Un metodo efficiente per ottenere cellule di grasso dedifferenziato

We have modified the conditions for DFAT cell generation and provide herein information regarding the use of an improved growth medium for the production of these cells.

L'ingegneria dei tessuti e terapia cellulare molto promettenti clinicamente. A questo proposito, cellule multipotenti, come le cellule staminali mesenchimali (MSC), possono essere utilizzati terapeuticamente, nel prossimo futuro, per ripristinare la funzione di organi danneggiati. Tuttavia, diversi problemi tecnici, compresa la procedura altamente invasiva di isolare cellule staminali mesenchimali e l'inefficienza che circonda il loro amplificazione, attualmente ostacolano il potenziale utilizzo clinico di queste modalità terapeutiche. Qui, si introduce un metodo molto efficiente per la generazione di cellule adipose dedifferenziate (DFAT), cellule MSC simili. È interessante notare che le cellule DFAT possono essere differenziate in diversi tipi di cellule, tra cui adipogenico, osteogenico, e le cellule condrogeniche. Anche se altri gruppi hanno precedentemente presentato vari metodi per la generazione di cellule DFAT dal tessuto adiposo maturo, il nostro metodo ci permette di produrre cellule DFAT in modo più efficiente. A questo proposito, abbiamo dimostrato che terreno di coltura DFAT (DCM), integrato con il 20% FBS,è più efficace nel generare cellule DFAT di DMEM, integrati con il 20% FBS. Inoltre, le cellule DFAT prodotte dal nostro metodo di coltura cellulare può essere redifferentiated in diversi tipi di tessuto. Come tale, un modello molto interessante e utile per lo studio di dedifferentiation tessuto è presentato.

Terapia cellulare e ingegneria dei tessuti sono temi caldi nel campo della medicina rigenerativa ^1-5. Mentre queste modalità terapeutiche molto promettenti, diversi problemi tecnici attualmente ostacolano il loro uso clinico. A questo proposito, come nella generazione di cellule iPS, tutte le terapie ingegneria tissutale devono produrre celle libere di trasduzione del gene esterni al fine di mantenere la sicurezza del paziente. Di conseguenza, siamo stati il primo gruppo a produrre con successo cellule umane DFAT ^6. Molti altri gruppi di ricerca hanno poi adottato il nostro metodo per generare cellule DFAT di origine mammiferi ^7-9, evidenziando ulteriormente l'utilità del nostro modello.

Nel corso di diversi studi, abbiamo trovato che la qualità dell'ambiente coltura cellulare può essere modificato regolando il contenuto del mezzo cellulare. Questa scoperta ha portato ad un aumento del tasso di successo della produzione di celle DFAT e migliore qualità delle cellule; entrambi i fattori criticigenerando in modo efficiente le cellule per i futuri studi clinici. A questo proposito, una migliore mezzo di coltura DFAT (DCM, un fluido simile al mesenchimali staminali medio cellule, che contiene insulina umana ricombinante, albumina sierica, acido L-glutammico, diversi acidi grassi e colesterolo) e un metodo per la generazione di cellule DFAT e la proliferazione è stato sviluppato (ulteriori informazioni sul contenuto di DCM è disponibile su richiesta). Utilizzando cellule di alta qualità DFAT questo metodo sono stati generati con la capacità di differenziarsi in diversi tipi di cellule, tra cui adipogenico, osteogenico, e le cellule condrogeniche. Complessivamente, questo convalidata protocollo coltura cellulare migliora la qualità delle cellule DFAT e può essere molto utile per migliorare applicazioni cliniche di terapia cellulare e ingegneria tessutale.

I campioni di grasso sottocutaneo umano sono stati ottenuti da pazienti sottoposti a chirurgia nei dipartimenti di Chirurgia Plastica, Urologia, Chirurgia Pediatrica e Chirurgia Ortopedica dell'Ospedale Nihon dell'Università Itabashi (Tokyo, Giappone). I pazienti hanno dato consenso informato scritto, e il Comitato Etico della Nihon University School of Medicine ha approvato lo studio.

1. Preparazione del tessuto

1. Portare il campione di tessuto dalla sala operatoria al laboratorio.
2. Lavare 1-2 g di tessuto adiposo con 5 ml di PBS (-) a temperatura ambiente (RT), una volta, in un tubo da 50 ml e quindi posizionare il campione in un piatto di plastica 10 cm.

