وسيلة فعالة للحصول على خلايا Dedifferentiated الدهون

We have modified the conditions for DFAT cell generation and provide herein information regarding the use of an improved growth medium for the production of these cells.

هندسة الأنسجة والعلاج بالخلايا على وعود كبيرة سريريا. في هذا الصدد، وخلايا متعددة القدرات، مثل الخلايا الجذعية الوسيطة (اللجان الدائمة)، ويمكن استخدام العلاجي، في المستقبل القريب، لاستعادة وظيفة لأعضاء تالفة. ومع ذلك، العديد من القضايا الفنية، بما في ذلك إجراء الغازية للغاية من عزل اللجان الدائمة وعدم الكفاءة المحيطة التضخيم، وتعيق حاليا استخدام السريرية المحتملة لهذه الطرائق العلاجية. هنا، ونحن نقدم طريقة فعالة للغاية لتوليد الخلايا الدهنية dedifferentiated (DFAT)، وخلايا لجنة السلامة البحرية الشبيهة. ومن المثير للاهتمام، وخلايا DFAT يمكن التفريق إلى عدة أنواع الخلايا بما في ذلك مكون الشحم، عظمية، والخلايا المولدة للغضروف. على الرغم من أن مجموعات أخرى قد قدمت سابقا أساليب مختلفة لتوليد خلايا DFAT من الأنسجة الدهنية ناضجة، يسمح لدينا وسيلة لنا لإنتاج خلايا DFAT أكثر كفاءة. وفي هذا الصدد، علينا أن نبرهن على ثقافة DFAT المتوسطة (DCM)، تستكمل مع 20٪ FBS،هو أكثر فعالية في توليد خلايا DFAT من DMEM، على أن تستكمل مع FBS 20٪. بالإضافة إلى ذلك، فإن الخلايا DFAT التي تنتجها طريقة لدينا ثقافة الخلية يمكن redifferentiated إلى عدة أنواع الأنسجة. على هذا النحو، وقدم نموذجا مثيرة جدا للاهتمام ومفيدة للدراسة فقد التمايز الأنسجة.

العلاج بالخلايا وهندسة الأنسجة هي المواضيع الساخنة في مجال الطب التجديدي ^1-5. في حين أن هذه الطرائق العلاجية على وعود كبيرة، العديد من القضايا الفنية تعرقل حاليا استخدام السريري. في هذا الصدد، كما هو الحال في توليد خلايا الجذع، يجب على جميع العلاجات هندسة الأنسجة تنتج خلايا خالية من transductions الجين الخارجية من أجل الحفاظ على سلامة المرضى. وفقا لذلك، كنا المجموعة الأولى لإنتاج خلايا DFAT الإنسان ⁶ بنجاح. وقد تبنت عدة مجموعات بحثية أخرى منذ أسلوبنا على توليد خلايا DFAT من أصل الثدييات ^7-9، إلقاء مزيد من الضوء على فائدة نموذجنا.

على مدى العديد من الدراسات، وجدنا أن نوعية البيئة زراعة الخلايا يمكن تعديلها عن طريق ضبط محتوى المتوسطة الخلية. وقد أدى هذا الاكتشاف إلى زيادة في معدل النجاح من إنتاج خلايا DFAT وتحسنت نوعية الخلية؛ كل من العوامل الحاسمة فيتوليد كفاءة الخلايا للتجارب السريرية في المستقبل. في هذا الصدد، وتحسين DFAT الثقافة المتوسطة (DCM، وسيلة مماثلة لالجذعية الوسيطة المتوسطة الخلية، والتي تحتوي على الانسولين المؤتلف البشري، الزلال في الدم، وحمض-L الجلوتاميك، والعديد من الأحماض الدهنية، والكولسترول) وطريقة لتوليد الخلايا DFAT و وقد وضعت انتشار (للمزيد من المعلومات عن محتويات DCM متاحة عند الطلب). تم إنشاء استخدام هذا الأسلوب جودة عالية خلايا DFAT مع القدرة على التمايز إلى عدة أنواع الخلايا بما في ذلك مكون الشحم، عظمية، والخلايا المولدة للغضروف. وإجمالا، هذا البروتوكول زراعة الخلايا التحقق من صحة يحسن نوعية الخلايا DFAT وقد تكون مفيدة للغاية لتعزيز التطبيقات السريرية لعلاج الخلايا وهندسة الأنسجة.

