Un método eficaz para obtener células de grasa Dediferenciado

We have modified the conditions for DFAT cell generation and provide herein information regarding the use of an improved growth medium for the production of these cells.

La ingeniería de tejidos y terapia celular son muy prometedores clínicamente. En este sentido, las células multipotentes, tales como las células madre mesenquimales (MSC), se pueden utilizar terapéuticamente, en un futuro próximo, para restaurar la función de órganos dañados. Sin embargo, varios problemas técnicos, incluido el procedimiento altamente invasiva de aislar las MSC y la ineficiencia que rodea su amplificación, actualmente obstaculizan el potencial uso clínico de estas modalidades terapéuticas. En este documento, presentamos un método altamente eficiente para la generación de las células de grasa indiferenciadas (DFAT), células MSC-como. Curiosamente, las células DFAT pueden diferenciarse en varios tipos de células incluyendo adipogénica, osteogénica, y las células condrogénicas. Aunque otros grupos previamente han presentado varios métodos para generar células DFAT de tejido adiposo maduro, nuestro método nos permite producir células DFAT de manera más eficiente. En este sentido, se demuestra que el medio de cultivo DFAT (DCM), suplementado con 20% de SFB,es más eficaz en la generación de células que DFAT DMEM, suplementado con 20% FBS. Además, las células DFAT producidas por nuestro método de cultivo celular se pueden re-diferenciada en varios tipos de tejidos. Como tal, se presenta un modelo muy interesante y útil para el estudio de la desdiferenciación tisular.

La terapia celular e ingeniería de tejidos son temas de actualidad en el campo de la medicina regenerativa ^1-5. Si bien estas modalidades terapéuticas son muy prometedores, varias cuestiones técnicas actualmente obstaculizan su uso clínico. En este sentido, como en la generación de células iPS, todas las terapias de ingeniería de tejidos deben producir células libres de transducción de genes externos con el fin de mantener la seguridad del paciente. De acuerdo con ello, fuimos el primer grupo para producir con éxito células humanas DFAT ^6. Ya que varios otros grupos de investigación han adoptado este método para generar células de origen mamífero DFAT ^7-9, destacando aún más la utilidad de nuestro modelo.

En el transcurso de varios estudios, se ha encontrado que la calidad del medio ambiente de cultivo de células se puede modificar ajustando el contenido del medio celular. Este hallazgo ha llevado a un aumento en la tasa de éxito de la producción de células DFAT y una mejor calidad de células; ambos factores críticos engenerar de manera eficiente las células para ensayos clínicos futuros. A este respecto, un medio de cultivo DFAT mejorada (DCM, un medio similar a mesenquimales medio celular, que contiene insulina recombinante humana, albúmina de suero, el ácido L-glutámico, varios ácidos grasos y colesterol madre) y un método para la generación de células DFAT y la proliferación fue desarrollado (más información sobre el contenido de DCM está disponible bajo petición). El uso de células de alta calidad DFAT este método se han generado con la capacidad de diferenciarse en varios tipos de células incluyendo adipogénica, osteogénica, y las células condrogénicas. En total, este protocolo de cultivo de células validado mejora la calidad de las células DFAT y puede ser muy útil para mejorar las aplicaciones clínicas de la terapia celular y la ingeniería de tejidos.

Las muestras de tejido adiposo subcutáneo humano se obtuvieron de pacientes sometidos a cirugía en los Departamentos de Cirugía Plástica, Urología, Cirugía Pediátrica y Cirugía Ortopédica del Hospital de la Universidad de Nihon Itabashi (Tokio, Japón). Los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito, y el Comité de Ética de la Facultad de Medicina de la Universidad de Nihon aprobó el estudio.

1. Preparación del tejido

1. Llevar la muestra de tejido de la sala de operaciones para el laboratorio.
2. Lavar 1-2 g de tejido adiposo con 5 ml de PBS (-) a temperatura ambiente (TA) una vez, en un tubo de 50 ml y luego se coloca la muestra en un plato de plástico de 10 cm.