2. Collagenasi Digestione

1. Rimuovere il campione dalla PBS (-), poi aggiungere 10 ml di soluzione sterile 0,1% (w / v) soluzione di collagenasi (collagenasi di tipo II) del recipiente contenente il campione di tessuto.
2. Macinare il tessuto con le forbici chirurgiche per circa 15 min, fino a raggiungere un composto frullatarenza.
3. Successivamente, digerire il tessuto tritato nel 0,1% (w / v) di collagenasi a 37 ° C per 30 min (60 rpm) in un tubo da 50 ml con leggera agitazione su un agitatore.
4. Filtrare il campione digerito attraverso un filtro 100 micron in un tubo da 50 ml. Avanti, passare 10 ml di DCM (vedi Tabella dei Materiali) integrato con il 2% FBS attraverso il filtro.

Isolamento 3. cellulare

1. Centrifugare le cellule filtrate a 100 xg per 1 min a RT.
2. A questo punto, preparare 5 ml di DCM integrato con il 2% FBS in un tubo da 50 ml.
3. Successivamente, elaborare le cellule di grasso galleggianti utilizzando una pipetta ml 1.000 e aggiungere le cellule di un terreno contenente 50 ml di tubo.
4. Successivamente, scuotere il tubo da 50 ml delicatamente per miscelare il medium DCM con le cellule.
5. Poi, centrifugare la provetta a 100 xg per 1 min a RT.
6. Eliminare il mezzo sul fondo del tubo con un ago 18 G e una siringa da 20 ml.
7. Successivamente, aggiungere 10 ml di DCM supplemented con 2% FBS alle cellule raccolte.
8. Mescolare il DCM con le cellule agitando il tubo da 50 ml con delicatezza.
9. Centrifugare la provetta a 100 xg per 1 min a RT.

4. Cellule placcatura

1. Aggiungere 41 ml di DCM o DMEM supplementato con 20% FBS in un pallone 12,5 centimetri.
2. Successivamente, utilizzando una pipetta 200 ml aggiungere 40 ml di cellule di grasso al pallone.
3. Poi, riempire il pallone con DCM o DMEM supplementato con il 20% FBS. PUNTO CRITICO: A questo punto, in modo che le cellule sono diffuse in tutto il mezzo. Controllare visivamente le cellule staccate e poi tenere il pallone sul coperchio di una capsula di Petri giro per mantenerla piatta.
4. Infine, il recipiente all'interno dell'incubatrice e lasciato indisturbato in un incubatore CO ₂ 5% a 37 ° C per 7 giorni.
5. Dopo una settimana di incubazione, invertire il pallone e verificare la presenza di cellule DFAT. Successivamente, valutare DFAT generazione delle cellule di competenza, come descritto da ¹⁰ a questo punto fibroblcellule AST-simile (cellule DFAT) si trovano in regioni distinte dalle cellule grasse.
6. Aggiungere 5 ml di DCM o DMEM supplementato con il 20% FBS al pallone dopo la rimozione del precedente mezzo di coltura cellulare. Permettono alle cellule di crescere DFAT per un'altra settimana dopo aver cambiato il mezzo.
7. Utilizzando un contatore di cellule, contare il numero di cellule DFAT ottenuti in diverse condizioni di coltura cellulare (DCM vs. DMEM).

In questo studio, il metodo e il kit di strumenti per la generazione di cellule DFAT stata migliorata (Figura 1). Il nostro metodo permette di generare cellule DFAT utilizzando sia DCM e medie DMEM contenente 20% FBS (Figura 2A). Come tale, abbiamo confrontato l'efficienza di DCM e DMEM nella generazione di cellule DFAT. A questo proposito, DCM migliorata proliferazione cellulare DFAT di tre volte rispetto ai DMEM, indipendentemente dal numero di adipociti (Figura 2A e B). Utilizzando 20% FBS migliora anche la crescita cellulare rispetto a protocolli utilizzando 10% FBS (dati non mostrati). Abbiamo ulteriormente confermato che le cellule DFAT prodotte utilizzando DCM hanno la capacità di ridifferenziare in adipociti e differenziarsi in osteoblasti (Figura 3). Il metodo per la metodica è descritto nel nostro precedente studio ^6.