وقد تم الحصول على عينات من الدهون تحت الجلد البشري من المرضى الذين يخضعون لجراحة في أقسام جراحة التجميل، جراحة المسالك البولية، جراحة الأطفال وجراحة العظام في مستشفى إيتاباشي جامعة نيهون (طوكيو، اليابان). المرضى أعطى موافقة خطية مطلعة، وافقت لجنة الأخلاقيات من جامعة نيهون كلية الطب الدراسة.

1. نسيج التحضير

1. جلب عينات الأنسجة من غرفة العمليات إلى المختبر.
2. غسل 1-2 غرام من الأنسجة الدهنية مع 5 مل من برنامج تلفزيوني (-) في درجة حرارة الغرفة (RT) مرة واحدة، في أنبوب 50 مل ثم وضع العينة في طبق من البلاستيك 10 سم.

2. كولاجيناز الهضم

1. إزالة عينة من برنامج تلفزيوني (-)، ثم إضافة 10 مل من معقم 0.1٪ (ث / ت) حل كولاجيناز (كولاجيناز النوع الثاني) إلى الطبق الذي يحتوي على عينة الأنسجة.
2. اللحم المفروم مع النسيج المقص الجراحي لحوالي 15 دقيقة، حتى تصل إلى المهروس تتألفency.
3. وفي وقت لاحق، هضم الأنسجة المفروم في 0.1٪ (ث / ت) حل كولاجيناز عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة (60 دورة في الدقيقة) في أنبوب 50 مل مع الإثارة لطيف على شاكر.
4. تصفية العينة هضمها من خلال مرشح 100 ميكرومتر في أنبوب 50 مل. بعد ذلك، تمرير 10 مل من DCM (انظر الجدول المواد) تستكمل مع 2٪ FBS من خلال مرشح.

عزل 3. خلية

1. الطرد المركزي الخلايا التي تمت تصفيتها في 100 x ج لمدة 1 دقيقة في RT.
2. في هذه المرحلة، وإعداد 5 مل من DCM تستكمل مع 2٪ FBS في أنبوب 50 مل.
3. بعد ذلك، وضع الخلايا الدهنية العائمة باستخدام ماصة ميكرولتر 1000 وإضافة الخلايا إلى 50 مل أنبوب يحتوي المتوسطة.
4. وفي وقت لاحق، هز أنبوب 50 مل بلطف لمزج المتوسطة DCM مع الخلايا.
5. ثم، الطرد المركزي الأنبوب في 100 x ج لمدة 1 دقيقة في RT.
6. تجاهل المتوسطة في الجزء السفلي من الأنبوب باستخدام 18 G إبرة وحقنة 20 مل.
7. المقبل، إضافة 10 مل من DCM الصورةupplemented مع 2٪ FBS إلى الخلايا التي تم جمعها.
8. خلط DCM مع الخلايا عن طريق هز أنبوب 50 مل بلطف.
9. أنبوب الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 1 دقيقة في RT.

4. خلايا التصفيحات

1. إضافة 41 مل من DCM أو DMEM تستكمل مع FBS 20٪ إلى 12.5 سم قارورة.
2. بعد ذلك، باستخدام ماصة 200 ميكرولتر إضافة 40 ميكرولتر من الخلايا الدهنية إلى القارورة.
3. ثم، تملأ القارورة مع DCM أو DMEM تستكمل مع FBS 20٪. خطوة حاسمة: عند هذه النقطة، وضمان أن الخلايا تنتشر في جميع أنحاء المتوسط. بصريا فحص خلايا منفصلة، ​​وبعد ذلك الحفاظ على قارورة على غطاء طبق بتري مستديرة للحفاظ على انها مسطحة.
4. وأخيرا، ضع قارورة داخل الحاضنة وترك الأمر دون عائق في 5٪ CO ₂ حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 7 أيام.
5. بعد أسبوع من الحضانة، عكس القارورة والتحقق من وجود خلايا DFAT. بعد ذلك، تقييم DFAT جيل خلية الكفاءة كما هو موضح ¹⁰ منذ في هذا fibrobl نقطةوتقع خلايا مثل AST (خلايا DFAT) في مناطق مختلفة من الخلايا الدهنية.
6. تستكمل إضافة 5 مل من DCM أو DMEM مع FBS 20٪ إلى قارورة بعد إزالة خلية ثقافة المتوسط ​​السابق. السماح للخلايا DFAT لتنمو لمدة أسبوع آخر بعد تغيير المتوسطة.
7. باستخدام عداد الخلية، وحساب عدد الخلايا DFAT ولدت في ظل ظروف مختلفة الثقافة الخلية (DCM مقابل DMEM).