2. La colagenasa digestión

1. Retirar la muestra de la PBS (-), a continuación, añadir 10 ml de estéril 0,1% (w / v) solución de colagenasa (colagenasa tipo II) para el plato que contiene la muestra de tejido.
2. Picar el tejido con tijeras quirúrgicas durante aproximadamente 15 min, hasta que alcanza un puré consisterencia.
3. Posteriormente, digerir el tejido picado en el 0,1% (w / v) de solución de colagenasa a 37 ° C durante 30 min (60 rpm) en un tubo de 50 ml con agitación suave en un agitador.
4. Se filtra la muestra digerida a través de un filtro de 100 micras en un tubo de 50 ml. A continuación, pasar 10 ml de DCM (véase la Tabla de Materiales) suplementado con 2% de FBS a través del filtro.

3. El aislamiento de la célula

1. Centrifugar las células filtradas a 100 xg durante 1 min a TA.
2. En este punto, preparar 5 ml de DCM suplementado con 2% de FBS en un tubo de 50 ml.
3. A continuación, la elaboración de las células grasas flotantes utilizando una pipeta 1.000 l y añadir las células a un medio que contiene 50 ml tubo.
4. Posteriormente, agitar el tubo de 50 ml suavemente para mezclar el medio DCM con las células.
5. A continuación, se centrifuga el tubo a 100 xg durante 1 min a TA.
6. Descartar el medio en la parte inferior del tubo con una aguja de 18 G y una jeringa de 20 ml.
7. A continuación, añadir 10 ml de DCM supplemented con 2% de FBS a las células recogidas.
8. Mezclar el DCM con las células agitando el tubo 50 ml suavemente.
9. Centrifugar el tubo a 100 xg durante 1 min a TA.

4. Las células Plating

1. Añadir 41 ml de DCM o DMEM suplementado con 20% de FBS a un matraz de 12,5 cm.
2. A continuación, utilizando una pipeta de 200 l Añadir 40 l de células de grasa al matraz.
3. A continuación, llenar el matraz con DCM o DMEM suplementado con 20% FBS. Paso crítico: En este punto, asegúrese de que las células se extienden por todo el medio. comprobar visualmente las células desprendidas y después mantener el frasco en la tapa de una caja de Petri redonda para mantenerla plana.
4. Por último, colocar el frasco dentro de la incubadora y se deja inalterado en un incubador de _CO2 al 5% a 37 ° C durante 7 días.
5. Después de una semana de incubación, invierta el frasco y verificar si hay células DFAT. A continuación, evaluar DFAT la generación de células competencia tal como está descrito ¹⁰ ya que en este punto fibroblcélulas AST-como (células DFAT) se encuentran en regiones distintas de las células grasas.
6. Añadir 5 ml de DCM o DMEM suplementado con 20% FBS al matraz después de la eliminación del medio de cultivo celular anterior. Permitir que las células crezcan DFAT por otra semana después de cambiar el medio.
7. El uso de un contador de células, contar el número de células DFAT generados en diversas condiciones de cultivo de células (DCM vs. DMEM).

En este estudio, el método y el kit de herramientas para la generación de células DFAT se mejoró (Figura 1). Nuestro método nos permite generar células DFAT utilizando tanto DCM y medio DMEM que contenía FBS al 20% (Figura 2). Como tal, se comparó la eficacia de DCM y DMEM en la generación de células DFAT. En este sentido, DCM mejora la proliferación de células DFAT por tres veces en comparación con DMEM, sin importar el número de adipocitos (Figura 2A y B). El uso de 20% de FBS también mejora el crecimiento celular en comparación con los protocolos utilizando 10% de FBS (datos no mostrados). Además, confirmó que las células DFAT producidos utilizando DCM tienen la capacidad de redifferentiate en adipocitos y diferenciarse en osteoblastos (Figura 3). El método para los ensayos se describe en nuestro estudio anterior ^6.

