레드 O) 용량을 분석 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

시험관 탈분화에 천장 문화로 알려진 과정을 거쳐 성숙한 지방 세포는 더 원시적 인 표현형으로 되돌아와 증식 능력을 얻을 수 있습니다. 이 세포로 탈분화 지방 (DFAT) 세포라고합니다. DFAT 세포의 multilineage 분화 잠재력을 평가 하였다. 분석 및 유전자 발현 분석 DFAT 세포의 ASC ^(6)에 비해 매우 균일 한 것으로 확인 유동 세포 계측법. 사실, DFAT 세포의 세포 표면 항원 프로파일의 ASC ^6에있는 것과 매우 유사하다. 따라서, DFAT 세포는 중간 엽 줄기 세포와 유사하게 기능 할 수있다.

성공적으로 20 % 송아지 혈청으로 보충 ^7-8 DMEM F12 세포 배양 배지를 이용 DFAT 세포가 생성되고 다른 그룹. 우리는 10 %의 FBS로 보충 된 세포 배양 용 배지를 사용 DFAT 셀을 제조하려고했지만,이 프로토콜 DFAT 생산 세포의 수는 w보다 상당히 낮았다편 20 % FBS (데이터 미도시)로 보충. 따라서, FBS 농도 및 / 또는 그 내용 DFAT 세포의 탈분화 및 / 또는 DFAT 세포 증식 중 중요하다. 미래 연구의 일환으로, 우리는 더 혈청 내용이 DFAT 세포의 생성 및 증식을 지배하는 메커니즘을 규명하려고 시도합니다. 한편, DCM은 DMEM 우리의 연구에 사용 된 것보다 적은 포도당, 지방산과 다른 화학 물질이 포함되어 있습니다. 세포 배양에서의 이러한 변동은 중간 성분이 DFAT 세포 생성과 성장 모두의 효율을 변조 할 수도있다. 사실, 낮은 혈당 농도가 약간 DMEM을 사용 DFAT 전지 발전의 효율을 향상시킨다 (데이터는 보이지 않음). DFAT 세포의 생성 및 성장에 DCM의 효과의 기초가되는 정확한 메카니즘은 알려져 있지 않지만, 우리는 특정 배지 성분의 농도는이 셀룰러 이벤트가 발생한 것으로 가정하고 여기. 또한 연구는이 점을 명확히하기 위해 필요하다. 또한, 우리는 매우 제한 테스트 이후DMEM 제형 D 번호, 상기 실험 DFAT 세포를 생산하는 다른 DMEM 변화 (예를 들어, DMEM 함유 L 글루타민 또는 피리독신)의 효율성을 비교하기 위해 요구된다.

우리 DFAT 세포를 생산할 수 있지만, DFAT 세포 생성을 관리하는 분자 메커니즘은 아직 명확하지 않다. 비슷한 질문 만능 줄기 세포 ^(11)의 생산을 둘러싸고 있습니다. 이러한 치료 양식의 이러한 임상 사용으로 셀 상태 규제 메커니즘의 추가 탐사가 필요합니다. 따라서, 우리는 강하게 세포, 줄기 세포와 같은 상태로 외부 유전자 transductions 무료 반환 방법 DFAT 세포가 해명에 대한 모델을 제공하고 있다고 생각합니다. DFAT 전지 생산 프로토콜은 그러므로 가능한 미래의 임상 시험에서 사용하기 위해 현재 최적화된다.

모두 정상적으로 수행되는지 콜라게나 제 처리 및 지방 세포의 분리를 보장하는 것은 성공적 프로토콜을 사용 DFAT 세포 생성에 중요한 요소이다. Appr배양 중 위 및 미세 기포의 제거 opriate DFAT 사용은 또한 세포 증식을 강화하는데 도움.

The authors have nothing to disclose.

This research was supported in part by Program for Creating Start-ups from Advanced Research and Technology (START Program) from the Japan Society for the Promotion of Science (ST261006IP, TM) and by Program for the Strategic Research Foundation at Private Universities (2014-2019) (S1411018, TM) from the Ministry of Education, Sports, Science and Technology.