في هذه الدراسة، تم تحسين طريقة وأدوات لتوليد الخلايا DFAT (الشكل 1). لدينا وسيلة تسمح لنا لتوليد خلايا DFAT باستخدام كل DCM والمتوسطة DMEM تحتوي على 20٪ FBS (الشكل 2A). على هذا النحو، قارنا كفاءة DCM وDMEM في توليد خلايا DFAT. في هذا الصدد، وتعزيز DCM خلية DFAT انتشار من قبل ثلاث مرات بالمقارنة مع DMEM، بغض النظر عن عدد الخلايا الشحمية (الشكل 2A وباء). باستخدام 20٪ أيضا يعزز FBS نمو الخلايا بالمقارنة مع البروتوكولات باستخدام 10٪ FBS (لا تظهر البيانات). أكدنا أيضا أن خلايا DFAT المنتجة باستخدام DCM لديها القدرة على redifferentiate في الخلايا الشحمية وتفرق في الخلايا بانية العظم (الشكل 3). وصفت طريقة لفحوصات في دراستنا السابقة ^6.

7 / 54177fig1.jpg "/>
تم هضمها التخطيطي تصور العزلة، فقد التمايز، والثقافة من الخلايا الشحمية ناضجة قطعة صغيرة من الأنسجة الدهنية بنسبة 0.1٪ كولاجيناز: الشكل 1. بعد الطرد المركزي، تم عزل الخلايا الشحمية وحيدة المسكن من طبقة العائمة. وكانت الخلايا المعزولة المستزرعة في قوارير مليئة المتوسطة التي تحتوي على 20٪ FBS لمدة 7 أيام. خلال الثقافة، والخلايا المرفقة وسوت إلى السطح العلوي للقوارير ومن ثم تم تحويلها إلى خلايا DFAT. بعد ذلك، تم مقلوب قوارير وكان المثقف خلايا DFAT استخدام الأساليب التقليدية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: • قرار مجلس الوزراء يعزز الجيل خلية DFAT. ( أ) مستعمرات الخلايا DFAT بعد 14 يوما من الثقافة في DMEM أو DCM. مقياس شريط = 200 ميكرون الكمي (ب) انتشار الخلايا DFAT في أي DMEM أو DCM (يعني ± SD، ن = 3). وتمت مقارنة كفاءة DCM وDMEM في توليد خلايا DFAT. لوحظ انتشار الخلايا المعززة مع استخدام DCM. نحن كميا انتشار الخلايا DFAT باستخدام عداد الخلية، حسب إرشادات الشركة المصنعة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

كانت Multilineage إمكانات خلايا DFAT خلايا DFAT الإنسان إنشاؤها باستخدام DCM تربيتها لمدة 3 أسابيع في وسائل الإعلام تحريض مناسبة لتقييم عودة التمايز والتفاضل قدرات خلايا DFAT: الرقم 3. جوقد تم تحليل ملتعلمي اللغة اإلنكليزية لالمكونة للعظم (ALP والأليزارين S الأحمر)، مكون الشحم (النفط الأحمر-O) القدرات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الخلايا الشحمية الناضجة التي تخضع لها فقد التمايز في المختبر، وهي عملية تعرف باسم الثقافة السقف، قد العودة إلى النمط الظاهري أكثر بدائية واكتساب قدرات التكاثري. ويشار إلى هذه الخلايا إلى خلايا الدهون كما dedifferentiated (DFAT). تم تقييم إمكانات multilineage تمايز الخلايا DFAT. التدفق الخلوي وكشف تحليل وتحليل التعبير الجيني أن الخلايا DFAT كانت متجانسة إلى حد كبير بالمقارنة مع مخولا لصيانة طائرات ^(6). في الواقع، والوضع مستضد على سطح الخلية من خلايا DFAT هي مشابهة جدا لتلك التي وجدت في مخولا لصيانة طائرات ^(6). وفقا لذلك، قد خلايا DFAT تعمل على نحو مماثل لاللجان الدائمة.