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Figura 1:. Uno schema che descrive l'isolamento, la de-differenziazione, e la cultura di adipociti maturi Un piccolo pezzo di tessuto adiposo è stato digerito con collagenasi 0,1%. Dopo centrifugazione, adipociti uniloculari stati isolati dal livello fluttuante. Le cellule isolate sono state coltivate in fiaschi riempiti con il liquido contenente 20% FBS per 7 giorni. Durante coltura, le cellule attaccate e appiattite alla superficie superiore dei flaconi e poi sono stati convertiti in cellule DFAT. Successivamente, i palloni sono stati invertiti e le cellule DFAT sono state coltivate con metodi convenzionali. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2: DCM migliora la generazione di cellule DFAT. ( A) colonie di cellule DFAT successivi 14 giorni di coltura in DMEM o DCM. Scala bar = 200 micron (B) proliferazione cellulare DFAT quantificazione sia in DMEM o DCM (media ± SD, n = 3). L'efficienza di DCM e DMEM nel generare cellule DFAT stato confrontato. la proliferazione delle cellule avanzato si osserva con l'utilizzo di DCM. Abbiamo quantificato la proliferazione delle cellule DFAT con un contatore di cellule, come da istruzioni del produttore. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3:. Potenziale multilineare delle cellule DFAT cellule DFAT umane generate utilizzando DCM sono state coltivate per 3 settimane nei media induzione necessarie per valutare le ridifferenziazione e differenziazione delle cellule capacità DFAT. la cells sono stati analizzati per osteogenico (ALP e alizarin rosso S), adipogenico (olio rosso-O) Capacità. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Adipociti maturi che subiscono in vitro de-differenziazione, un processo noto come la cultura del soffitto, può tornare ad un fenotipo più primitivo e acquisire capacità proliferative. Queste cellule sono indicati come le cellule di grasso dedifferenziato (DFAT). Il potenziale di differenziazione multilineare delle cellule DFAT è stata valutata. Citometria a flusso di analisi e analisi di espressione genica hanno rivelato che le cellule DFAT erano altamente omogenea rispetto ai ASC ^6. Infatti il profilo antigene di superficie cellulare delle cellule DFAT è molto simile a quelli trovati in ASCs ^6. Di conseguenza, le cellule DFAT possono funzionare in modo simile a MSC.

L'altro gruppo che ha generato successo cellule DFAT utilizzato un mezzo di coltura cellulare DMEM F12 supplementato con 20% siero di vitello ^7-8. Anche se abbiamo tentato di produrre cellule DFAT utilizzando un mezzo di coltura cellulare supplementato con 10% FBS, il numero di cellule DFAT prodotti con questo protocollo era significativamente inferiore wgallina integrato con 20% FBS (dati non mostrati). Pertanto, la concentrazione FBS e / o del suo contenuto è importante sia per dedifferentiation di cellule DFAT e / o la proliferazione di cellule DFAT. Come parte di un futuro studio, si cercherà di chiarire ulteriormente il meccanismo con cui il contenuto di siero determina la generazione di cellule DFAT e la proliferazione. D'altra parte, DCM contiene meno glucosio, acidi grassi e altre sostanze chimiche che il DMEM utilizzato nel nostro studio. Questa variabilità nelle cellule in coltura costituenti medie può modulare l'efficienza sia la generazione di cellule DFAT e la crescita. Infatti, bassa concentrazione di glucosio migliora leggermente l'efficienza della produzione di cellule DFAT utilizzando DMEM (dati non mostrati). Anche se i precisi meccanismi sottostanti effetto di DCM sulla generazione delle cellule DFAT e la crescita sono sconosciuti, postuliamo qui che la concentrazione di taluni componenti medie spinge questi eventi cellulari. Ulteriori studi sono necessari per chiarire questo punto. Inoltre, dal momento che abbiamo testato un limited numero di formulazioni DMEM, ulteriori esperimenti sono tenuti a confrontare l'efficienza di altre variazioni DMEM (ad esempio, DMEM contenente L-glutammina o piridossina) nella produzione di celle DFAT.

Anche se siamo in grado di produrre le cellule DFAT, i meccanismi molecolari che regolano la generazione di cellule DFAT è ancora chiaro. Domande simili circondano la produzione di cellule iPS ^11. Come tale utilizzo clinico di queste modalità terapeutiche richiederà un ulteriore approfondimento dei meccanismi di regolazione dello stato delle cellule. Di conseguenza, crediamo fermamente che le cellule DFAT forniscono un modello per chiarire come le cellule tornano ad uno stato di cellule staminali simil-, privo di trasduzione genica esterni. protocolli di produzione delle cellule DFAT sono quindi, in corso di ottimizzazione attualmente per l'utilizzo in futuri studi clinici.

Garantire che il trattamento collagenasi e grasso isolamento delle cellule sono entrambi eseguiti correttamente è un fattore chiave nel generare con successo le cellule DFAT che utilizzano questo protocollo. appruso opriate di forbici sottili e la rimozione delle bolle durante la coltura anche un aiuto nel migliorare la proliferazione delle cellule DFAT.

The authors have nothing to disclose.

This research was supported in part by Program for Creating Start-ups from Advanced Research and Technology (START Program) from the Japan Society for the Promotion of Science (ST261006IP, TM) and by Program for the Strategic Research Foundation at Private Universities (2014-2019) (S1411018, TM) from the Ministry of Education, Sports, Science and Technology.