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Figura 1:. Un diagrama esquemático que representa el aislamiento, la desdiferenciación, y la cultura de los adipocitos maduros Un pequeño trozo de tejido adiposo se digirió con colagenasa al 0,1%. Después de la centrifugación, los adipocitos uniloculares fueron aisladas de la capa flotante. Las células aisladas se cultivaron en frascos llenos de medio que contiene 20% de FBS durante 7 días. Durante el cultivo, las células unidas y aplanadas a la superficie superior de los matraces y después se convirtieron en células DFAT. A continuación, los frascos se invirtieron y las células se cultivaron DFAT usando métodos convencionales. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: DCM aumenta la generación de células DFAT. ( A) colonias de células DFAT siguientes 14 días de cultivo en DMEM o DCM. Barra de escala = 200 micras cuantificación (B) la proliferación celular DFAT en DMEM o DCM (media ± SD, n = 3). Se comparó la eficiencia de DCM y DMEM en la generación de células DFAT. mayor proliferación celular se observa con el uso de DCM. Se cuantificó la proliferación de células DFAT utilizando un contador de células, según las instrucciones del fabricante. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3:. Potencial multilinaje de células DFAT células DFAT humanos generados usando DCM se cultivaron durante 3 semanas en los medios de inducción adecuados para evaluar las capacidades de re-diferenciación y diferenciación de las células DFAT. La Cells se analizaron para osteogénico (ALP y rojo de alizarina S), adipogénico (aceite rojo-O) de capacidad. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Adipocitos maduros que se someten en desdiferenciación vitro, un proceso conocido como la cultura de techo, pueden revertir a un fenotipo más primitivo y obtener capacidades proliferativas. Estas células se denominan células de grasa como dediferenciado (DFAT). Se evaluó el potencial de diferenciación multilinaje de células DFAT. Citometría de flujo análisis y análisis de expresión génica reveló que las células DFAT eran muy homogénea en comparación con ASC ^6. De hecho, el perfil del antígeno de la superficie celular de las células DFAT es muy similar a los encontrados en ASCs ^6. De acuerdo con ello, las células DFAT pueden funcionar de manera similar a las MSC.

El otro grupo que ha generado con éxito células DFAT utilizó un medio DMEM cultivo de células F12 suplementado con 20% de suero de ternera ^7-8. Aunque se intentó producir células DFAT utilizando un medio de cultivo celular suplementado con 10% de FBS, el número de células DFAT producidos con este protocolo fue significativamente menor que wgallina suplementado con 20% FBS (datos no mostrados). Por lo tanto, la concentración de FBS y / o su contenido es importante, ya sea para la desdiferenciación de las células DFAT y / o proliferación de células DFAT. Como parte de un estudio en el futuro, vamos a tratar de dilucidar el mecanismo por el cual el contenido de suero gobierna la generación de células DFAT y proliferación. Por otro lado, DCM contiene menos glucosa, ácidos grasos y otros productos químicos que el DMEM utilizado en nuestro estudio. Esta variabilidad en el cultivo celular los componentes del medio puede modular la eficacia de tanto la generación de células DFAT y el crecimiento. De hecho, la concentración baja de glucosa mejora ligeramente la eficiencia de la generación de células DFAT utilizando DMEM (datos no mostrados). Aunque los mecanismos precisos subyacentes efecto de DCM en la generación de células DFAT y el crecimiento son desconocidos, postulamos aquí que la concentración de ciertos componentes del medio conduce estos eventos celulares. Se necesitan más estudios para aclarar este punto. Por otra parte, ya que hemos probado un limited número de formulaciones DMEM, se requieren más experimentos para comparar la eficacia de otras variaciones DMEM (por ejemplo, DMEM que contenía L-glutamina o piridoxina) en la producción de células DFAT.

A pesar de que somos capaces de producir células DFAT, los mecanismos moleculares que regulan la generación de células DFAT todavía no está claro. Preguntas similares rodean la producción de células iPS ^11. Como tal uso clínico de estas modalidades terapéuticas requerirá una mayor exploración de los mecanismos de regulación del estado celular. De acuerdo con ello, estamos convencidos de que las células DFAT proporcionan un modelo para dilucidar cómo las células vuelven a un estado de células madre similares, libre de transducción de genes externos. protocolos de producción de células DFAT son, por lo tanto, están optimizando actualmente para su uso en ensayos clínicos futuros.

Asegurar que el tratamiento con colagenasa y la grasa de aislamiento de células son a la vez realizada correctamente es un factor clave en la generación con éxito células DFAT que utilizan este protocolo. apropriate uso de tijeras finas y eliminación de las burbujas durante el cultivo también ayuda en la mejora de la proliferación celular DFAT.

The authors have nothing to disclose.

This research was supported in part by Program for Creating Start-ups from Advanced Research and Technology (START Program) from the Japan Society for the Promotion of Science (ST261006IP, TM) and by Program for the Strategic Research Foundation at Private Universities (2014-2019) (S1411018, TM) from the Ministry of Education, Sports, Science and Technology.