المجموعة الأخرى التي ولدت خلايا DFAT تستخدم وسيلة DMEM ثقافة الخلية F12 تستكمل مع 20٪ مصل العجل ^7-8 بنجاح. على الرغم من أننا محاولة لإنتاج خلايا DFAT باستخدام خلية ثقافة المتوسط ​​تستكمل مع FBS 10٪، وكان عدد الخلايا DFAT المنتجة مع هذا البروتوكول أقل بكثير من ثالدجاجة تستكمل مع 20٪ FBS (لا تظهر البيانات). ولذلك، فإن التركيز FBS و / أو محتوياته مهم لأي فقد التمايز للخلايا DFAT و / أو انتشار الخلايا DFAT. وكجزء من الدراسة في المستقبل، ونحن سوف محاولة لزيادة توضيح الآلية التي محتوى المصل يحكم الجيل خلية DFAT والانتشار. من ناحية أخرى، DCM يحتوي على أقل نسبة الجلوكوز والأحماض الدهنية والمواد الكيميائية الأخرى من DMEM المستخدمة في دراستنا. هذا التباين في زراعة الخلايا المكونة المتوسطة قد تعدل كفاءة كل جيل خلية DFAT والنمو. في الواقع، وتركيز الجلوكوز منخفض يحسن قليلا كفاءة توليد الخلايا DFAT عند استخدام DMEM (لا تظهر البيانات). على الرغم من أن الآليات الدقيقة الكامنة وراء التأثير DCM على توليد خلايا DFAT والنمو غير معروفة، ونحن نفترض هنا أن تركيز بعض المكونات المتوسطة يقود هذه الأحداث الخلوية. وهناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لتوضيح هذه النقطة. وعلاوة على ذلك، حيث أننا قد اختبرت يميتعدد د الصيغ DMEM، ويطلب المزيد من التجارب لمقارنة كفاءة الاختلافات DMEM أخرى (على سبيل المثال، DMEM تحتوي على L-الجلوتامين أو البيريدوكسين) في إنتاج خلايا DFAT.

على الرغم من أننا قادرون على إنتاج خلايا DFAT، الآليات الجزيئية التي تحكم الجيل خلية DFAT لا تزال غير واضحة. أسئلة مشابهة تحيط إنتاج خلايا الجذع ^11. كما مثل هذا الاستخدام السريري لهذه الطرائق العلاجية سوف تحتاج إلى مزيد من استكشاف الآليات التنظيمية دولة الخلية. وفقا لذلك، ونحن نعتقد بقوة أن الخلايا DFAT توفر نموذجا لتوضيح كيف تعود الخلايا إلى حالة تشبه الخلايا الجذعية، خالية من transductions الجين الخارجية. لذا DFAT بروتوكولات إنتاج خلايا هي، ويجري الأمثل حاليا للاستخدام في التجارب السريرية في المستقبل.

ضمان العلاج كولاجيناز والدهون زنزانة انفرادية كلاهما أدائها على الوجه الصحيح هو عامل أساسي في توليد خلايا DFAT باستخدام هذا البروتوكول بنجاح. Apprاستخدام opriate من مقص غرامة وإزالة فقاعات خلال ثقافة تساعد أيضا في تعزيز DFAT تكاثر الخلايا.

The authors have nothing to disclose.

This research was supported in part by Program for Creating Start-ups from Advanced Research and Technology (START Program) from the Japan Society for the Promotion of Science (ST261006IP, TM) and by Program for the Strategic Research Foundation at Private Universities (2014-2019) (S1411018, TM) from the Ministry of Education, Sports, Science and Technology.